西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因鑒定及表達(dá)分析

宋文菲,劉 娜,苗春輝,余玉生,胡宗文,王艷輝,李亞輝

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201; 2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661101;3. 紅河學(xué)院 生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院,云南蒙自 661199)

沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Silent information regulator2,Sir2)是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的Ⅲ類組蛋白/蛋白去乙?；竅1-2]。已知Sir2樣蛋白均含有一個(gè)去乙酰化酶(Sirtuin)核心結(jié)構(gòu)域,因而將Sir2同源的蛋白統(tǒng)稱為Sirtuin蛋白[3-4]。該蛋白家族廣泛存在于原核生物和真核生物中,在基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、新陳代謝和衰老等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)生物的Sirtuin蛋白基因分為5類,Ⅰ類包含3個(gè)基因(Sirt1～Sirt3),Ⅱ類和Ⅲ類各包含1個(gè)基因,分別為Sirt4和Sirt5基因,Ⅳ類包含2個(gè)基因(Sirt6和Sirt7),U類包括古細(xì)菌和細(xì)菌Sirtuin基因[6-7]。不同生物間Sirtuin蛋白基因數(shù)和分布存在差異,例如原核生物的枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、糞腸球菌Enterococcusfaecalis屬于U類,僅有1種[6-7];真核生物的釀酒酵母Saccharomycescerevisiae有4種,均屬于Ⅰ類;黑腹果蠅Drosophilamelanogaster有5種,屬于Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類;西方蜜蜂Apismellifera有6種,哺乳動(dòng)物人類有7種,均屬于Ⅰ～Ⅳ類[6-8]。

目前Sirtuin蛋白功能已在許多真核生物中相繼得到驗(yàn)證,例如在釀酒酵母中Sirtuin蛋白參與端粒、rDNA和沉默交配型位點(diǎn)的沉默,維持基因組完整性和壽命調(diào)控[9-10],Sir2基因缺失會(huì)導(dǎo)致釀酒酵母壽命縮短,而增加Sir2p基因拷貝可延長(zhǎng)酵母壽命[10-11]。Sir-2.1和dSir2基因表達(dá)增加可分別延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans和黑腹果蠅的壽命[11-12],黑腹果蠅和釀酒酵母的Sirtuin蛋白可通過(guò)熱量限制延長(zhǎng)生物體壽命[12-13]。在哺乳動(dòng)物中,Sirtuin蛋白家族成員有7個(gè),Sirt1、Sirt6和Sirt7定位于細(xì)胞核,Sirt2定位于胞質(zhì),Sirt3、Sirt4和Sirt5定位于線粒體[14]。 Sirt1對(duì)許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵組蛋白(H3-K9、H4-K16和H1-K26),以及非組蛋白靶點(diǎn)(p53、FOXO1/3和PGC-1α)有去乙?；饔?在DNA修復(fù)與凋亡、肌肉與脂肪分化、線粒體生物發(fā)生、葡萄糖與胰島素穩(wěn)態(tài)和激素分泌中發(fā)揮了重要作用[14]。哺乳動(dòng)物組織中的Sirt1蛋白水平會(huì)被禁食和熱量限制所誘導(dǎo),Sirt1基因在大腦過(guò)量表達(dá)可延長(zhǎng)小鼠壽命[15-16];Sirt2通過(guò)調(diào)控H4K20甲基化的有絲分裂沉積,進(jìn)而控制細(xì)胞周期進(jìn)程和基因組穩(wěn)定性,并間接參與神經(jīng)退行性疾病的自噬、氧化應(yīng)激和炎癥等細(xì)胞過(guò)程[17];Sirt3可調(diào)節(jié)線粒體蛋白的整體乙?；?控制線粒體氧化途徑的流動(dòng),減少氧化應(yīng)激,在造血干細(xì)胞中高度富集,在衰老造血干細(xì)胞中上調(diào)可提高其再生能力[18-19];Sirt4是DNA損傷反應(yīng)通路的重要組成部分,協(xié)調(diào)谷氨酰胺代謝中的代謝阻滯、細(xì)胞周期阻滯和腫瘤抑制[20]; Sirt5是一種依賴于NAD+的賴氨酸脫?；?可去除琥珀酰和丙二酰,以糖酵解為主要靶標(biāo)調(diào)節(jié)細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體的蛋白丙二?；痆21]; Sirt6通過(guò)調(diào)節(jié)DNA修復(fù)、端粒維持以及葡萄糖和脂質(zhì)代謝來(lái)影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài),其在轉(zhuǎn)基因小鼠的過(guò)量表達(dá)可延長(zhǎng)雄性小鼠壽命[22-23];Sirt7在染色質(zhì)調(diào)控、細(xì)胞轉(zhuǎn)化程序和腫瘤形成中起到關(guān)鍵作用,通過(guò)調(diào)控泛素-蛋白酶體途徑控制肝臟的脂質(zhì)代謝[24-25]。

