甲氰菊酯和高效氯氰菊酯殺蟲劑對(duì)搖蚊的聯(lián)合行為效應(yīng)

莊少如，魏鳳華，林宏杰，黃楚妍，劉夢(mèng)璇，陳子豪

（嘉應(yīng)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 梅州 514015）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，為了提高病、蟲、草等有害生物的防治效果和延緩抗藥性的產(chǎn)生，需要同時(shí)或先后使用多種農(nóng)藥[1]，這些農(nóng)藥經(jīng)過(guò)雨水沖刷、土壤滲透、地表徑流等途徑進(jìn)入水環(huán)境[2]，而這些化合物在水域中相互影響，相互作用，最終造成農(nóng)藥在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的復(fù)合殘留[3-4]。

目前多數(shù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究?jī)H考慮化合物在單獨(dú)暴露情況下的毒性，然而實(shí)際的環(huán)境復(fù)合體系大部分是由聯(lián)合作用模式的化合物組成，也就是說(shuō)生物往往暴露于復(fù)雜的復(fù)合污染體系中。即使單一化合物的濃度很低，但多數(shù)化合物產(chǎn)生的復(fù)合效應(yīng)也有可能會(huì)產(chǎn)生不容忽視的效應(yīng)水平[5]。研究表明，即使有些化合物濃度很低，但它們?cè)诨旌衔镏锌赡鼙憩F(xiàn)出更高的聯(lián)合毒性。孟順龍等[6]通過(guò)更新式靜態(tài)急性試驗(yàn)法，研究滅多威和辛硫磷對(duì)羅非魚的單一及聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)滅多威和辛硫磷的聯(lián)合毒性比單一滅多威或辛硫磷存在時(shí)更強(qiáng)，表現(xiàn)出協(xié)同作用。汪鵬鵬等[7]通過(guò)生化法測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性，發(fā)現(xiàn)辛硫磷和敵百蟲對(duì)斑馬魚的聯(lián)合毒性表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。蔣曼等[8]采用半靜態(tài)暴露法和生化法測(cè)定毒死蜱和甲萘威對(duì)斑馬魚的聯(lián)合毒性效應(yīng)。謝文平等[9]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，氯氰菊酯與辛硫磷混配對(duì)草魚的聯(lián)合毒性隨時(shí)間的延長(zhǎng)，拮抗作用越來(lái)越明顯。可見污染物之間的聯(lián)合作用模式復(fù)雜，可隨化合物類型、暴露濃度、混合比例以及有機(jī)體特性不同而變化[10]，因此在實(shí)際環(huán)境中應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)混合物體系的研究以及對(duì)復(fù)合污染的生態(tài)毒理學(xué)評(píng)估。

混合物的聯(lián)合作用模式主要包括加和、獨(dú)立、協(xié)同及拮抗作用[11]。由加和作用模型預(yù)測(cè)的混合物總毒性，理論上等于混合物中各組分毒性的總和。即使所有的組分都低于毒性閾值，混合物也可能由于加和效應(yīng)產(chǎn)生毒性[12]。另一方面，獨(dú)立作用模型可用于具有不同毒性作用模式的化合物，它們獨(dú)立影響生物體不同的作用靶點(diǎn)，因此各個(gè)組分的毒性不產(chǎn)生相互干擾。而協(xié)同和拮抗兩種模型主要應(yīng)用于化合物間由于相關(guān)作用而導(dǎo)致協(xié)同或拮抗作用的體系[13]。當(dāng)混合物的毒性大于其各個(gè)組分的毒性之和，即為協(xié)同，反之則為拮抗。

擬除蟲菊酯類殺蟲劑是從天然除蟲菊素衍生而來(lái)的有機(jī)化合物，是常用的一類廣譜殺蟲劑[14]，其銷售量占據(jù)了近20%的農(nóng)藥市場(chǎng)[15]。擬除蟲菊酯類殺蟲劑一般具有很強(qiáng)的親脂特性，大部分經(jīng)物理化學(xué)作用進(jìn)入水體沉積物或富集于生物體中[16]。擬除蟲菊酯類化合物進(jìn)入水環(huán)境后，由于水體受到污染，有毒物質(zhì)經(jīng)生物積累，通過(guò)食物鏈傳入水生動(dòng)物和人體中，致使水生生態(tài)環(huán)境受到破壞，并且危及魚類生存與人體健康[17]。

