玉米接種叢枝菌根真菌后對土壤鉛污染的耐受效應(yīng)

楊怡森,孫晨瑜,馬俊卿,覃圣峰,周勛波,3,黃京華,3①

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣西 南寧 530004;2.廣西高校作物栽培學(xué)與耕作學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530004;3.廣西大學(xué)植物科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,廣西 南寧 530004)

土壤中的超量汞、鎘、鉻、鉛等重金屬導(dǎo)致農(nóng)田作物生長受到影響[1-2]。重金屬污染導(dǎo)致的作物產(chǎn)量和品質(zhì)降低所造成的經(jīng)濟(jì)損失每年可達(dá)200億元[1-2]。重金屬脅迫下玉米的根系活力降低,光合能力減弱,鮮重下降,且在高濃度鉛脅迫下會使籽粒蛋白質(zhì)和氨基酸含量減少,同時(shí)貯存在籽粒中的鉛通過食物鏈進(jìn)入人體富集后使免疫、循環(huán)系統(tǒng)受損,影響人體健康[3]。因此,如何有效修復(fù)重金屬污染土壤,保證作物正常生長及人體健康,這些問題日漸受到關(guān)注并亟待解決。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)能與植物根系建立共生體系,形成地下菌絲網(wǎng)絡(luò)[4],使土壤中部分重金屬被固定在真菌體內(nèi),從而降低重金屬對植物的毒害作用[5]。此外,AMF與植物共生可增加根系長度、表面積及直徑[6],促進(jìn)其對氮、磷、鉀等礦物元素的吸收[7],提高植物葉綠素含量、光合速率、蒸騰速率等光合生理指標(biāo)以及植物抗氧化酶活性[8],使植物的生物量增加,促進(jìn)植物生長,因此菌根-植物聯(lián)合修復(fù)現(xiàn)已成為熱門研究方向。

玉米屬于C4代謝作物,具有適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)、應(yīng)用價(jià)值高等特點(diǎn),在我國南北方皆可種植。故可采用玉米-叢枝菌根真菌來改善重金屬污染土壤。由于農(nóng)田污染土壤重金屬種類較為復(fù)雜,無法對單一重金屬進(jìn)行研究,因此采用盆栽方法模擬種植。目前,模擬土壤重金屬污染的研究多通過外源添加方式進(jìn)行[9],而礦區(qū)農(nóng)田污染土壤中的重金屬經(jīng)長期干濕交替并與土壤多種化合物結(jié)合,使重金屬有效性降低,因此對植物的毒性也與外添加不同[10],使得土壤老化與否對接種AMF的植物毒害效果有較大差異。未進(jìn)行土壤老化的試驗(yàn)結(jié)果無法準(zhǔn)確模擬礦區(qū)污染土壤接種AMF的效果。因此,筆者先對土壤中外源添加的Pb(NO3)2老化,之后以盆栽的方式研究不同濃度鉛污染條件下接種AMF對玉米生長生理及抗逆性的影響,為菌根-植物聯(lián)合修復(fù)污染土壤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

玉米(“桂單0810”)由廣西農(nóng)科院玉米研究所育成提供。供試菌種(內(nèi)生菌根):地表球囊霉(Glomusversiforme,Gv)由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)提供;摩西管柄囊霉(FunneliformismosseaeNM02A,Fm)、幼套近明球囊霉(ClaroideoglomusetunicatumHEB04和HEBN02A混合,Ce)購自中國叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(BGC),以玉米做宿主擴(kuò)繁所得菌沙中孢子密度約為80個(gè)·g-1。

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)土壤鉛含量:0、170、570、970 mg·kg-1,每個(gè)含量下設(shè)單接種AMF(Fm、Gv、Ce)和不接種(NM)處理,每個(gè)處理重復(fù)3次。

