香根草根系分泌物對阿特拉津脅迫的響應及對土壤中阿特拉津殘留的去除

張發(fā)明,王秋玲,楊樹春,李 良,榮渝虹,孫仕仙,鄭 毅,3②

(1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,云南 昆明 650201;2.西南林業(yè)大學濕地學院/國家高原濕地研究中心,云南 昆明 650233;3.云南開放大學云南鄉(xiāng)村振興教育學院,云南 昆明 650223;4.云南省動物疫病預防控制中心,云南 昆明 650201;5.西南林業(yè)大學園林園藝學院,云南 昆明 650233)

阿特拉津是一種三氮苯類除草劑,主要用于控制一年生闊葉雜草,如玉米、高粱和甘蔗等作物田間的雜草[1]。阿特拉津全球年使用量為7萬～9萬t[2],中國近年來年消費量為1萬～1.5萬t[3]。據(jù)報道,50%～90%的農(nóng)藥施用后直接到達非靶標植物或進入環(huán)境中,對土壤、水體和非靶標生物造成污染[4-5]。歐洲中部和波蘭土壤中阿特拉津及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的最高檢出濃度分別為0.124和1.64 mg·kg-1[6-7],我國農(nóng)田土壤中阿特拉津最高殘留量達2.48 mg·kg-1[8]。阿特拉津在自然條件下降解緩慢,半衰期為10～5 824 d[9]。阿特拉津在土壤中累積會造成作物死苗和減產(chǎn)[10]。而且,阿特拉津具有內(nèi)分泌干擾物和致癌物性質(zhì),經(jīng)食物鏈傳遞對人類健康構(gòu)成嚴重威脅[11-14]。開展阿特拉津污染土壤修復研究具有重要現(xiàn)實意義。

植物修復具有環(huán)境友好、成本低、操作簡便和無二次污染等優(yōu)點[15-16],是當今有機污染修復領域關注的焦點和未來發(fā)展的趨勢[5,17]。根系分泌物是有機污染物修復過程中的關鍵物質(zhì)。在植物修復過程中,植物通過向根際釋放根系分泌物,與根際微生物進行物質(zhì)交換和信息傳遞,加速土壤中污染物去除[18-19]。大量研究證明,在有植物的土壤中污染物降解效果更好[20-21],根系分泌物營造的根際微環(huán)境是有機污染物快速消減的重要原因[22]。例如,有機酸和氨基酸對土壤中結(jié)合態(tài)苯醚甲環(huán)唑和吡蟲啉有明顯的活化作用[23],蘇丹草根系分泌物改變了土壤中細菌和真菌種群數(shù)量與群落結(jié)構(gòu),促進有機氯農(nóng)藥的降解[24],黑麥草根系分泌物促進了多環(huán)芳烴降解菌的生長,使土壤中的芘含量顯著下降[22]。此外,研究表明小麥和狼尾草根系分泌物可以促進土壤中阿特拉津的解吸[25-26]。苜蓿根系分泌物組成和含量在阿特拉津脅迫下明顯改變,而且苜蓿根系分泌物能夠促進溶液中阿特拉津的去除[27]。

香根草(Chrysopogonzizanioides)是一種分布廣、生長迅速、生物量大、根系發(fā)達、對污染物耐受性強的多年生禾本科植物[28-29],已廣泛用于受污染水體和土壤環(huán)境的修復。例如,香根草可以吸收和有效去除環(huán)境中的重金屬(鉛、砷、鎘)、農(nóng)藥(撲草凈、硫丹)和抗生素(磺胺)等污染物[30-32],具有廣闊的運用前景。另外,香根草能夠促進旱地土壤和淹水土壤中阿特拉津的去除和降解[28,31]。近年來有學者通過水培試驗研究了四環(huán)素脅迫下的香根草根系分泌物[33],筆者前期研究也采用水培方法對撲草凈脅迫下的香根草根系分泌物進行了鑒定[34]。有研究表明,不同的生長環(huán)境通常會導致根系分泌物組分的差異,土培方式獲得的根系分泌物最接近真實情況[35]。但土培環(huán)境中,阿特拉津脅迫下的香根草根系分泌物特征尚不清楚,根系分泌物對阿特拉津的去除效果也有待研究。因此,該試驗旨在鑒定香根草根系分泌物,并明確香根草根系分泌物對土壤中阿特拉津的去除效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