搖蚊是一種非常常見且具有高度耐受性的水生昆蟲，其生物量占水生底棲動(dòng)物的70%～80%[18]，同時(shí)搖蚊也是魚類的天然食物資源，在養(yǎng)魚事業(yè)和淡水水域生態(tài)平衡等方面都發(fā)揮著重要作用。由于搖蚊幼蟲對(duì)周圍水環(huán)境的變化很敏感，其常常作為水質(zhì)監(jiān)測(cè)和水生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的指示生物[19]。在如今日漸嚴(yán)重的農(nóng)藥水環(huán)境污染的背景下，研究它們?cè)跉⑾x劑不同暴露時(shí)間的毒性效應(yīng)，在理論和實(shí)踐層面都具有重要的意義[20]。

在對(duì)于混合物的聯(lián)合效應(yīng)研究上，大家更關(guān)注的是個(gè)體的死亡水平，而忽略了行為效應(yīng)。然而個(gè)體的行為相對(duì)于個(gè)體的死亡水平是更加敏感的指標(biāo)，對(duì)于評(píng)估農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)更具有現(xiàn)實(shí)意義。農(nóng)藥流入水體后可以通過(guò)昆蟲的口腔、體表等進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后作用于昆蟲的神經(jīng)或影響昆蟲的激素調(diào)節(jié)等等，從而影響昆蟲的活動(dòng)。擬除蟲菊酯能夠作用于搖蚊幼蟲，導(dǎo)致其行為變化，其中一項(xiàng)明顯的表現(xiàn)是幼蟲的正常筑巢節(jié)律遭到破壞。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于菊酯類農(nóng)藥對(duì)淡水中重要昆蟲搖蚊的聯(lián)合毒性的研究并不多，特別是對(duì)搖蚊的聯(lián)合效應(yīng)和聯(lián)合模式的解析。

本研究選擇常見有機(jī)污染物擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中主要使用的甲氰菊酯、高效氯氰菊酯殺蟲劑，開展甲氰菊酯與高效氯氰菊酯對(duì)搖蚊幼蟲行為抑制效應(yīng)的聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn)，對(duì)花翅搖蚊進(jìn)行不同濃度混合的毒性實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果可為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)搖蚊幼蟲的聯(lián)合行為效應(yīng)的深入開展提供理論基礎(chǔ)，以及為環(huán)境評(píng)估與治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GZX-300BS-Ⅲ型光照培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

甲氰菊酯乳油，含量20%，臺(tái)州市大鵬藥業(yè)有限公司；高效氯氰菊酯乳油，含量4.5%，青島好利特生物農(nóng)藥有限公司；硫酸鎂（MgSO4·7H2O），亞泰聯(lián)合化工有限公司；二水合硫酸鈣（CaSO4·2H2O），西隴科學(xué)股份有限公司；碳酸氫鈉（NaHCO3），鼎盛鑫化工有限公司；無(wú)水氯化鈣（CaCl2）、氯化鉀（KCl），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石英砂，天津市歐密化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花翅搖蚊的培養(yǎng)

根據(jù)美國(guó)EPA2000 標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)花翅搖蚊進(jìn)行培養(yǎng)[21]。配制搖蚊硬水（每配制12 L 純水中需加入0.738 g MgSO4·7H2O，0.759 g CaSO4·2H2O，0.115 2 g NaHCO3，0.60 g CaCl2，0.048 g KCl）；水質(zhì)指標(biāo)為電導(dǎo)率：330 ～360 μs/cm；pH：7.8 ～8.2；溶解氧＞2.5 mg/L；氨氮＜1.0 mg/L。以培養(yǎng)缸為容器，加入硬水以及當(dāng)作沉積物之用的原漿紙，在培養(yǎng)缸中放置大量搖蚊卵，并放入幾顆氣石進(jìn)行曝氣，培養(yǎng)缸上方用紗網(wǎng)罩住，防止羽化的成蟲逃逸。將培養(yǎng)缸放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱設(shè)置為光照時(shí)間：16 h光照，8 h黑暗；光照度應(yīng)為500 ～1 000 lx；溫度設(shè)置為（23 ± 1）℃。每天觀察氣石的曝氣，氣石需在水面以下，防止斷氣；每?jī)商煳故骋淮?，每?小勺魚食，喂食時(shí)注意蓋網(wǎng)，防止成蟲飛出。每周換一次水，換水時(shí)重點(diǎn)清理缸內(nèi)側(cè)藻類，換水前的硬水至少曝氣24 h。從缸中倒出后，先挑選蟲卵到干凈培養(yǎng)皿中，在換完水后加入缸中。培養(yǎng)缸加水量約為缸深度的1/2，水面距離紗網(wǎng)不低于5 cm。根據(jù)換水情況添加新紙，不舍棄舊紙。新紙?jiān)趽Q前使用硬水浸泡沖洗3 次，使用攪拌機(jī)打成碎塊，碎塊不宜過(guò)小。紙含量適中，建議在紙沉淀后，含量占缸高度的1/3 ～1/5。

1.2.2 生物暴露實(shí)驗(yàn)