基質(zhì)(2 kg·盆-1)為土壤和河沙(質(zhì)量比1∶1)的混合物。土壤取自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田(22°51′15″ N,108°18′4.9″ E),河沙購于當(dāng)?shù)亟ú氖袌觥Ｍ寥琅c河沙經(jīng)過篩、滅菌后備用。土壤pH值為7.4,w(速效氮)為32.6 mg·kg-1,w(有效磷)為15 mg·kg-1,w(有機(jī)質(zhì))為16.9 g·kg-1。原始土壤w(鉛)為30.6 mg·kg-1,每盆基質(zhì)中加40 mL不同濃度的Pb(NO3)2溶液,老化15 d后每盆加40 g菌沙(約3 200個(gè)孢子),對照組加等量滅菌的菌沙,播種2顆玉米。每周澆50 mL霍格蘭營養(yǎng)液,1周后間苗至1株·盆-1,至抽雄期(生長65 d)取樣待測。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1農(nóng)藝性狀

株高用直尺測量;葉綠素含量用葉綠素儀(CCM-300,美國OPTI-science公司)測定;植株鮮重先取樣洗凈,吸干水分后從莖基部剪下根系,分別測定地上和地下部鮮重。

1.2.2菌根侵染率

取20個(gè)1 cm的根段,用墨水醋酸染色法進(jìn)行染色觀察,測定菌根侵染率[11]。

1.2.3生理生化指標(biāo)

采用氮藍(lán)四唑光還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性;愈創(chuàng)木酚-過氧化氫法測定過氧化物酶(POD)活性;紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性;磺基水楊酸法測定脯氨酸含量;考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定可溶性蛋白含量;硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛(MDA)含量[12]。

1.2.4植株鉛含量

鉛含量參照GB 5009.268—2016用ICP-MS測定[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析(α=0.05),并用Origin 2021作圖,圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施鉛含量下玉米根系的菌根侵染率

施鉛促進(jìn)AMF與玉米根系共生,除接種Fm的玉米菌根侵染率在施鉛含量大于170 mg·kg-1后隨施鉛含量的升高而降低外,其余2種接菌處理的菌根侵染率均隨施鉛含量的升高而增加,但在施鉛含量大于170 mg·kg-1后菌根侵染率增幅減少(圖1)。接種Fm、Ce、Gv相比無鉛污染處理侵染率分別提高15%～25%、32%～36%和17%～23%。

NM—對照,Fm—接種摩西管柄囊酶,Ce—接種幼套近明球囊酶,Gv—接種地表球囊酶。

2.2 不同施鉛含量下接種AMF對玉米生長的影響

隨施鉛含量的提高,NM組玉米的株高和鮮重先增后降,在施鉛含量為970 mg·kg-1時(shí)受到抑制;相比同含量NM處理,AMF和玉米共生使玉米莖葉、根系鮮重均顯著高于同含量下NM處理,增加量達(dá)50%,表明接種AMF對鉛脅迫有緩解作用。在施鉛含量為170 mg·kg-1時(shí),僅接種Fm可顯著提高葉綠素含量;在施鉛含量為570 mg·kg-1時(shí)接種AMF均顯著提高葉綠素含量,說明AMF共生能使葉綠素含量維持在較高水平(圖2)。

NM—對照,Fm—接種摩西管柄囊酶,Ce—接種幼套近明球囊酶,Gv—接種地表球囊酶。

2.3 不同施鉛含量下接種AMF對玉米莖葉、根系鉛含量的影響

在施鉛含量為0 mg·kg-1時(shí)玉米體內(nèi)未檢測到鉛。AMF和玉米共生顯著降低莖葉鉛含量,在施鉛含量為570和970 mg·kg-1時(shí)莖葉鉛含量降低50%(圖3)。相比NM處理,當(dāng)施鉛含量為170 mg·kg-1時(shí)接種AMF使根系鉛含量顯著增加44.21%～405.24%;在施鉛含量為570和970 mg·kg-1時(shí)接種Fm、Ce后,根系鉛含量分別降低31.56%和53.71%(圖3)。計(jì)算轉(zhuǎn)移系數(shù)發(fā)現(xiàn),同一施鉛含量下接種AMF顯著降低玉米體內(nèi)鉛的轉(zhuǎn)移系數(shù),抑制鉛向地上部轉(zhuǎn)移,降低對玉米的毒害。