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)哺乳動(dòng)物Sirtuin蛋白功能開(kāi)展了系統(tǒng)研究,并發(fā)現(xiàn)Sirtuin蛋白在哺乳動(dòng)物代謝相關(guān)疾病和延緩衰老的調(diào)控作用[14-16],針對(duì)昆蟲(chóng)Sirtuin蛋白功能研究?jī)H集中在黑腹果蠅中,發(fā)現(xiàn)了Sirt1、Sirt2、Sirt4和Sirt6基因?qū)诟构壍拇x平衡、壽命具有調(diào)控作用[26-30],而其他昆蟲(chóng)Sirtuin蛋白的功能研究還相對(duì)匱乏。蜜蜂是自然界的一類重要授粉昆蟲(chóng),對(duì)維持自然生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義,研究發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂有6種Sirtuin蛋白家族基因[7],Sir2基因在西方蜜蜂蜂王和工蜂表達(dá)存在差異,食物中氨基酸與碳水化合物比例可影響Sir2基因表達(dá),顯示Sir2可影響西方蜜蜂壽命[31-32]。鑒于國(guó)內(nèi)外有關(guān)西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因的系統(tǒng)研究還鮮有報(bào)道,本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因進(jìn)行鑒定,分析該家族基因的結(jié)構(gòu)、染色體位置、結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,以及在西方蜜蜂不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式,以期為后續(xù)探討西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù) 西方蜜蜂全基因組來(lái)自2006年Weinstock等[33]公布的數(shù)據(jù),并選取7種昆蟲(chóng)(東方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.dorsata、小蜜蜂A.florea、地熊蜂Bombusterrestris、苜蓿切葉蜂Megachilerotundata、家蠶Bombyxmori、黑脈金斑蝶Danausplexippus)與西方蜜蜂進(jìn)行Sirtuin蛋白家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析,7種昆蟲(chóng)的基因組數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)。

1.1.2 供試?yán)ハx(chóng) 西方蜜蜂采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(蜜蜂)紅河綜合試驗(yàn)站西方蜜蜂試驗(yàn)蜂場(chǎng)。選擇3群群勢(shì)相當(dāng)?shù)慕】捣淙?放入一張空巢脾,待蜂王產(chǎn)卵后,分別取2、3、5日齡工蜂幼蟲(chóng)、2日齡工蜂蛹(復(fù)眼為粉色)和羽化出房工蜂。移1日齡幼蟲(chóng)到裝有王漿的育王框內(nèi),放入原蜂群的繼箱里育王,分別取2、3、5日齡蜂王幼蟲(chóng)、2日齡蜂王蛹(復(fù)眼為棕色)和羽化出房處女蜂王。相同蟲(chóng)態(tài)的蜂王和工蜂樣本所含個(gè)體數(shù)一致,即2日齡幼蟲(chóng)以10頭為一個(gè)樣本;3日齡幼蟲(chóng)以6頭為一個(gè)樣本;5日齡幼蟲(chóng)和2日齡蛹均以3頭為一個(gè)樣本;羽化成蜂以3只成蜂頭部為一個(gè)樣本,每個(gè)樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣后采用液氮凍斃,-80 ℃保存。