用微量移液槍在通風(fēng)處移取農(nóng)藥，由于農(nóng)藥久置會(huì)分層，使用前應(yīng)該搖勻。用純水配制出甲氰菊酯三個(gè)不同的濃度分別為20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L，高效氯氰菊酯三個(gè)不同的濃度分別為500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L。

單一暴露實(shí)驗(yàn)：從對(duì)應(yīng)目標(biāo)濃度的試管中吸取20 μL 的農(nóng)藥溶液于50 mL 燒杯中，并用量筒量取20 mL 的硬水注入燒杯中。重復(fù)上述操作，同種殺蟲劑的每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣本，則每種農(nóng)藥需9個(gè)樣本，共計(jì)18 個(gè)農(nóng)藥樣本。完成甲氰菊酯和高效氯氰菊酯殺蟲劑所需的目標(biāo)實(shí)驗(yàn)濃度，甲氰菊酯農(nóng)藥的3個(gè)暴露濃度分別為20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L，高效氯氰菊酯農(nóng)藥的三個(gè)暴露濃度分別為500 μg/L、1 000 μg/L、2 000 μg/L。

聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn)：3 個(gè)暴露組分別為20 μg/L 甲氰菊酯（A）+ 500 μg/L高效氯氰菊酯（B）、40 μg/L甲氰菊酯（A）+ 1 000 μg/L 高效氯氰菊酯（B）、80 μg/L 甲氰菊酯（A）+ 2 000 μg/L 高效氯氰菊酯（B）。設(shè)置3 個(gè)重復(fù)樣本。

設(shè)置3個(gè)燒杯的空白對(duì)照組，以硬水作為對(duì)照。在每個(gè)燒杯中都添加少量石英砂以提供底棲環(huán)境。為了易于觀察和減少誤差，用一次性塑料滴管挑選體型適中、大小相差不大、健康的2齡期搖蚊幼蟲于燒杯中，每個(gè)燒杯皆放入十只幼蟲。觀察受試物對(duì)搖蚊幼蟲的行為抑制效應(yīng)，每24 h 觀察燒杯中搖蚊幼蟲在不同濃度的甲氰菊酯、高效氯氰菊酯溶液、甲氰菊酯和高效氯氰菊酯混合溶液內(nèi)的筑巢情況（蟲體二分之一以上的部位埋在石英砂下面為筑巢正常），統(tǒng)計(jì)筑巢率。在觀察期間，幼蟲應(yīng)該每天喂食。

2 結(jié)果與討論

2.1 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)搖蚊幼蟲的單一行為抑制效應(yīng)

將花翅搖蚊幼蟲在甲氰菊酯溶液和高效氯氰菊酯溶液中的筑巢率和對(duì)照組中花翅搖蚊幼蟲的筑巢率通過(guò)GraphPad Prism 軟件處理，繪制出搖蚊幼蟲在低濃度、中濃度、高濃度農(nóng)藥溶液中第2、4、6、8 天的筑巢率（圖1～圖4）。

圖1 甲氰菊酯（A）、高效氯氰菊酯（B）以及兩者混合物（A+B）第2天筑巢率

圖2 甲氰菊酯（A）、高效氯氰菊酯（B）以及兩者混合物（A+B）第4天筑巢率

圖3 甲氰菊酯（A）、高效氯氰菊酯（B）以及兩者混合物（A+B）第6天筑巢率

圖4 甲氰菊酯（A）、高效氯氰菊酯（B）以及兩者混合物（A+B）第8天筑巢率

實(shí)驗(yàn)中可以觀察到花翅搖蚊幼蟲在農(nóng)藥溶液中，中毒癥狀明顯，幼蟲移動(dòng)速度減慢，受刺激的應(yīng)激反應(yīng)減弱，且隨著濃度的增加癥狀加重。硬水中正常死亡的幼蟲身體卷曲，體色為黃白色，而在農(nóng)藥暴露下中毒而死的幼蟲身體僵直，體色變?yōu)榛揖G色。

結(jié)合圖1～圖4 可知，不同濃度的甲氰菊酯和高效氯氰菊酯對(duì)花翅搖蚊幼蟲的筑巢率均產(chǎn)生影響，較空白組明顯下降，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，農(nóng)藥濃度的增大，甲氰菊酯和高效氯氰菊酯對(duì)搖蚊幼蟲的行為抑制效應(yīng)越來(lái)越明顯。高效氯氰菊酯對(duì)花翅搖蚊幼蟲的行為抑制效應(yīng)整體上看比甲氰菊酯明顯，說(shuō)明高效氯氰菊酯的行為抑制效應(yīng)稍強(qiáng)于甲氰菊酯，其對(duì)搖蚊幼蟲神經(jīng)組織的損傷更大。在高濃度的高效氯氰菊酯中搖蚊幼蟲的筑巢率為0，而空白組的筑巢率正常。