阿特拉津標準品購自Dr.Ehrenstorfer GmbH(上海)公司。阿特拉津原藥(w=97%)購自美倫生物技術(shù)有限公司(大連)。試驗用土采自云南農(nóng)業(yè)大學后山農(nóng)場,屬于紅壤。土壤在室內(nèi)風干后過2 mm孔徑篩,除去石頭和植物殘體等雜物,經(jīng)氣相色濃度譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)檢測[36],該土壤阿特拉津背景值為0。香根草分蘗苗購自江西省紅壤研究所,幼苗移栽到苗床緩苗1個月以適應水土。

1.2 試驗設計

1.2.1香根草分泌物鑒定試驗

試驗設2個處理,即2 mg·kg-1阿特拉津 + 種植香根草(ATP)、0 mg·kg-1阿特拉津 + 種植香根草(CKP)。每個處理重復3次。ATP組中阿特拉津濃度設置以環(huán)境濃度和推薦濃度(3～6 mg·kg-1)為依據(jù)[8,37]。阿特拉津在試驗開始前一次性加入土壤,添加方法如下:稱取適量w=97%的阿特拉津原藥,充分溶解于裝有丙酮的1 L三角瓶中,向三角瓶中加入適量土壤,置于振蕩器中振蕩30 min(25 ℃、180 r·min-1),取出置于通風櫥中,直至丙酮完全揮發(fā),得到阿特拉津摻合濃度為200.00 mg·kg-1的土壤,將此土壤與適量無阿特拉津土壤均勻混合并逐級稀釋,得到阿特拉津摻合濃度為2.00 mg·kg-1的土壤。

試驗在云南農(nóng)業(yè)大學后山溫室大棚內(nèi)進行,晝夜周期為14 h∶10 h,試驗期間平均溫度為(23.08 ± 7.36)℃。移栽當天,從苗床選取表型一致的香根草分蘗苗,剪去部分莖葉至地上部高度為25.00 cm。先后用自來水和去離子水清洗根系,去除附著在表面的土壤。取125 g香根草苗(5～6株,表型基本一致)放入0.038 mm孔徑尼龍網(wǎng)袋(長和高分別為14和15 cm),袋內(nèi)填入500.00 g土壤(以干土計),將裝有土壤和香根草的尼龍網(wǎng)袋放入花盆(底徑、高度和口徑分別為17、22.5 和 22 cm),填入2 000.00 g土壤(以干土計)。ATP處理填裝2.00 mg·kg-1的阿特拉津摻合土壤,CKP處理填裝無阿特拉津土壤,尼龍網(wǎng)袋內(nèi)外填裝土壤一致。及時澆水,澆水量為田間持水量的90%。試驗期間定期補充水分,使盆內(nèi)土壤水分保持在田間持水量的60%左右。培養(yǎng)第60天收集香根草根系分泌物用于分泌物特征鑒定。

根系分泌物收集參考LIAO等[38]的方法。試驗第60天取出根袋,抖落附著在根系上的土壤,用自來水和超純水沖洗根系。將洗凈的根系浸沒于超純水配制的400 mL 0.5 mmol·L-1氯化鈣溶液中,用錫紙包裹瓶身避光,置于陽光下連續(xù)培養(yǎng)4 h。收集液過0.45 μm孔徑微孔濾膜,超純水定容至400 mL,4 ℃儲存。

1.2.2香根草分泌物降解土壤阿特拉津試驗

試驗設3個阿特拉津濃度水平:10、50和100 mg·kg-1。每個阿特拉津濃度水平設4個香根草根系分泌物添加水平(10、20、50和100 mg·kg-1)和1個對照(添加等量超純水),香根草根系分泌物添加量參考LIAO等[38]的試驗,每個處理重復3次。

取土壤中培養(yǎng)60 d的香根草,用超純水按照上述方法收集根系分泌物,并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃下對根系分泌物收集液進行濃縮,得到質(zhì)量濃度為270 mg·L-1的香根草根系分泌物,保存于-20 ℃冰箱中。

培養(yǎng)條件及采樣時間:每個處理稱取100 g老化(-20 ℃儲藏1個月)的阿特拉津污染土壤,裝入棕色玻璃瓶(底徑、高度和口徑分別為6.5、12.5和5 cm)。向玻璃瓶中添加香根草根系分泌物,調(diào)節(jié)土壤濕度至田間持水量的60%,30 ℃連續(xù)培養(yǎng)32 d。試驗期間用稱重法定期補充水分,使土壤濕度維持在田間持水量的60%。第4、8、16和32天破壞性采集土壤樣品,測定阿特拉津濃度、土壤pH值和微生物生物量碳(MBC)含量。

