氧化應(yīng)激促進(jìn)MHCⅠ類分子膜轉(zhuǎn)位在CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞中的作用

毛漢瀟,王婧瑩,曾紫原, 潘映浩, 劉汝蘭, 熊霞, 何淵民

黑素細(xì)胞是位于表皮基底層的重要細(xì)胞,是決定膚色的關(guān)鍵細(xì)胞[1]。有研究表明,內(nèi)外環(huán)境作用下真表皮內(nèi)會產(chǎn)生更多的氧自由基,通過不同途徑導(dǎo)致黑素細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[2-3],并引起如白癜風(fēng)等皮膚色素性疾病的發(fā)生[4-5],其中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自身CD8+T細(xì)胞靶向殺傷黑素細(xì)胞是重要途徑,但至今氧化應(yīng)激啟動針對黑素細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)的具體作用過程及機(jī)制尚未完全闡明。主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ類分子是有核細(xì)胞提呈自身抗原肽供CD8+T細(xì)胞識別,從而啟動自身細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵信號分子[6-7]。在本研究中,筆者探究氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞MHC Ⅰ類分子膜轉(zhuǎn)位對CD8+T細(xì)胞靶向殺傷自身黑素細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人原代表皮黑素細(xì)胞(自提);黑素細(xì)胞專用254培養(yǎng)基(美國Portland公司);胎牛血清(美國Invitrogen公司);DEME培養(yǎng)基(美國Gibco公司);CCK-8試劑盒(上海碧云天公司);MHC class Ⅰ siRNA(美國Dhsrmacon公司);MHC class Ⅰ 抗體(英國Abcam公司);H2O2(美國Sigma-Aldrich公司)。

1.2研究方法

1.2.1分離與培養(yǎng)人原代黑素細(xì)胞 選取本院健康人包皮環(huán)切術(shù)后皮膚組織,浸泡于75%酒精5 min,以含氨芐青霉素(100 U/mL)和硫酸鏈霉素(100 mg/mL)的PBS多次反復(fù)清洗,在4 ℃下浸泡于Dispase液中過夜消化。分離得到表皮層后剪碎并以無菌濾網(wǎng)過濾收集細(xì)胞懸液,進(jìn)行消化,離心,收集下層細(xì)胞,以不含血清黑素細(xì)胞254培養(yǎng)基重懸,將細(xì)胞密度調(diào)定至約5×105接種于培養(yǎng)瓶中,置于CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長后采用S100及DOPA染色鑒定細(xì)胞純度。傳代3次后以純化的黑素細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2分離外周血效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞 取進(jìn)展期白癜風(fēng)患者外周血20 mL與1×PBS按照1∶1稀釋,加入淋巴細(xì)胞分離液后離心。離心后吸取離心管中從上而下第二層白色膜狀的PBMC,加入30 mL 1×PBS混勻后離心。離心后棄上清,加入2 mL 1 × 紅細(xì)胞裂解液重懸并靜置,加入30 mL 1 × PBS終止紅細(xì)胞裂解,混勻重懸后離心。棄去上清,加入1 × PBS重懸獲得PBMC單細(xì)胞懸液。將PBMC單細(xì)胞懸液以抗CD3和抗CD28包被的磁珠擴(kuò)增T細(xì)胞,最后采用流式細(xì)胞分選儀無菌分選CD8+T細(xì)胞,接種于24孔板用于后續(xù)實驗。

1.2.3黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建 以不同濃度梯度的H2O2分別處理細(xì)胞24 h,以CCK-8法檢測黑素細(xì)胞活性,每組5個樣本,完成3次重復(fù);以Annexin V-FITC和PI雙染細(xì)胞后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測黑素細(xì)胞凋亡比例。根據(jù)上述實驗結(jié)果選擇濃度為1.0 mmol/L的H2O2進(jìn)行實驗。CCK-8及凋亡檢測步驟按試劑盒說明操作。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA片段 黑素細(xì)胞接種于含無抗培養(yǎng)基的24孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說明操作。

