早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織中HO-1、MCP-1的表達及復發(fā)性自然流產(chǎn)的危險因素分析

龔國忠,程家亮,張孝廉,劉友迎,王昌明

1.遂寧市第一人民醫(yī)院檢驗科,四川遂寧 629000;2.遂寧市中心醫(yī)院輸血科,四川遂寧 629000

自然流產(chǎn)是指在妊娠28周以前非人為目的導致的終止妊娠,在妊娠12周前發(fā)生SA稱為早期自然流產(chǎn)(ESA)。研究顯示,自然流產(chǎn)發(fā)生率為12%,其中80%以上為ESA[1],多表現(xiàn)為停經(jīng)一段時間后出現(xiàn)早孕反應,伴有陰道出血,輕微下腹疼痛。我國將3次及以上在妊娠28周前發(fā)生胎兒喪失定義為復發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)[2]。RSA病因復雜,除了目前臨床上已知的遺傳基因缺陷、內(nèi)分泌失調(diào)、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常、感染、生殖免疫等常見因素外,仍有部分患者流產(chǎn)原因未明[3]。相關(guān)研究顯示,RSA風險隨流產(chǎn)次數(shù)增加而升高,每流產(chǎn)一次,再次流產(chǎn)風險將增加11%左右,3次及以上流產(chǎn)可將再次流產(chǎn)風險增加至40%,RSA不僅會損害育齡女性的身心健康,還對其家庭造成較大影響[4],故探討RSA的危險因素以指導臨床干預對保障育齡女性的生育健康需求有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn),血紅素氧合酶-1(HO-1)可能在母胎界面水平影響RSA的發(fā)生[5];單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)具有趨化性,能夠激活體內(nèi)中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞的活性,產(chǎn)生大量細胞因子[6],也可能影響RSA的發(fā)生。鑒于此,本研究通過分析ESA患者絨毛組織中的HO-1、MCP-1表達情況,并探討RSA的危險因素,為臨床診療提供指導。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6月至2021年5月遂寧市第一人民醫(yī)院(以下簡稱本院)收治的164例ESA患者作為ESA組,另選取同期在本院行人工流產(chǎn)的164例正常妊娠孕婦作為對照組。納入標準:(1)ESA組均符合《婦產(chǎn)科學》[7]中對ESA的診斷標準,既往自然流產(chǎn)史≤1次;(2)對照組術(shù)前B超可見胚芽及胎心搏動,月經(jīng)規(guī)律,既往無流產(chǎn)史。排除標準:(1)因生殖細胞染色體異常、子宮發(fā)育異常、內(nèi)分泌異常、感染及自身免疫性疾病而導致的流產(chǎn)者;(2)伴心臟病、高血壓等內(nèi)外科疾病史者;(3)伴凝血功能異常者;(4)伴傳染性疾病者;(5)合并惡性腫瘤者;(6)因濫用藥物而導致流產(chǎn)者;(7)因腹部受到外因性的刺激和損害而致流產(chǎn)者;(8)放置宮內(nèi)節(jié)育器者。

ESA組年齡24～35歲,平均(28.52±3.16)歲,孕周5～12周,平均(7.68±1.82)周,體重指數(shù)(BMI)20～28 kg/m2,平均(23.92±3.51)kg/m2,既往有自然流產(chǎn)史75例;對照組年齡23～36歲,平均(27.90±3.43)歲,孕周6～12周,平均(8.24±1.36)周,BMI 21～28 kg/m2,平均(23.80±3.14)kg/m2。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(審批號:201805-004)。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集與處理 清宮術(shù)或人工流產(chǎn)術(shù)后,在無菌條件下,采集自然流產(chǎn)和正常妊娠女性的流產(chǎn)絨毛組織,洗凈血液后,放入冷凍管中,-80 ℃保存,用于石蠟切片制備。

