含1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的酰胺類衍生物的合成及生物活性研究

蘇子欽, 高田田, 邱 敏, 梁馨文, 胡繼亮, 劉 強(qiáng), 張建龍, 吳玉宇, 陳 超, 劉瑋煒

(江蘇海洋大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222005)

近年來(lái),我國(guó)海水養(yǎng)殖種類和養(yǎng)殖模式越來(lái)越多樣化,養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成熟,養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大,但隨著集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高,養(yǎng)殖水域的污染也逐漸加重,致病性弧菌所引起的病害已被認(rèn)為是海水動(dòng)物養(yǎng)殖的“災(zāi)禍之源”[1-5],主要包括副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)和創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)等,均為海洋環(huán)境中最常見的細(xì)菌類群。這些菌群廣泛分布于近岸、河口海區(qū)的海水和水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境之中,不僅會(huì)引起水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,某些弧菌更是會(huì)造成人或其它動(dòng)物發(fā)病[6-8]。

目前,水產(chǎn)動(dòng)物弧菌病的藥物防治主要包括青霉素、硫酸鏈霉素、諾氟沙星和新諾明等,但長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)耐藥性菌株[9-10]。因此,尋找新的先導(dǎo)化合物或化合物骨架修飾、簡(jiǎn)化并開發(fā)出新型水產(chǎn)抗菌藥是當(dāng)前水產(chǎn)病害防控研究的熱點(diǎn)之一。1,3,4-噻二唑是一類含氮硫的五元雜環(huán)化合物,具有抗菌、抗氧化、抗病毒和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)等多種生物活性[11-21]。國(guó)內(nèi)外公司基于噻二唑結(jié)構(gòu),陸續(xù)研發(fā)出了多種含1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的藥物,如除草劑氟噻草胺、丁噻咪草酮和噻黃隆等,殺菌劑噻枯唑,抗菌藥頭孢唑啉和頭孢卡奈等[22-25],該類化合物在化學(xué)和生物學(xué)研究領(lǐng)域一直具有廣泛的應(yīng)用。

XIAO等[26]設(shè)計(jì)并合成了2-氨基-5-(2,4-二氯苯氧基)甲基-1,3,4-噻二唑酰胺類化合物(圖1),初步活性測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn),大部分化合物具有一定的抑菌活性,其中對(duì)麥類黑變病菌的抑制率達(dá)到了70%以上,對(duì)炭疽菌抑制率達(dá)到了60%以上。王德志等[27]基于1,3,4-噻二唑類化合物的抑菌活性,以芳香醛和氨基硫脲為原料,合成了6個(gè)2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑類化合物。抑菌結(jié)果表明,所有目標(biāo)化合物均對(duì)小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌具有一定的抑菌活性。通過(guò)分析構(gòu)效關(guān)系得出,該類化合物中對(duì)氟苯基取代的化合物抑菌活性優(yōu)于其它取代基化合物,對(duì)應(yīng)化合物對(duì)小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的半數(shù)有效濃度(EC50)值分別為23.17 μg·mL-1和20.22 μg·mL-1(圖2)。袁海燕等[28]以硫代氨基脲、甲酸為原料,通過(guò)脫水環(huán)化、Knoevenagle縮合等多步反應(yīng),合成一類具有1,3,4-噻二唑基團(tuán)的酰胺類化合物。通過(guò)生長(zhǎng)速率法進(jìn)行抑菌活性測(cè)試,研究結(jié)果表明,部分化合物在50 mg·L-1濃度下對(duì)稻瘟病菌和番茄早疫病菌均具有良好的抑制活性,且抑菌率達(dá)到了80%以上(圖3)。萬(wàn)金林等[29]以5-氨基-1,3,4-噻二唑-2-硫醇為起始原料,設(shè)計(jì)合成了一系列從未報(bào)道的含1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的查爾酮縮氨基脲類化合物。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),該類化合物對(duì)水稻白葉枯病菌、煙草青枯病菌和柑橘潰瘍病菌均具有較好的抑制活性,部分化合物在100 mg·L-1濃度下對(duì)以上3種植物病菌的抑制率均達(dá)到100%(圖4)。 PATTANAYAK等[30]基于1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的活性,設(shè)計(jì)并合成出2-氨基-5-磺酰基-1,3,4-噻二唑類衍生物,經(jīng)初步活性測(cè)試結(jié)果表明,該類化合物具有良好抗焦慮、抗抑郁和抗驚厥活性(圖5)。薛蒙偉等[31]以二硫化碳和氨基硫脲為原料,設(shè)計(jì)并合成一系列2-氨基-5-巰基-1,3,4-噻二唑席夫堿類化合物,初步活性研究發(fā)現(xiàn),部分化合物對(duì)番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌和大豆灰斑病菌均表現(xiàn)出高于85%的抑制率(圖6)。目前,新型雜環(huán)酰胺類化合物的合成與相關(guān)藥物研發(fā)逐漸成為醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)?；谝陨戏治?本研究根據(jù)活性子疊加以及生物等排取代的原理,通過(guò)化學(xué)合成手段,將酰胺鍵引入到具有良好抑菌活性的1,3,4-噻二唑類化合物中,設(shè)計(jì)合成了6個(gè)含1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的酰胺類衍生物(圖7)。其結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、1H NMR以及HR-MS(ESI)確證,并用牛津杯法初步測(cè)試了化合物對(duì)霍亂弧菌及哈維氏弧菌的抑制活性。

