FaesCAL基因在同型長(zhǎng)花柱甜蕎中的表達(dá)分析

馬志遠(yuǎn),王子翔,劉志雄

(長(zhǎng)江大學(xué) 園藝園林學(xué)院,湖北荊州 434025)

甜蕎(FagopyrumesculentumMoench.)是蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)兼食、藥、觀賞和土壤修復(fù)等多種用途的經(jīng)濟(jì)作物,蕎麥籽粒不含谷蛋白,但富含類黃酮、多酚、多糖、賴氨酸和抗氧化活性物等,近年作為一種具疾病預(yù)防和保健功效的功能食品備受關(guān)注[1-3]。然而,甜蕎因二型花柱導(dǎo)致的異型自交不親和,自然群體中短花柱長(zhǎng)雄蕊(thrum)和長(zhǎng)花柱短雄蕊(pin)植株1∶1分離,僅異型花間互相授粉才能正常結(jié)實(shí),同型花自交不親和,產(chǎn)量低,雜交育種因難,成為制約這一重要經(jīng)濟(jì)作物推廣應(yīng)用的瓶頸[4]。尋找或創(chuàng)制親和性好的甜蕎種質(zhì)資源,對(duì)于開展甜蕎雜交育種工作、提高甜蕎產(chǎn)量均具有重要的意義。筆者課題組前期在甜蕎品種‘北早生’群體中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊lpls自然突變體單株基礎(chǔ)上,通過隔離傳粉獲得了遺傳性狀穩(wěn)定、親和性好、自花、與同型、異型花間均能正常授粉結(jié)實(shí)的同型長(zhǎng)花柱甜蕎株系(圖1),成為甜蕎高產(chǎn)育種不可或缺的種質(zhì)資源。深入研究同型長(zhǎng)花柱甜蕎花和果實(shí)的發(fā)育規(guī)律與分子調(diào)控機(jī)制,是合理利用該材料的前提和基礎(chǔ)。

在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)中,CAULIFLOWER(CAL) 基因編碼一個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子,其在花發(fā)育過程中參與成花轉(zhuǎn)變、花分生組織特性決定和花原基的形成[5-6]。為探究CAL同源基因在甜蕎花和果實(shí)發(fā)育調(diào)控中的功能是否保守,本研究在分離甜蕎CAL同源基因FaesCAL基礎(chǔ)上,結(jié)合qRT-PCR和石蠟切片檢測(cè)該基因在同型長(zhǎng)花柱甜蕎中表達(dá)的組織特異性和花芽分化關(guān)鍵時(shí)期表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化,從而解析該基因在與參與同型長(zhǎng)花柱甜蕎花和果實(shí)發(fā)育中的作用和功能,以期為甜蕎分子改良和雜交育種積累資料和資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

挑選同型長(zhǎng)花柱甜蕎籽粒飽滿的種子,種植在盛滿營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)(主要成分為泥炭土和椰糠)的規(guī)格為21 cm×14 cm×20 cm的花盆中,將花盆露天放置在種質(zhì)資源圃內(nèi),常規(guī)水肥管理,在盛花期及坐果時(shí)搬至實(shí)驗(yàn)室內(nèi),用經(jīng)過消毒滅菌的鑷子和剪刀分別從不同植株(≥3)上采集根、莖、葉片、雄蕊、雌蕊、花被片以及發(fā)育5 d的果實(shí),置于 2 mL離心管中,經(jīng)液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱中備用。在甜蕎花序發(fā)育和花芽分化時(shí)期,分別將不同發(fā)育時(shí)期的花芽用小剪刀剪下,每個(gè)時(shí)期的花芽分成2份,一份經(jīng)液氮速凍后存放于 -80 ℃冰箱中備用,另一份固定在FAA[V(甲醛)∶V(冰乙酸)∶V(70%乙醇)=1∶1 ∶18]中,經(jīng)石蠟切片確定花芽的發(fā)育時(shí)期。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 同型長(zhǎng)花柱甜蕎CAL同源基因的克隆 根據(jù)筆者課題組前期甜蕎花芽的第3代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(BioProject ID:PRJNA517031)拼接獲得甜蕎CAL同源基因序列,根據(jù)3′- Full Race Core Set Ver.2.0 試劑盒(TaKaRa)說明書上的引物設(shè)計(jì)原則,采用Oligo 7.0軟件在5′非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)基因特異性引物GSPFaesCAL,以同型長(zhǎng)花柱甜蕎的花芽總RNA 為模板,采用 3′- Full Race Core Set Ver.2.0 試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成甜蕎花芽3′RACE第1鏈cDNA,PCR擴(kuò)增獲得同型長(zhǎng)花柱甜蕎FaesCAL同源序列的全長(zhǎng)序列。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性 5 min, 94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min; 共30個(gè)循環(huán),最后72 ℃ 延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后送至上海生工生物公司測(cè)序,克隆獲得甜蕎FaesCAL同源基因的全長(zhǎng)序列。試驗(yàn)所用引物見表1。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequences and application