1.2.2絨毛組織HO-1、MCP-1蛋白表達檢測 取絨毛組織石蠟切片。常規(guī)脫蠟入水,枸櫞酸鹽緩沖液熱抗原修復,山羊血清封閉液封閉后滴加一抗、二抗(生物素標記)、鏈霉卵白素(堿性磷酸酶標記)各50 μL,37 ℃孵育25 min;DAB顯色15 min,沖洗,復染,脫水,封片。相關(guān)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。根據(jù)染色強度記為0～3分,無染色為0分,棕黃色為3分;根據(jù)染色細胞陽性率記為0～4分,臨界值分別為25%、50%、75%。將兩項結(jié)果相乘,乘積<2分為陰性,≥2分為陽性。

1.2.3圖像分析 將免疫組化切片放置于Olympus顯微鏡下,對所測視野進行精準定位后由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細胞圖像輸入CMIAS真彩色圖像分析系統(tǒng),每張切片隨機選擇5個完整而不重疊的視野進行定量分析,根據(jù)免疫組化結(jié)果進行積分光密度(IOD)測定,計算平均IOD,以陽性染色細胞平均IOD作為HO-1、MCP-1表達水平。

1.2.4隨訪 采用電話或門診復診等方式對ESA組患者進行12個月的隨訪,隨訪期間連續(xù)發(fā)生3次及以上妊娠28周之前的自然流產(chǎn)判定為RSA。觀察統(tǒng)計ESA組患者發(fā)生RSA情況,將發(fā)生RSA的患者納入RSA組,未發(fā)生RSA的患者納入非RSA組。

1.2.5ESA患者RSA的影響因素分析 以ESA組患者年齡、孕周、BMI及HO-1、MCP-1表達水平等為自變量,對自變量進行賦值:年齡(實測值),孕周(實測值),BMI(<25 kg/m2=0,≥25 kg/m2=1),既往自然流產(chǎn)史(無=0,有=1),HO-1表達水平(實測值),MCP-1表達水平(實測值)。將RSA發(fā)生與否作為因變量(發(fā)生=0,未發(fā)生=1)。分析自變量與因變量的關(guān)系,記錄比值比(OR)。

2 結(jié) 果

2.1兩組HO-1、MCP-1陽性率及表達水平比較 ESA組HO-1陽性率及表達水平均低于對照組(P<0.05),ESA組MCP-1陽性率及表達水平均高于對照組(P<0.05)。見表1和圖1、2。

注:A為對照組絨毛組織中HO-1陰性表達;B為ESA組絨毛組織中HO-1陽性表達。圖1 絨毛組織HO-1表達情況(SP法,×100)

注:A為對照組絨毛組織中MCP-1陰性表達;B為ESA組絨毛組織中MCP-1陽性表達。圖2 絨毛組織MCP-1表達情況(SP法,×100)

表1 HO-1、MCP-1陽性率及表達水平[n(%)或

2.2RSA組和非RSA組患者臨床資料比較 ESA組患者在12個月的隨訪期間,有23例患者發(fā)生RSA,發(fā)生率為14.02%(23/164)。RSA組和非RSA組患者年齡、孕周、BMI比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);RSA組的HO-1表達水平低于非RSA組(P<0.05),既往有自然流產(chǎn)史患者占比和MCP-1表達水平高于非RSA組(P<0.05)。見表2。

表2 RSA組和非RSA組患者臨床資料比較[n(%)或

2.3ESA患者RSA發(fā)生的影響因素分析 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,既往有自然流產(chǎn)史、HO-1低表達、MCP-1高表達均為ESA患者RSA發(fā)生的危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 ESA患者RSA發(fā)生的影響因素分析

3 討 論

妊娠是成功的半同種移植過程,胚胎能夠完全被母體接受并存活,說明母胎之間一定存在著免疫耐受[8]。ESA在臨床上較為常見,孕婦在孕早期多次發(fā)生自然流產(chǎn)后有發(fā)生RSA的風險,給育齡期孕婦身心及家庭帶來負擔。本研究結(jié)果顯示,ESA患者隨訪12個月內(nèi)RSA的發(fā)生率為14.02%,稍低于既往葛怡琳[9]研究結(jié)果中的17%,可能與樣本量差異、個體差異等有關(guān),但均表明ESA患者有發(fā)生RSA的風險。因此,需積極探討影響ESA患者發(fā)生RSA的影響因素,為臨床診治提供指導。