1.1.3 試劑 Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix ExTaqⅡ購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;DEPC水購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。引物合成由生工生物合成(上海)股份有限公司完成。

1.2 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因的鑒定及分析

1.2.1 Sirtuin蛋白家族基因鑒定 為鑒定西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相關(guān)序列信息,將序列提交至Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pfam.xfam.org/),獲得保守結(jié)構(gòu)域隱馬爾可夫模型序列文件(PF02146)。采用HMMER 3.0軟件將模型序列文件轉(zhuǎn)化為hmm格式,使用hmmsearch程序在氨基酸序列數(shù)據(jù)中進(jìn)行查找,設(shè)置閾值為e<10-5,找到相應(yīng)候選Sirtuin家族基因,使用序列抽提軟件Seqtk抽提相應(yīng)的氨基酸序列FASTA格式文件。使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)SMART(https://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè),評(píng)估其是否包含Sirtuin結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因分子特征及定位 采用在線軟件ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)西方蜜蜂所鑒定的Sirtuin蛋白家族基因進(jìn)行氨基酸數(shù)目計(jì)算,預(yù)測(cè)各家族基因的蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)。使用在線軟件WoLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)對(duì)各家族基因的亞細(xì)胞位置進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用本地BLAST比對(duì)程序?qū)㈩A(yù)測(cè)的西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因氨基酸序列與CDS序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),確定相應(yīng)基因CDS序列。將CDS序列與參考基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),明確Sirtuin蛋白家族基因在參考基因組的位置。采用BioEdit對(duì)參考基因組上各個(gè)染色體長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì),使用R語(yǔ)言包RIdeogram繪制Sirtuin蛋白家族基因在參考基因組上的物理位置。基于BLASTN比對(duì)結(jié)果,獲得各家族基因的外顯子數(shù)量及長(zhǎng)度信息,使用R語(yǔ)言包gggenes繪制家族基因結(jié)構(gòu)圖。

1.2.3 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因系統(tǒng)發(fā)育及保守結(jié)構(gòu)域分析 將西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因,以及7種昆蟲(chóng)的Sirtuin家族基因(基因鑒定方法同“1.2.1”)氨基酸序列合并,使用MEGA 7.0軟件對(duì)Sirtuin蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)?；谧畲笏迫环?maximum likelihood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),設(shè)置bootstrap值為 1 000。使用Clustal W對(duì)西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因進(jìn)行多重序列比對(duì),將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入至GeneDoc中,預(yù)測(cè)其保守結(jié)構(gòu)域。在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中查找人類、動(dòng)物、植物等6 942個(gè)物種19 213條序列所構(gòu)建的Sirtuin保守結(jié)構(gòu)域信息(HMM logo),與西方蜜蜂預(yù)測(cè)的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因qRT-PCR分析

采用Trizol法提取西方蜜蜂總RNA,取 1 μL RNA測(cè)定其濃度及OD值(A260/A280),要求OD值為1.8～2.1,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,獲得的cDNA在-20 ℃保存,備用。以Zhang等[34]報(bào)道的Gapdh為內(nèi)參基因,采用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(StepOnePlusTM型,Applied Biosystems公司)檢測(cè)西方蜜蜂6個(gè)Sirtuin蛋白家族基因(AmSirt1、AmSirt2、AmSirt4～AmSirt7)相對(duì)表達(dá)量,相關(guān)基因引物序列信息見(jiàn)表1。反應(yīng)體系按說(shuō)明書進(jìn)行操作,反應(yīng)程序:95 ℃,10 min;95 ℃,15 s,57 ℃,1 min(40個(gè)循環(huán));添加熔解曲線;設(shè)置3個(gè)水平重復(fù)孔;以2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