1.2.5Western blot檢測 使用裂解液刮取細(xì)胞,離心,收集上清液并用BCA法測定目標(biāo)蛋白的濃度。進(jìn)行蛋白電泳,隨后通過濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h后孵育一抗4 ℃過夜,用TBST液體清洗后室溫孵育二抗1 h。顯影曝光,采集圖像并灰度分析,并重復(fù)3次。

1.2.6細(xì)胞凋亡率檢測 細(xì)胞經(jīng)過處理后,消化、離心,加入Binding Buffer、Annexin V-FITC和PI后在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7細(xì)胞和組織免疫熒光檢測 細(xì)胞經(jīng)處理后,使用4%多聚甲醛室溫固定;選取穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者及健康患者各10例,取皮膚組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、PBS洗滌后進(jìn)行抗原修復(fù);細(xì)胞及組織均室溫封閉1 h后一抗4 ℃過夜,PBS洗滌后室溫避光孵育1 h,采用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.2.8ELISA檢測 細(xì)胞經(jīng)共培養(yǎng)處理后,每組設(shè)置3個復(fù)孔,根據(jù)ELISA試劑盒使用說明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品濃度配置、孵育、洗滌,加入終止液后將96孔板置于全自動酶聯(lián)免疫分析儀進(jìn)行吸光度檢測。

2 結(jié)果

2.1氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞胞膜MHCⅠ類分子的表達(dá) 黑素細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的H2O2刺激24 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn),以濃度為1.0 mmol/L的H2O2刺激黑素細(xì)胞后,細(xì)胞ROS水平顯著升高,同時細(xì)胞活性約為75%(F=351.324,P<0.01),其表面MHCⅠ類分子表達(dá)顯著增高;倒置熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)1.0 mmol/L的H2O2處理黑素細(xì)胞膜24 h后,其膜表面MHCⅠ類分子熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),見圖1。

2.2氧化應(yīng)激下CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞的檢測 根據(jù)上述實驗結(jié)果,以1.0 mmol/L的H2O2刺激黑素細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型,刺激24 h后,使其與白癜風(fēng)患者外周血分選出的CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)12 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中顆粒酶B、穿孔素和TNF-α水平明顯增高(t=52.30、 85.59、 117.6,P<0.001),黑素細(xì)胞壞死比例顯著升高(t=11.18,P<0.01),見圖2。

Note:Compared with control group, **P<0.01,***P<0.001.

2.3氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黑素細(xì)胞MHC Ⅰ類分子膜轉(zhuǎn)位在CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞中的作用 使用siRNA干涉黑素細(xì)胞MHC Ⅰ類分子表達(dá),經(jīng)1.0 mmol/L的H2O2刺激黑素細(xì)胞24 h后與白癜風(fēng)患者外周血分選的CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激條件下抑制黑素細(xì)胞MHC Ⅰ類分子表達(dá)后,共培養(yǎng)體系中顆粒酶B、穿孔素和TNF-α釋放水平較未抑制MHC Ⅰ類分子表達(dá)組明顯降低(F=1 337.618、761.812、1 524.079,P<0.01),黑素細(xì)胞壞死比例下降(F=223.107,P<0.01),見圖3。

Note:Compared with each group, *P<0.05, **P<0.01; ***P<0.001, △△△P<0.001.

2.4正常人及白癜風(fēng)皮損處MHCⅠ類分子表達(dá)差異 與正常人皮膚組織相比,白癜風(fēng)患者皮損周圍組織黑素細(xì)胞膜表面MHCⅠ類分子熒光表達(dá)增強(qiáng),這表明白癜風(fēng)患者體內(nèi)黑素細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下其胞膜表面MHC Ⅰ類分子的表達(dá)增多,見圖4。

Note:The arrow points to MHC class Ⅰ molecular, Scale bar= 20 μm.