胚胎受母胎界面免疫反應的影響進入子宮內(nèi)膜,改變其血管,使胚胎受到血液滋養(yǎng),逐漸成熟,倘若免疫狀態(tài)失衡,胚胎將會出現(xiàn)血液供給不足,最終導致流產(chǎn)[10]。MCP-1通過參與免疫細胞的運動、遷移機制來影響胚胎期母胎界面的免疫反應[11-12]。絨毛組織中HO-l主要表達于胎盤功能的執(zhí)行細胞,即滋養(yǎng)細胞,正常妊娠主要依靠滋養(yǎng)細胞功能和結(jié)構(gòu)的完整性,HO-1不僅能夠加快生成膽紅素,還可將血紅素及其相關(guān)有害物清除[13],以減少多種應激損傷的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,ESA組MCP-1陽性率高于對照組,HO-1陽性率低于對照組,提示MCP-1陽性率升高、HO-1陽性率降低均與ESA的發(fā)生相關(guān)。原因可能是:母胎界面MCP-1表達上調(diào)可引起巨噬細胞的免疫活性異常,活躍的巨噬細胞分泌更多的MCP-1,促使大量巨噬細胞聚集,如此反復,從而導致胚胎死亡[14]。然而,HO-1陰性表達可能導致絨毛間的血紅蛋白和血紅素聚集,從而上調(diào)黏附分子表達,使免疫細胞被吸收,發(fā)生免疫排斥反應,最終導致ESA[15]。

RSA的病因較為復雜多樣,大部分患者病因難以識別,對廣大女性的生理、心理造成嚴重的影響,臨床上較為難防難治。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),RSA組患者的HO-1表達水平低于非RSA組,既往有自然流產(chǎn)史患者占比和MCP-1表達水平高于非RSA組,且多因素Logistic分析顯示這些均為RSA的影響因素。分析原因:自然流產(chǎn)可引起子宮內(nèi)膜損傷和凝血異常,增加蛻膜發(fā)育不良、胎盤年齡等風險,影響再次妊娠。既往研究也證實流產(chǎn)次數(shù)越多,患者妊娠丟失率越高[16]。HO-1水平降低可破壞局部血管的舒張功能和滋養(yǎng)細胞功能,影響正常妊娠,造成胚胎組織種植穩(wěn)固性較低,致使其發(fā)生脫落;同時,HO-1低表達可引起流入葉狀絨毛膜血流量降低,從而使胎盤內(nèi)出現(xiàn)血氧不足,導致局部缺血絨毛壞死,胎盤內(nèi)毒素因子增多,使得抗炎作用減弱和抗氧化能力不足,最終導致RSA的發(fā)生[17]。MCP-1可趨化單核-巨噬細胞等炎性細胞向病灶部位聚集,從而進一步加重機體損傷。MCP-1水平升高促進單核-巨噬細胞分泌前列腺素E2,增加宮縮,從而誘發(fā)流產(chǎn)。MCP-1可誘導炎性細胞靠近母胎界面,促進胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡,子宮內(nèi)膜功能層發(fā)生的短而直的小動脈突發(fā)急性狀況,引發(fā)胎盤出血、壞死等不良事件,最終導致流產(chǎn)[18]。

總之,妊娠本身是極其復雜的過程,本研究通過探討ESA患者絨毛組織HO-1、MCP-1表達情況及RSA發(fā)生的危險因素,證實了ESA患者絨毛組織HO-1表達水平降低、MCP-1表達水平升高,并且HO-1低表達、MCP-1高表達均會引起RSA的發(fā)生。因此,建議臨床上針對RSA患者監(jiān)控上述指標水平,并積極采取措施進行治療。