有一天，老大爺阿扁在廳堂下做車輪，齊桓公正好在廳堂上看書。老大爺阿扁就想找齊桓公聊聊，于是放下干活的工具，走到廳堂上。阿扁說(shuō)：“冒昧地請(qǐng)教一下，您讀的是什么？”齊桓公答：“圣賢說(shuō)的話啊。怎么了？”阿扁又問(wèn)：“那圣人還活著嗎？”齊桓公答：“已經(jīng)死了?！卑⒈鈸u搖頭，說(shuō)：“唉，您讀的書不過(guò)是古人的糟粕而已！”齊桓公差點(diǎn)被這句話給氣炸了，心想：“本人堂堂一國(guó)之君，親切地接見(jiàn)一個(gè)小小的老工匠，他不但不識(shí)抬舉，還不給面子。”于是，憤怒地說(shuō)：“你一個(gè)做車輪的工匠，有什么資格評(píng)議寡人讀什么書，你懂什么？你說(shuō)不出個(gè)所以然來(lái)，寡人就判你死刑，把你給砍了！”

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列信息Table 1 Primer information of real-time quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族成員鑒定與分布

在西方蜜蜂基因組中共鑒定出10個(gè)Sirtuin蛋白基因,屬于Sirtuin蛋白的6個(gè)家族成員,按直系同源物分別命名為AmSirt1(AmSirt1-1～AmSirt1-3)、AmSirt2(AmSirt2-1～AmSirt2-3)、AmSirt4～AmSirt7(表2)。6個(gè)家族基因分別定位于不同的染色體,其中AmSirt1和AmSirt2呈現(xiàn)典型串聯(lián)重復(fù)分布,其余基因則單獨(dú)存在。AmSirt1-1～AmSirt1-3分布于4號(hào)染色體;AmSirt2-1～AmSirt2-3分布于10號(hào)染色體;AmSirt4分布于7號(hào)染色體;AmSirt5分布于14號(hào)染色體,AmSirt6分布于3號(hào)染色體,AmSirt7分布于11號(hào)染色體(圖1)。對(duì)西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因分子特征及亞細(xì)胞位置預(yù)測(cè)分析顯示,其編碼氨基酸數(shù)為265～899個(gè),分子質(zhì)量為29.45～102.91 ku,等電點(diǎn)為4.58～ 9.09。AmSirt1-1、AmSirt6和AmSirt7定位于胞質(zhì)/細(xì)胞核,AmSirt1-2、AmSirt1-3、AmSirt2-2、AmSirt2-3、AmSirt5定位于胞質(zhì),AmSirt2-1和AmSirt4定位于線粒體(表2)。

灰色柱子:不含Sirtuin蛋白家族基因的染色體;有色柱子:含有Sirtuin蛋白家族基因的染色體

表2 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因鑒定及序列特征Table 2 Identification and sequence characterization of Sirtuin protein family genes in Apis mellifera

2.2 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因結(jié)構(gòu)分析

西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因平均外顯子數(shù)為6.5個(gè),其中AmSirt1-1～AmSirt1-3外顯子數(shù)最多(9個(gè)),AmSirt4和AmSirt7外顯子數(shù)最少(4個(gè))。4個(gè)基因(AmSirt7、AmSirt1-1～AmSirt1-3)具有較長(zhǎng)的外顯子(844～1 159 bp), 2個(gè)基因(AmSirt2-2和AmSirt2-3)第1外顯子較短(17 bp和28 bp)。3個(gè)基因(AmSirt1-1～AmSirt1-3)具有最長(zhǎng)的內(nèi)含子(均為2 719 bp), 2個(gè)基因(AmSirt5、AmSirt7)內(nèi)含子較短(56～62 bp)。在AmSirt1-1～AmSirt1-3中,除AmSirt1-1第1內(nèi)含子與其他2個(gè)基因有差異外,其余外顯子和內(nèi)含子長(zhǎng)度基本一致。在AmSirt2-1～AmSirt2-3中,除第1外顯子和內(nèi)含子有差異外,其余外顯子和內(nèi)含子長(zhǎng)度基本一致(圖2)。說(shuō)明Sirtuin蛋白同一家族內(nèi)不同基因的中、后端外顯子和內(nèi)含子具有一定的保守性。

圖2 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of Sirtuin protein family genes in Apis mellifera