2.2 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)搖蚊幼蟲的聯(lián)合行為抑制效應(yīng)

從圖1～圖4 可知，在甲氰菊酯和高效氯氰菊酯的混合溶液中，搖蚊幼蟲的筑巢率中、低、高濃度和2、4、6、8天均為0，并且從柱形圖也可看出，甲氰菊酯和高效氯氰菊酯混合溶液對(duì)搖蚊幼蟲的行為抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于單一暴露，說(shuō)明甲氰菊酯和高效氯氰菊酯對(duì)搖蚊幼蟲的不同濃度和不同暴露時(shí)間下的聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用（表1）。

表1 不同濃度和不同時(shí)間的混合農(nóng)藥對(duì)搖蚊幼蟲的聯(lián)合效應(yīng)模式

神經(jīng)系統(tǒng)是擬除蟲菊酯的主要作用部位，中毒的昆蟲通常有三個(gè)階段的癥狀：過(guò)度興奮→麻痹→死亡[22]。擬除蟲菊酯通過(guò)抑制腦突觸膜上的腺苷三磷酸酶（ATPs），導(dǎo)致乙酰膽堿酯酶（AChE）和其他神經(jīng)遞質(zhì)在突觸后膜上大量積聚，從而抑制腦內(nèi)的AChE，影響神經(jīng)傳導(dǎo)和突觸傳遞[23]，最終達(dá)到殺蟲的目的。根據(jù)酶抑制或誘導(dǎo)理論，一種化合物對(duì)混合體系中其他化合物代謝酶的抑制或誘導(dǎo)是拮抗或協(xié)同作用綜合效應(yīng)的重要原因[24]。高效氯氰菊酯和甲氰菊酯都屬于擬除蟲菊酯類化合物，高效氯氰菊酯是氯氰菊酯的高效異構(gòu)體，其毒性強(qiáng)于甲氰菊酯，二者均用于機(jī)體的同一部位，這也是甲氰菊酯和高效氯氰菊酯混合，其聯(lián)合毒性具有協(xié)同作用的原因。

3 結(jié)論

（1）甲氰菊酯與高效氯氰菊酯殺蟲劑在不同濃度以及不同暴露時(shí)間下均可對(duì)搖蚊幼蟲產(chǎn)生不同程度的行為抑制效應(yīng)，并且行為抑制效應(yīng)與兩種農(nóng)藥的暴露濃度、暴露時(shí)間有關(guān)。高效氯氰菊酯對(duì)搖蚊幼蟲的毒性強(qiáng)于甲氰菊酯。這是因?yàn)槎叨际菑某x菊素衍生而來(lái)的有機(jī)殺蟲劑，相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)使得它們的毒性總體上差別較小，高效氯氰菊酯的慢性毒性稍強(qiáng)些，這可能是由于花翅搖蚊幼蟲對(duì)其體內(nèi)高效氯氰菊酯的代謝分解能力較差的緣故。

（2）搖蚊幼蟲在甲氰菊酯和高效氯氰菊酯聯(lián)合暴露下，筑巢率為0，與單一暴露組、空白對(duì)照組相比，聯(lián)合暴露組對(duì)搖蚊幼蟲的行為抑制效應(yīng)更加明顯，說(shuō)明甲氰菊酯和高效氯氰菊酯的聯(lián)合毒性表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)。

（3）由于甲氰菊酯和高效氯氰菊酯屬神經(jīng)毒劑，主要作用于生物體的神經(jīng)系統(tǒng)，使受試生物的神經(jīng)組織遭受損傷，它們對(duì)搖蚊幼蟲的行為抑制效應(yīng)導(dǎo)致幼蟲的筑巢率顯著下降，且隨著受試物濃度越高、暴露天數(shù)越久，搖蚊幼蟲筑巢率下降的幅度越大；在甲氰菊酯和高效氯氰菊酯的混合溶液中，搖蚊幼蟲筑巢率為0，這說(shuō)明混合溶液對(duì)搖蚊幼蟲的行為抑制強(qiáng)于其單一作用，呈現(xiàn)協(xié)同作用，而空白組中幼蟲的筑巢率皆為正常。

通過(guò)對(duì)甲氰菊酯和高效氯氰菊酯聯(lián)合毒性的研究，可以發(fā)現(xiàn)兩種農(nóng)藥對(duì)搖蚊的聯(lián)合行為抑制效應(yīng)強(qiáng)于單一使用，即甲氰菊酯和高效氯氰菊酯的聯(lián)合毒性具有協(xié)同作用。因此在進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)考慮化合物產(chǎn)生的復(fù)合效應(yīng)，以提高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。