1.2.2 蛋白同源序列比對(duì)及分子系統(tǒng)發(fā)育分析 將同型長(zhǎng)花柱甜蕎FaesCAL同源基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF)編碼的氨基酸序列在 NCBI 數(shù) 據(jù) 庫(https://blast.Ncbi.Nlm.Nih.gov/Blast.Cgi)中進(jìn)行 BlastP 同源比對(duì)搜索,選取麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)、蓖麻(RicinuscommunisL.)和棉花(GossypiumhirsutumL.)等植物的CAL同源蛋白,采用 MEGA 7.0 軟件的鄰接法(Neighbor-Joining,NJ) 構(gòu)建蛋白序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹。同時(shí)選取5個(gè)物種的同源蛋白,采用Bioedit7.0軟件中的ClustalW程序,對(duì)FaesCAL轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

按照王旋等[7]的方法制作同型長(zhǎng)花柱甜蕎不同時(shí)期花芽的石蠟切片:將在FAA中固定好的花芽經(jīng)脫水、透明、浸蠟、組織包埋之后,利用Leica RM2235石蠟切片機(jī)將包埋入石蠟的材料切成厚度為8 μm的連續(xù)切片。切片使用1%番 紅-0.1%固綠染色后封片保存。制作的甜蕎花芽切片在Caikon RCK-40C顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照,通過細(xì)胞形態(tài)特征確定花芽發(fā)育的時(shí)期。并選取5個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期的花芽,分別提取其總RNA,通過qRT-PCR檢測(cè)FaesCAL基因在甜蕎花芽分化5個(gè)關(guān)鍵時(shí)期表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜蕎FaesCAL基因全長(zhǎng)cDNA克隆

通過3′RACE技術(shù)從同型長(zhǎng)花柱甜蕎中分離到CAL基因的cDNA全長(zhǎng),CAL的同源基因cDNA全長(zhǎng)為984 bp,包含1個(gè)28 bp的3′UTR、726 bp的完整ORF、230 bp的5′UTR,編碼241個(gè)氨基酸殘基和1個(gè)終止密碼子。結(jié)構(gòu)分析表明該基因?yàn)镸ADS-box基因家族的CAL進(jìn)化系,命名為FaesCAL(Genbank登錄號(hào):OM056 742)。

2.2 蛋白質(zhì)分析比對(duì)與分子系統(tǒng)發(fā)育分析

蛋白質(zhì)同源比對(duì)分析結(jié)果顯示(圖2):FaesCAL轉(zhuǎn)錄因子的N端含有一個(gè)高度保守、由57個(gè)氨基酸(1-57)殘基組成的MADS-box結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域通過與DNA結(jié)合, 調(diào)控下游基因的表達(dá)[8];該轉(zhuǎn)錄因子還含有一個(gè)由68個(gè)氨基酸殘基(94-161)組成的次級(jí)保守的K結(jié)構(gòu)域,其C末端轉(zhuǎn)錄激活域在序列長(zhǎng)度和氨基酸組成與其他同源蛋白差異較大。分子系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化樹重建顯示(圖3):甜蕎FaesCAL轉(zhuǎn)錄因子與其他雙子葉植物CAL-like轉(zhuǎn)錄因子聚于1個(gè)進(jìn)化分支,其與藜科植物藜麥(Chenopodiumquinoa)的CqCAL親緣關(guān)系最近,共同聚到一個(gè)小的進(jìn)化分支,經(jīng)典分類學(xué)中同源蛋白所屬植物種屬間的進(jìn)化關(guān)系也在樹上得以很好地呈現(xiàn)。

2.3 FaesCAL基因在同型長(zhǎng)花柱甜蕎中的表達(dá)模式分析

FaesCAL基因的表達(dá)組織特異性分析表明(圖4-A):FaesCAL基因主要在同型長(zhǎng)花柱甜蕎根、花被片、雄蕊以及發(fā)育5 d的果實(shí)中表達(dá),在雌蕊中僅能檢測(cè)到微弱的轉(zhuǎn)錄信號(hào),在莖和葉片中不表達(dá)。從其表達(dá)量的差異來看,其在雄蕊中的表達(dá)量最高,極顯著高于其在其他組織的表達(dá)量(LSD,P<0.01);在花被片中的表達(dá)量其次,但極顯著高于其在根、雌蕊以及發(fā)育5 d果實(shí)中的表達(dá)量(LSD,P<0.01)。