1.3 測定指標和方法

1.3.1根系分泌物鑒定

香根草根系分泌物提取:提取方法參考張建聰?shù)萚39]的報道。取50 mL二氯甲烷加入裝有根系分泌物的玻璃瓶,劇烈搖晃30 s,收集下層有機相。50 mL二氯甲烷重復提取上層水相,合并2次提取所得有機相,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃濃縮至近干,分別用3和2 mL二氯甲烷潤洗旋蒸瓶,潤洗液全部轉(zhuǎn)移至5 mL玻璃瓶,氮氣下吹干,HPLC級二氯甲烷復溶,渦旋10 s混勻,待GC-MS測定。

GC-MS條件:GC-MS參數(shù)設置參考羅麗芬等[40]的方法。以氦氣作為載氣,恒流模式,流速為1 mL·min-1;不分流模式進樣,進樣量1 μL;升溫程序:初始柱溫60 ℃(保持1 min),10 ℃·min-1上升至 325 ℃(保持10 min);進樣口溫度250 ℃;傳輸線溫度為280 ℃;離子源和四極桿溫度分別為230和150 ℃;電子能量為70 eV。

1.3.2土壤微生物生物量碳含量測定

土壤微生物生物量碳含量用氯仿熏蒸法測定[41]。稱取5 g培養(yǎng)32 d的鮮土,裝入50 mL離心管,用去乙醇氯仿真空下熏蒸24 h,同時做不熏蒸對照。熏蒸完畢加入20 mL 0.5 mol·L-1硫酸鉀溶液,25 ℃下以180 r·min-1振蕩30 min,以相對離心力(RFC)3 080離心5 min,上清液過0.45 μm微孔濾膜。濾液中有機碳含量用TOC分析儀測定。土壤微生物生物量碳含量以熏蒸和不熏蒸樣本的碳含量之差除以轉(zhuǎn)化系數(shù)0.45計算。

1.3.3土壤阿特拉津濃度測定

土壤阿特拉津濃度按照ZHANG等[31]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分泌物數(shù)據(jù)采用MSD ChemStation F.01.03.2357軟件進行處理。以質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST14作為檢索依據(jù),對香根草根系分泌物測定所得色譜圖進行檢索與核對分析,以匹配度≥90%作為篩選標準,確定香根草分泌物中化合物的組分?；衔锵鄬亢拖鄬孔兓捣謩e根據(jù)下式計算:

(1)

(2)

式(1)～(2)中,Ra為某類化合物相對含量;An為某類化合物總峰面積;AN為所有化合物總峰面積;ΔRa為某類化合物相對含量的變化值;TAA為阿特拉津脅迫處理香根草根系分泌物中某類化合物總峰面積;KAC為無阿特拉津處理香根草根系分泌物中某類化合物總峰面積。

用Excel 2021和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理、單因素方差分析和t檢驗,用Duncan檢驗評估顯著性水平為0.05時處理間的差異顯著性。圖表用Excel 2021和Origin 2021繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 香根草根系分泌物鑒定結(jié)果

香根草根系分泌物GC-MS掃描色譜圖見圖1,圖中基線無明顯漂移,且分泌物特征峰明顯,峰形對稱,響應值高,說明檢測結(jié)果可靠。

圖1 香根草根系分泌物GC-MS掃描總離子流色譜圖(TIC)

通過NIST譜庫檢索比對,在CKP處理的香根草根系分泌物中鑒定出15類88種化合物,在ATP處理的香根草根系分泌物中鑒定出15類83種化合物(附表1)。

表1 香根草根系分泌物中化合物種類及數(shù)量

2.2 阿特拉津脅迫下香根草根系分泌物數(shù)量的變化

如表1所示,CKP處理根系分泌物中化合物類別按數(shù)量由多到少排序依次為烷、烯、酯、酸、腈、酮、酰胺、醇和酚,其中占比前3位的烷(32.95%)、烯(19.32%)和酯(12.50%)占化合物總數(shù)的64.77%;ATP處理根系分泌物中化合物類別按數(shù)量由多到少排序依次為烷、烯、酯、醇、酰胺、酸、腈、酮和酚,其中烷、烯和酯占化合物總數(shù)的61.45%。與對照相比,阿特拉津脅迫下香根草根系分泌物類別整體上變化不大,但烷類化合物占比減少8.85百分點,烯類和醇類化合物占比分別增加4.78和3.82百分點。說明阿特拉津脅迫可能抑制烷類化合物的分泌,促進烯類和醇類化合物的分泌。