2.3 西方蜜蜂等8種昆蟲(chóng)的Sirtuin蛋白家族基因系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)西方蜜蜂等8種昆蟲(chóng)Sirtuin蛋白家族基因分析(表3)顯示,8種昆蟲(chóng)均未發(fā)現(xiàn)Sirt3家族基因。西方蜜蜂、東方蜜蜂、小蜜蜂、大蜜蜂和地熊蜂5種蜜蜂屬昆蟲(chóng)均含有(Sirt1、Sirt2、Sirt4～Sirt7)6個(gè)家族基因,但種間基因數(shù)量存在差異,西方蜜蜂和大蜜蜂基因數(shù)最多(10個(gè)),分布基本一致,小蜜蜂基因數(shù)最少(6個(gè))。苜蓿切葉蜂家族基因成員與蜜蜂屬5個(gè)種類一致,基因數(shù)達(dá)到14個(gè);家蠶和黑脈金斑蝶家族基因成員及基因數(shù)均為5個(gè),缺少Sirt1家族基因?；贛L法構(gòu)建西方蜜蜂等8種昆蟲(chóng)Sirtuin蛋白家族基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3),Sirtuin蛋白家族基因明顯聚合為4類6個(gè)分支(Sirt1、Sirt2、Sirt4～Sirt7),其中Sirt1和Sirt2聚為第Ⅰ類(bootstrap值100%),Sirt4和Sirt5由于bootstrap值較低,分屬第Ⅱ、Ⅲ類,Sirt6和Sirt7聚為第Ⅳ類(bootstrap值100%)。西方蜜蜂3個(gè)AmSirt2基因(AmSirt2-1～AmSirt2-3)聚為一個(gè)小支(bootstrap值99%),并與東方蜜蜂的2條基因聚為一支(bootstrap值90%)。3個(gè)AmSirt1基因(AmSirt1-1～AmSirt1-3)分化為兩個(gè)小支,兩個(gè)小支分別與大蜜蜂3條基因聚合(bootstrap值分別為84%和90%)。西方蜜蜂AmSirt4、AmSirt5分別與東方蜜蜂、大蜜蜂和小蜜蜂的Sirt4、Sirt5基因聚為一支(bootstrap均為值98%),AmSirt7與東方蜜蜂、小蜜蜂和大蜜蜂的3條基因聚為一支(bootstrap值74%),AmSirt6與蜜蜂屬近緣物種未形成明顯聚類分支。

表3 西方蜜蜂等8種昆蟲(chóng)的Sirtuin蛋白家族基因分析Table 3 Genes analysis of Sirtuin protein family in eight kinds of insects contanining Apis mellifera

2.4 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)西方蜜蜂6個(gè)Sirtuin蛋白家族基因氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖4)顯示,與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)物種的Sirtuin蛋白保守結(jié)構(gòu)域相比,西方蜜蜂家族基因具有Sirtuin蛋白的典型特征,存在12個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,其中在6個(gè)家族基因氨基酸序列前段均存在一段高度保守的富含甘氨酸的結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域1～3),在中段均存在QN-D-L-G的保守結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域6～7)。此外,發(fā)現(xiàn)3個(gè)西方蜜蜂所特有的保守氨基酸位點(diǎn),即在結(jié)構(gòu)域4～5之間存在1個(gè)高度保守的脯氨酸位點(diǎn),在結(jié)構(gòu)域7～8之間存在1個(gè)高度保守的谷氨酸位點(diǎn),在基因后段存在1個(gè)高度保守的天冬酰胺位點(diǎn)。

A.西方蜜蜂Sirtuin蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果;B.Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)Sirtuin蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果;數(shù)字1～12代表保守結(jié)構(gòu)域,綠色倒三角代表西方蜜蜂所特有的保守氨基酸位點(diǎn)