圖1 2-氨基-5-(2,4-二氯苯氧基)甲基-1,3,4-噻二唑酰胺類化合物的結(jié)構(gòu)

圖2 2-氨基-5-芳基-1,3,4-噻二唑類化合物的合成路線

圖3 含1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的酰胺類衍生物的合成路線

圖4 含1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的查爾酮縮氨基脲類化合物的合成路線

圖5 2-氨基-5-磺?；?1,3,4-噻二唑類衍生物的結(jié)構(gòu)

圖6 2-氨基-5-磺酰基-1,3,4-噻二唑類化合物的合成路線

圖7 含1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的酰胺類衍生物的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X-4B型數(shù)字顯微熔點(diǎn)儀;WFH-203型三用紫外分析儀;AVANCE型核磁共振氫譜儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));Cary630型傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片);Agilent 6230型液質(zhì)聯(lián)用儀;SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)。

酰氯類化合物(98%,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司);六水合三氯化鐵(99%,上海阿拉丁試劑有限公司);硫酸鏈霉素(98%,上海麥克林生化科技有限公司);三乙胺(化學(xué)純,上海阿拉丁試劑有限公司),其余試劑均為分析純。

1.2 化合物的合成

(1) 2-取代-氨基硫脲類化合物(2)的合成

依次稱取硫代氨基脲(11 mmol)、取代醛類化合物1(10 mmol)于50 mL的圓底燒瓶中,加入20 mL的無(wú)水乙醇溶解。80 ℃油浴攪拌3 h, TLC檢測(cè)反應(yīng)至結(jié)束,冷卻至室溫,大量固體析出,靜置30 min,抽濾,用蒸餾水洗滌濾餅,得粗品,并用無(wú)水乙醇重結(jié)晶,得純品化合物2。

(2) 5-取代-1,3,4-噻二唑-2-胺類化合物(3)的合成

于50 mL圓底燒瓶中依次加入化合物2(6 mmol)、六水合三氯化鐵(12 mmol)及20 mL無(wú)水乙醇,80 ℃加熱回流8 h, TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)至結(jié)束,冷卻至室溫,倒入裝有40 mL蒸餾水的燒杯中,加入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氫氧化鈉水溶液,調(diào)節(jié)pH至8,用二氯甲烷(3×30 mL)萃取,取有機(jī)相,旋蒸除溶劑,得粗品,無(wú)水乙醇重結(jié)晶,得純品化合物3。

(3) 氯-N-(1,3,4-噻二唑-2-取代)酰胺類化合物(4a～4f)的合成

稱取化合物3(6 mmol)、酰氯類化合物(7.2 mmol)于50 mL圓底燒瓶中,加入15 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解,冰水浴下攪拌,加入3滴三乙胺至反應(yīng)液中,撤去冰水浴,繼續(xù)攪拌2 h, TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)至結(jié)束。向燒瓶中加入蒸餾水15 mL,有大量固體析出,靜置30 min,抽濾得濾餅。用二氯甲烷和甲醇重結(jié)晶,得純品目標(biāo)化合物4。

2-氯-N-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙酰胺(4a):白色固體,收率85.0%, m.p.239～240 ℃; IR(KBr),ν: 3417, 1698, 1596, 1415, 1385, 1066, 840, 774, 613 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.77(s, 1H, NH), 4.43(s, 2H, CH2), 2.63(s, 3H, CH3); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C5H7ClN3OS+{[M+H]+}191.9993, found 191.9969。

4-氯-N-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丁酰胺(4b):白色固體,收率87.0%, m.p.210～212 ℃; IR(KBr)ν: 3416, 1687, 1598, 1411, 1366, 848, 775, 678, 668 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.42(s, 1H, NH), 3.68(t,J=6.5 Hz, 2H, CH2), 2.63(d,J=7.3 Hz, 2H, CH2), 2.60(d,J=3.4 Hz, 3H, CH3), 2.08～2.01(m, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C7H11ClN3OS+{[M+H]+}220.0306, found 220.0288。