3 討論

黑素細(xì)胞是表皮中的重要細(xì)胞,具有合成黑色素的特殊生理功能,是決定人體膚色的主要細(xì)胞[8]。外界環(huán)境中的各種刺激會導(dǎo)致表皮內(nèi)ROS生成增加,黑素細(xì)胞合成黑素過程中,會生成大量ROS[9],進(jìn)而促進(jìn)黑素細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞針對自身黑素細(xì)胞的免疫應(yīng)答。目前國內(nèi)外對氧化應(yīng)激下CD8+T細(xì)胞靶向殺傷黑素細(xì)胞的具體機(jī)制研究較少,明確氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞死亡完整機(jī)制對白癜風(fēng)等色素脫失性疾病的治療及預(yù)防具有重要意義。既往國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)1.0 mmol/L的H2O2處理黑素細(xì)胞24 h是構(gòu)建黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激的最佳濃度[10],在本研究中觀察到以1.0 mmol/L的H2O2刺激黑素細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增高、細(xì)胞活性出現(xiàn)一定程度下降,說明1.0 mmol/L H2O2處理24 h,可以使黑素細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷。

MHC Ⅰ類分子是提呈自身抗原肽供CD8+T細(xì)胞識別的關(guān)鍵信號分子,其可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)結(jié)合自身抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜,成為CD8+T細(xì)胞識別并活化殺傷靶細(xì)胞的第一信號分子[6-7]。在本研究中,觀察到當(dāng)黑素細(xì)胞經(jīng)受氧化應(yīng)激時,其細(xì)胞膜表面MHC Ⅰ類分子表達(dá)升高;在與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,檢測到CD8+T細(xì)胞釋放的顆粒酶、穿孔素及TNF-α釋放水平升高,表明黑素細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激可促進(jìn)MHC Ⅰ類分子膜轉(zhuǎn)位,并增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞對黑素細(xì)胞的殺傷作用。當(dāng)抑制黑素細(xì)胞內(nèi)MHC Ⅰ類分子表達(dá)時,在共培養(yǎng)體系中顆粒酶、穿孔素及TNF-α水平明顯降低,說明CD8+T細(xì)胞對黑素細(xì)胞的殺傷力降低與MHC Ⅰ表達(dá)相關(guān)。既往有研究表明,機(jī)體應(yīng)激時CD8+T細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷力與抗原呈遞過程密切相關(guān)[11],而MHC Ⅰ類分子作為呈遞抗原的關(guān)鍵環(huán)節(jié),可直接影響CD8+T細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng);也有研究表明,上調(diào)MHC Ⅰ類分子表達(dá)可增強(qiáng)CD8+T對靶細(xì)胞的殺傷作用[12-13]。本研究的結(jié)果表明,氧化應(yīng)激條件下可促使黑素細(xì)胞MHC Ⅰ類分子膜轉(zhuǎn)位,進(jìn)而增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞對黑素細(xì)胞的殺傷作用。

黑素細(xì)胞氧化損傷涉及多種色素相關(guān)性疾病,如白癜風(fēng)。白癜風(fēng)是一種經(jīng)典的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡、啟動機(jī)體針對黑素細(xì)胞的異常免疫反應(yīng)并持續(xù)殺傷黑素細(xì)胞的疾病[14-15]。在本研究中,筆者進(jìn)一步對比了正常人皮膚與白癜風(fēng)患者皮損處黑素細(xì)胞膜表面MHC Ⅰ 類分子的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者皮損周圍黑素細(xì)胞膜表面MHC Ⅰ類分子表達(dá)升高,這進(jìn)一步證實了在白癜風(fēng)患者體內(nèi)可能存在黑素細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可以上調(diào)其表面MHC Ⅰ 類分子表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)CD8+T細(xì)胞對黑素細(xì)胞的靶向殺傷,促進(jìn)白癜風(fēng)的發(fā)生與進(jìn)展。本研究結(jié)果為白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制及治療方案開拓提供一定的線索,但未來尚需進(jìn)一步深入探索氧化應(yīng)激上調(diào)黑素細(xì)胞表面MHC Ⅰ類分子的具體機(jī)制。