2.5 西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因表達(dá)模式分析

Sirtuin蛋白家族基因在西方蜜蜂蜂王和工蜂不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)。在蜂王中,6個(gè)基因在幼蟲(chóng)2日齡到5日齡的表達(dá)量總體呈逐漸下降,至蛹期逐漸上升趨勢(shì)。以3日齡和5日齡幼蟲(chóng)的基因表達(dá)量相對(duì)較低,5日齡幼蟲(chóng)基因表達(dá)量顯著低于2日齡蛹(P<0.05);成蟲(chóng)期除AmSirt1與AmSirt6表達(dá)量較低外,其余4個(gè)基因表達(dá)量與2日齡蛹相當(dāng)(圖5)。在工蜂中,6個(gè)基因在2日齡、3日齡和5日齡幼蟲(chóng)的表達(dá)量相對(duì)較低,均在2日齡蛹期達(dá)到峰值;2日齡蛹期與3個(gè)日齡幼蟲(chóng)期均達(dá)到顯著差異(P<0.05),2日齡蛹期到成蟲(chóng)期呈下降趨勢(shì)(圖6)。

L2.2日齡幼蟲(chóng);L3.3日齡幼蟲(chóng);L5.5日齡幼蟲(chóng);P2.2日齡蛹;EB.羽化蜂;不同字母表示不同發(fā)育時(shí)期存在差異顯著(P<0.05,Duncan’s test),下同

圖6 Sirtuin蛋白家族基因在西方蜜蜂工蜂不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of Sirtuin protein family genes at different developmental stages of Apis mellifera worker

3 討 論

Sirtuin蛋白是一類進(jìn)化保守的NAD+依賴性脫酰基酶家族,從原核生物到哺乳動(dòng)物的幾乎所有物種中都存在1種或多種Sirtuin蛋白[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn),西方蜜蜂等8種昆蟲(chóng)同時(shí)缺少Sirt3家族成員,膜翅目6種昆蟲(chóng)均有6個(gè)家族成員,而鱗翅目2種昆蟲(chóng)僅有5個(gè)。這與Frye[6]和Greiss等[7]在不同生物的Sirtuin基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果一致。值得注意的是,在真核生物中類似Sirtuin蛋白家族成員基因的現(xiàn)象較為普遍。Greiss等[7]研究表明,在蛻皮動(dòng)物總門(昆蟲(chóng)綱、線蟲(chóng)綱)的物種中均缺失Sirt3基因,推斷Sirt3在蛻皮動(dòng)物進(jìn)化早期丟失。Frye[6]依據(jù)真核生物起源于細(xì)菌與古生菌融合假說(shuō),提出第一個(gè)真核生物從原核親本獲得3類Sirtuin家族基因(Ⅱ、Ⅲ和U),早期真核生物在進(jìn)化中出現(xiàn)4類家族基因(Ⅰ～Ⅳ),在真核生物的進(jìn)化中,部分真核生物失去1類(缺失Ⅲ類的西方蜜蜂和赤擬谷盜[7])、失去2類(缺失Ⅰ、Ⅲ類的家蠶和黑脈金斑蝶[4]),或失去3類(缺失Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類的釀酒酵母[6])。關(guān)于昆蟲(chóng)丟失Sirt3基因的現(xiàn)象,一方面可能與昆蟲(chóng)物種進(jìn)化有關(guān),如膜翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)家族成員基因數(shù)量偏多,鱗翅目和雙翅目昆蟲(chóng)數(shù)量偏少[4,7];

另一方面暗示昆蟲(chóng)體內(nèi)保留的Sirtuin蛋白基因可能賦予冗余功能以補(bǔ)償基因的缺失,如Sirt4是黑腹果蠅中唯一定位于線粒體的家族基因[29],黑腹果蠅Sirt2與哺乳動(dòng)物Sirt3功能相似,可調(diào)節(jié)ATP的合成[28]。本研究也發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂Sirt4基因定位于線粒體,預(yù)示西方蜜蜂Sirt2和Sirt4基因可能賦予冗余功能,以彌補(bǔ)Sirt3基因的 缺失。