2.3 阿特拉津脅迫下香根草根系分泌物相對含量的變化

CKP和ATP處理香根草根系分泌物中化合物相對含量按類別排名前3位的依次為酰胺、腈和烯,這3類化合物相對含量占所有化合物含量的80%以上(表2)。此外,阿特拉津處理組中酰胺類和醇類化合物相對含量占所有化合物相對含量的比例顯著大于對照組,而腈類和酮類化合物相對含量占所有化合物相對含量的比例顯著小于對照組。從化合物相對含量變化的角度分析,阿特拉津脅迫增加了醇類和酚類化合物的相對含量,分別比對照增加123.45%和5.19%。相反,阿特拉津脅迫降低了腈、酮、酸、烷、烯、酯、胺和酰胺類化合物的相對含量(圖2)。說明阿特拉津脅迫可能會提高香根草中醇類和酚類化合物的分泌量,但降低其他類化合物的分泌量。

表2 香根草根系分泌物相對含量

圖2 阿特拉津脅迫下香根草根系分泌物的變化

2.4 香根草根系分泌物對土壤中阿特拉津的去除

由圖3可見,不同阿特拉津污染水平下,10、20、50和100 mg·kg-1香根草根系分泌物添加處理均顯著提高了土壤中阿特拉津的去除率(P<0.05)。10、50、100 mg·kg-1阿特拉津污染水平處理組分別比對照提高9.18%～15.57%、5.51%～11.72%和9.43%～16.99%。當分泌物添加量不超過50 mg·kg-1時,土壤中阿特拉津去除率整體上隨分泌物添加量增加而提高。當分泌物添加量超過50 mg·kg-1時,第32天土壤中阿特拉津去除率低于其他分泌物添加水平,但顯著大于對照(P<0.05)。

同一幅圖中同組直方柱上方英文小寫字母不同代表同一時間不同分泌物添加水平間去除率差異顯著(P<0.05)。

2.5 香根草根系分泌物對土壤pH值和微生物生物量碳含量的影響

在10、50 和100 mg·kg-13個阿特拉津污染濃度下,土壤pH值整體隨根系分泌物添加量增加而提高(圖4),分別比對照提高0.68%、1.53%和1.50%,其中100 mg·kg-1處理與對照差異達顯著水平(P<0.05)。另外,土壤pH值隨阿特拉津濃度增加而顯著增加(P<0.05)。試驗結(jié)果說明添加香根草根系分泌物和阿特拉津能夠提高土壤pH值。

同一幅圖中同組直方柱上方英文小寫字母不同代表同一阿特拉津(ATZ)濃度下不同分泌物添加水平間某指標差異顯著(P<0.05)。

添加香根草根系分泌物后土壤微生物生物量碳含量變化見圖4。10、50和100 mg·kg-1阿特拉津污染濃度下,20、50 和100 mg·kg-1香根草根系分泌物添加處理的土壤微生物生物量碳含量隨根系分泌物添加量增加而顯著提高(P<0.05),而且均顯著大于對照(P<0.05)。香根草根系分泌物添加量為100 mg·kg-1時,10、50 和100 mg·kg-1阿特拉津污染土壤中土壤微生物生物量碳含量分別比對照提高88.86%、122.93%和134.40%。另外,土壤中阿特拉津濃度增加,土壤微生物生物量碳含量隨之顯著增加(P<0.05)。試驗結(jié)果說明香根草根系分泌物能夠促進土壤微生物生長,而且土壤微生物活性也受到阿特拉津刺激。

3 討論

3.1 阿特拉津脅迫對香根草根系分泌物組分和相對含量的影響

GC-MS在植物根系分泌物的檢測和鑒定中已經(jīng)得到廣泛運用[40,42]。該研究利用GC-MS對阿特拉津脅迫下的香根草根系分泌物進行鑒定,共鑒定出83種化合物,主要包括烷、烯、酯、醇、胺、脂肪酸、酮和酚。研究表明,根系分泌物組成受多種因素影響,除植物種類外,還與栽培環(huán)境和植物發(fā)育階段等因素有關[43]。RATHINAVELU等[44]研究發(fā)現(xiàn),不同條件下香根草根系分泌物組分不同,主要有碳氫化合物、酯類、酮類和酚類。黃京華等[45]通過GC-MS鑒定香根草根系揮發(fā)性物質(zhì),結(jié)果表明其主要成分是烯、醇、酮和烷。石傲傲[34]利用GC-MS在水培的香根草分泌物中鑒定出22種化合物,主要包括烷、酯、醇、苯和酸。水培條件下香蒲根系分泌物中檢出的化合物種類主要包括烷、烯、酯、胺、醇、酚、酮和有機酸,其中烷類化合物種類最多且相對含量最高[46]。相較而言,筆者鑒定出的香根草根系分泌物種類和數(shù)量更多。香根草作為一種水陸兩棲的多年生植物,可生長于淹水土壤環(huán)境中(如濕地和湖河淺灘等)。為了更深入理解香根草修復阿特拉津污染土壤的機理,未來的研究有必要對淹水土壤中阿特拉津脅迫下的香根草根系分泌物特征進行研究。