3-氯-N-(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙酰胺(4c):淺黃色固體,收率83.0%, m.p.206～208 ℃; IR(KBr)ν: 3447, 1688, 1594, 1418, 1365, 848, 777, 681, 648 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.42(s, 1H, NH), 3.68(t,J=6.5 Hz, 2H, CH2), 2.63(d,J=7.3 Hz, 2H, CH2), 2.60(d,J=3.4 Hz, 3H, CH3), 2.08～2.01(m, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C6H9ClN3OS+{[M+H]+}206.0150, found 206.0123。

2-氯-N-(1,3,4-噻二唑-2-基)乙酰胺(4d):白色固體,收率84.0%, m.p.194～196 ℃; IR(KBr)ν: 3414, 3058, 1711, 1597, 1400, 1364, 820, 776, 715, 603 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.95(s, 1H, NH), 9.23(s, 1H, thiadiazole), 4.46(s, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C4H3ClN3OS-{[M-H]-}175.9681, found 175.9694。

3-氯-N-(1,3,4-噻二唑-2-基)丙酰胺(4e):棕色固體,收率81.0%, m.p.177～178 ℃; IR(KBr)ν: 3443, 1600, 1423, 1384, 1137, 1067, 953, 825, 778, 619 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.71(s, 1H, NH), 9.18(s, 1H, thiadiazole), 3.90(t,J=6.2 Hz, 2H, CH2), 3.01(t,J=6.3 Hz, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C5H5ClN3OS-{[M-H]-}189.9836, found 189.9840。

4-氯-N-(1,3,4-噻二唑-2-基)丁酰胺(4f):白色固體,收率82.0%, m.p.174～175 ℃; IR(KBr)ν: 3417, 1687, 1597, 1444, 1385, 1138, 878, 797, 749, 699 cm-1;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.60(s, 1H, NH), 9.15(s, 1H, thiadiazole), 3.69(t,J=6.5 Hz, 2H, CH2), 2.65(t,J=7.3 Hz, 2H, CH2), 2.06(p,J=6.8 Hz, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C6H7ClN3OS-{[M-H]-}203.9992, found 204.0000。

1.3 待測(cè)定藥液的配制

待測(cè)樣品均用乙酸乙酯溶解,配制成濃度為2 mg·mL-1的1 mL樣品溶液,并以溶劑乙酸乙酯溶液1 mL作對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照藥硫酸鏈霉素用蒸餾水配置成1 mg·mL-1溶液。牛津杯外徑7.80 mm,對(duì)于抑菌圈直徑大于14 mm的化合物,用相應(yīng)的溶劑按二倍稀釋法進(jìn)行稀釋,進(jìn)一步測(cè)定其最小抑菌濃度(MIC)。

1.4 生物活性測(cè)定

預(yù)熱固體MH肉湯培養(yǎng)基,沸騰后取出。溫度稍低后,向每個(gè)平板中倒入約30 mL MH肉湯培養(yǎng)基,室溫靜置30 min,待其凝固。吸取活化后的菌懸液200 μL至固體培養(yǎng)基上,在酒精燈附近用涂布棒緩慢將菌液抹勻。靜置約10 min后,用鑷子夾取牛津杯垂直放置于平板規(guī)劃的位置,取200 μL待測(cè)樣品溶液于牛津杯孔徑中,每個(gè)樣品需做3次平行樣,在32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后測(cè)定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

表1研究結(jié)果表明,化合物4b對(duì)霍亂弧菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑為11.79±0.15 mm,化合物4a和4d對(duì)哈維氏弧菌的抑菌效果最好,最小抑菌濃度均達(dá)到了0.250 mg·mL-1。分析構(gòu)效關(guān)系表明,雜環(huán)噻二唑酰胺類衍生物的抗菌活性受連接酰胺鍵的脂肪鏈長(zhǎng)短的影響。鑒于此,今后的研究工作可以選擇噻二唑基團(tuán)的5位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。

表1 目標(biāo)化合物體外抑制哈維氏弧菌和霍亂弧菌的活性測(cè)試結(jié)果

3 結(jié)論

本文以醛類化合物為原料,與硫代氨基脲生成希夫堿類化合物,成環(huán)后生成1,3,4-噻二唑類衍生物,并與不同鏈長(zhǎng)的酰氯反應(yīng),合成6個(gè)含1,3,4-噻二唑結(jié)構(gòu)的酰胺類衍生物。抑菌活性結(jié)果表明:部分目標(biāo)化合物對(duì)哈維氏弧菌和霍亂弧菌表現(xiàn)出一定的抑制活性,其中化合物4b對(duì)霍亂弧菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑為11.79±0.15 mm,化合物4a和4c對(duì)哈維氏弧菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑分別為17.53±0.08 mm、 19.37±0.56 mm,且MIC均為0.250 mg·mL-1。構(gòu)效關(guān)系表明:酰胺鍵的脂肪鏈長(zhǎng)短對(duì)化合物的弧菌抑制活性影響較大,脂肪鏈越短活性越好。化合物4a、4b和4d可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究,為后續(xù)水產(chǎn)抗菌藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。