A. FaesCAL基因在同型長(zhǎng)花柱甜蕎不同組織中的表達(dá)量;圖中小寫字母表示不同組織之間的差異顯著性;B. FaesCAL基因在同型長(zhǎng)花柱甜蕎花芽分化5個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的表達(dá)量;L1.雄蕊原基出現(xiàn);L2.雄蕊花絲快速伸長(zhǎng)、花被片原基出現(xiàn);L3.小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂、小孢子四分體的形成;L4.單核小孢子靠邊期、花被片閉合;L5.開花前雌雄蕊均發(fā)育成熟的花芽;圖柱上不同小寫字母表示花芽不同發(fā)育時(shí)期之間的差異顯著性;C. 同型長(zhǎng)花柱甜蕎花芽分化5個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的石蠟切片圖;比例尺:100 μm

進(jìn)一步分析該基因在同型長(zhǎng)花柱甜蕎花芽分化5個(gè)關(guān)鍵時(shí)期表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)(圖4-B、4-C):隨著同型長(zhǎng)花柱甜蕎雄蕊原基的出現(xiàn)(L1),FaesCAL基因在花芽中有明顯的表達(dá)(圖4B-L1、C-L1);隨著雄蕊花絲的迅速伸長(zhǎng)和花被片原基的出現(xiàn)(L2),FaesCAL基因的表達(dá)水平迅速升高,直到小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂和小孢子四分體的形成時(shí)(L3)都維持在較高水平;隨著花被片的閉合和花藥中出現(xiàn)單核靠邊期小孢子(L4),FaesCAL基因的表達(dá)呈現(xiàn)緩慢的下降;在開花前,隨著花芽雌、雄蕊發(fā)育成熟(L5),基因的表達(dá)量迅速升高并達(dá)到峰值。從基因表達(dá)量的差異顯著性來看:花芽成熟時(shí)(L5)FaesCAL基因的相對(duì)表達(dá)量最高,與L2時(shí)期該基因的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異,但顯著高于其在L1、L3和L4共3個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量(LSD,P<0.05);在花絲快速伸長(zhǎng)和花被片原基出現(xiàn)時(shí)FaesCAL基因的表達(dá)量其次,其與L3時(shí)期該基因的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異,但顯著高于其在L1和L4時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量(LSD,P<0.05)。

3 討 論

在擬南芥中,CAL開始在花分生組織中表達(dá),隨著花萼的發(fā)育,花瓣和雄蕊原基的出現(xiàn),其轉(zhuǎn)錄活性主要集中在花萼和花瓣中,同時(shí)其在花序的維管束中也有明顯表達(dá),在花發(fā)育過程中主要參與花分生組織特征決定和花原基的形成,調(diào)控AP1基因參與花萼和花瓣的發(fā)育,并促進(jìn)開花[9-11]。擬南芥近緣種甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitataL.) 的CAL-like基因BoCAL在甘藍(lán)花球的形成及發(fā)育中發(fā)揮重要作用,在擬南芥中的過表達(dá)能促使其提早開花[12-13]?；ㄒ?Brassicaoleraceavar.botrytisL.)CAL同源基因BobCAL主要在花序分生組織和花原基中表達(dá),之后隨著花芽分化之后,表達(dá)量顯著下降,主要參與花椰菜花分生組織的的形成,并具有促進(jìn)擬南芥提早開花的功能[13-14]。在藍(lán)莓(VacciniumcorymbosumL.)中,其CAL-like基因在花中表達(dá)量最高,主要參與促進(jìn)開花[15]。棉花(GossypiumhirsutumL.)的CAL-like基因GhCAL主要在莖尖、莖、芽和葉片中表達(dá),在根中不表達(dá),在莖尖的表達(dá)量最高,其通過調(diào)控下游GhAP1-A04和GhAGL6-D09基因的表達(dá),從而促進(jìn)棉花從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變[16]。麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)的CAL-like基因JcCALA在雄花小孢子母細(xì)胞形成期的表達(dá)量顯著升高,在隨后的四分體時(shí)期又有較大幅度下降,說明其可能在雄花小孢子母細(xì)胞的形成和發(fā)育過程中發(fā)揮作用[17]。以上的研究結(jié)果表明,雙子葉植物中CAL-like 基因的表達(dá)模式與其功能有明顯的相關(guān)性。

本研究通過分析FaesCAL基因在甜蕎中的組織表達(dá)特異性發(fā)現(xiàn):FaesCAL基因在同型長(zhǎng)花柱甜蕎雄蕊中的表達(dá)量最高,在花被片中的表達(dá)量其次。分析甜蕎花芽分化5個(gè)關(guān)鍵時(shí)期表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn):FaesCAL基因在開花前花芽雌雄蕊發(fā)育成熟時(shí)的表達(dá)量最高,其次是在雄蕊花絲的迅速伸長(zhǎng)和花被片原基的出現(xiàn)時(shí)期。推測(cè)FaesCAL基因參與了甜蕎的成花轉(zhuǎn)變,并在雄蕊以及花被片的發(fā)育中發(fā)揮作用,但該基因在甜蕎花發(fā)育中的具體作用還需要進(jìn)一步研究和考證。