根系分泌物是植物與微生物之間交流的信號,在根際微生態(tài)系統(tǒng)的遷移轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用[18],而污染物脅迫通常導致植物分泌物發(fā)生變化,這種變化是植物對有害物質(zhì)的應激反應,有利于污染物分解[47]。研究發(fā)現(xiàn),污染物脅迫下,根系分泌物數(shù)量會增加[46,48],但該試驗中阿特拉津脅迫導致香根草根系分泌物數(shù)量出現(xiàn)小幅下降。推測植物根系分泌物數(shù)量與試驗時間跨度有關,隨著試驗時間的延長,植物根系和環(huán)境中污染物濃度下降,對植物的脅迫減弱,因而分泌物數(shù)量變化較小。然而,經(jīng)過60 d培養(yǎng),阿特拉津脅迫減少了烷類化合物數(shù)量,增加了烯類和醇類化合物數(shù)量。說明即使在低濃度污染物脅迫下,植物仍然會調(diào)整根系分泌物的組分來適應不利環(huán)境。

遭受污染物脅迫時,植物不僅能夠改變根系分泌物種類,還能夠調(diào)節(jié)分泌物含量來響應不利環(huán)境[18]。阿特拉津脅迫下,香根草根系分泌物中醇和酚的相對含量增加,腈、酮、酸、烷、烯、酯、胺和酰胺類化合物的相對含量降低。研究表明,在鹽分和其他非生物脅迫下,多酚化合物的合成和積累通常被誘導,這與酚類化合物有較強的抗氧化活性有關[49],而且酚對植物促生菌的繁殖起到促進作用,有助于改善土壤細菌群落結(jié)構(gòu)[50]。該試驗中相對含量最大的酰胺類物質(zhì)屬于弱堿性物質(zhì),有助于提高根際土壤pH值。另外,污染物脅迫下,植物分泌的有機酸、氨基酸和可溶性糖通常會明顯增加[48-49],而該試驗中未檢測到這些物質(zhì)的存在,這可能與培養(yǎng)時間和檢測方法等因素有關,有待進一步研究。

3.2 香根草根系分泌物對土壤中阿特拉津去除的影響

根系分泌物的流動提高了許多常見代謝物的局部濃度,不僅可以改變土壤理化性質(zhì)及微生物活性,還會影響土壤-植物界面的許多生理生化過程,直接或間接提高植物抗逆性[49]。該試驗中,香根草根系分泌物顯著提高了土壤中阿特拉津的去除率,原因可能在于根系分泌物改善了土壤性質(zhì),為微生物提供了更好的生長環(huán)境[51-52]。添加香根草根系分泌物后,土壤微生物生物量碳含量顯著增加,也說明根系分泌物為微生物的生長繁殖提供了適宜的環(huán)境。另外,根系分泌物對阿特拉津的去除表現(xiàn)為適宜濃度促進,高濃度抑制。原因可能在于高濃度根系分泌物打破了細菌群落原有的平衡,導致群落多樣性降低,活性受到抑制[38]。

4 結(jié)論

(1)在無阿特拉津和阿特拉津脅迫的香根草根系分泌物中分別檢測到88和83種化合物,包括烷、烯、酯、酸、腈、酮、酰胺、醇和酚等。按各類化合物數(shù)量高低排序,前3位為烷、烯和酯;按各類化合物相對含量高低排序,前3位為酰胺、腈和烯。

(2)阿特拉津脅迫改變了香根草根系分泌物組分和含量。阿特拉津脅迫增加烯類和醇類化合物數(shù)量,減少烷類化合物數(shù)量;阿特拉津脅迫顯著增加醇類和酚類化合物的相對含量,降低腈、酮、酸、烷、烯、酯、胺和酰胺類化合物的相對含量。

(3)香根草根系分泌物顯著提高土壤阿特拉津去除率。在10～50 mg·kg-1添加范圍內(nèi),阿特拉津去除率隨根系分泌物添加量增加而顯著提高。