為探討Sirtuin蛋白家族基因?qū)ξ鞣矫鄯渖L(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用,本研究對(duì)西方蜜蜂雌性蜂不同發(fā)育時(shí)期的6個(gè)家族基因進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示,6個(gè)家族基因在蜂王和工蜂不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá),蜂王各家族基因表達(dá)量整體高于工蜂,蜂王和工蜂各家族基因表達(dá)量均在2日齡蛹期達(dá)到峰值。近年以黑腹果蠅為代表的昆蟲(chóng)Sirtuin蛋白家族基因的功能得到系統(tǒng)研究[26-30],黑腹果蠅Sirt1在脂肪體中起到維持胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和代謝穩(wěn)態(tài)的作用[26],并通過(guò)調(diào)節(jié)Notch通路影響黑腹果蠅感覺(jué)器官前體和翅的發(fā)育過(guò)程[27]。Sirt2是線粒體能量代謝的重要調(diào)節(jié)器,通過(guò)ATP合酶β調(diào)節(jié)ATP合成[28],Sirt4可介導(dǎo)黑腹果蠅對(duì)禁食反應(yīng)、代謝穩(wěn)態(tài)作用,禁食可誘導(dǎo)脂肪體中Sirt4基因上調(diào)[29]。Sirt6基因過(guò)表達(dá)可延長(zhǎng)黑腹果蠅壽命,引起抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng),蛋白質(zhì)合成率降低[30]。蛹期是全變態(tài)昆蟲(chóng)所特有的時(shí)期,盡管在蛹期處于不食不動(dòng)的禁食狀態(tài),但體內(nèi)進(jìn)行著組織器官(觸角、胸足、翅等)的分化[35]。因此推測(cè)蛹期的禁食行為、熱量限制和強(qiáng)烈的器官分化是引起西方蜜蜂雌性蜂6個(gè)Sirtuin家族基因表達(dá)量明顯上升的主要原因。

此外,6個(gè)家族基因中以Sirt4和Sirt5表達(dá)量較高,Sirt1和Sirt2的表達(dá)量較低,推測(cè)與基因功能相關(guān)。如Sirt4、Sirt5主要涉及線粒體能量代謝過(guò)程,生物體禁食和熱量限制均可誘導(dǎo)Sirt4和Sirt5基因上調(diào)[21,29],黑腹果蠅禁食可引起葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸水平顯著降低[29],意大利蜜蜂體內(nèi)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶在蛹期的表達(dá)量較低[36],說(shuō)明禁食行為對(duì)昆蟲(chóng)糖酵解中間產(chǎn)物有顯著影響。而Sirt1涉及生物體細(xì)胞凋亡、組織分化、能量代謝和壽命調(diào)節(jié)等多種功能[15-16],Sirt2控制細(xì)胞周期進(jìn)程和基因組穩(wěn)定性[17],Sirt1和Sirt2對(duì)生物調(diào)節(jié)功能的多樣性也預(yù)示著自身表達(dá)水平可能受多種因素的調(diào)控。本研究也發(fā)現(xiàn),西方蜜蜂AmSirt1和AmSirt2出現(xiàn)典型的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象,暗示西方蜜蜂AmSirt1和AmSirt2功能的復(fù)雜性。目前有關(guān)昆蟲(chóng)Sirtuin蛋白家族基因的研究還相對(duì)匱乏,后續(xù)還需要進(jìn)一步探討和驗(yàn)證西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族成員的功能,以期為揭示Sirtuin蛋白對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝與壽命的調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究從西方蜜蜂全基因組數(shù)據(jù)中鑒定出10個(gè)Sirtuin蛋白基因,分屬6個(gè)家族成員基因(AmSirt1、AmSirt2、AmSirt4～AmSirt7),AmSirt1和AmSirt2家族成員各包含3個(gè)基因,缺少Sirt3基因。利用生物信息學(xué)分析西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因的結(jié)構(gòu)、染色體位置和保守結(jié)構(gòu)域,通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步明確Sirtuin蛋白家族基因在西方蜜蜂雌性蜂不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況,研究結(jié)果為后續(xù)系統(tǒng)研究西方蜜蜂Sirtuin蛋白家族基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。