NM—對照,Fm—接種摩西管柄囊酶,Ce—接種幼套近明球囊酶,Gv—接種地表球囊酶。同一組直方柱上方英文小寫字母不同表示

2.4 不同施鉛含量下接種AMF對玉米抗氧化能力的影響

2.4.1接菌對玉米MDA含量的影響

隨著施鉛含量的升高,NM組玉米葉片、根系MDA含量不斷增加(表1)。相同施鉛含量下接種AMF的玉米葉片、根系MDA含量增加。但在施鉛含量為170 mg·kg-1時(shí),相比同含量NM處理,接種Fm、Gv使葉片MDA含量分別降低24.4%和53.9%。施鉛含量為970 mg·kg-1時(shí)接種Fm后葉片MDA含量顯著降低45.2%,說明接菌在該條件下緩解細(xì)胞膜脂過氧化程度。接種AMF后根系中的MDA含量則顯著增加,其中接種Gv增加最多。相比未接菌處理,在施鉛含量為0、170、570和970 mg·kg-1下接種AMF處理,玉米MDA含量分別顯著增加157.6%、100%、151.5%和57.6%,表明接菌未減輕根系膜脂過氧化程度。

表1 不同施鉛含量下接種AMF后玉米體內(nèi)丙二醛含量

2.4.2接菌對玉米抗氧化酶活性的影響

在施鉛含量為0 mg·kg-1時(shí)接種Fm和Gv顯著減低葉片SOD活性。鉛污染條件下,接種Ce、Gv顯著減低葉片SOD活性(圖4)。隨著施鉛含量升高,NM組中根系SOD活性在970 mg·kg-1時(shí)下降。相比相同施鉛含量NM處理,玉米與菌根共生顯著提高根系SOD活性,在施鉛含量為970 mg·kg-1時(shí)接菌效果最佳,說明施鉛含量高時(shí)接菌對提高根系抗脅迫的作用更顯著。

NM—對照,Fm—接種摩西管柄囊酶,Ce—接種幼套近明球囊酶,Gv—接種地表球囊酶。

隨著施鉛含量增加,NM組中玉米葉片POD活性在170 mg·kg-1下增加,570、970 mg·kg-1降低;相比相同施鉛含量NM處理,玉米與菌根共生顯著提高葉片POD活性。隨施鉛含量增加,NM組中玉米根系POD活性在170 mg·kg-1時(shí)受抑制;相比相同施鉛含量NM處理,接種AMF顯著提高根系POD活性,但施鉛含量為970 mg·kg-1時(shí)接種Gv后POD活性下降。

相比相同施鉛含量NM處理,接種AMF提高葉片CAT活性。隨著施鉛含量增加,NM組中根系CAT活性在170、570 mg·kg-1時(shí)降低,970 mg·kg-1時(shí)增加。相比相同施鉛含量NM處理,在施鉛含量為570 mg·kg-1時(shí)接種AMF后CAT活性顯著提高,970 mg·kg-1時(shí)僅接種Ce后CAT活性顯著提高。

2.5 接菌對玉米脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

脯氨酸和可溶性蛋白是參與玉米滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)。隨著施鉛含量升高,NM組中葉片、根系脯氨酸含量降低。相比相同施鉛含量NM處理,接種AMF使葉片脯氨酸含量下降0.8%～37.5%(表2)。相比相同施鉛含量NM處理,在0和570 mg·kg-1下接種AMF使根系脯氨酸含量分別顯著降低9.0%～21.6%、14.2%～20.1%。

表2 不同施鉛含量下接種AMF的玉米體內(nèi)脯氨酸含量

隨著施鉛含量增大,NM組中葉片、根系可溶性蛋白含量先增加后降低。相比相同施鉛含量NM處理,接種Ce和Gv增加葉片可溶性蛋白含量(表2)。相同施鉛含量下接種AMF可顯著增加根系可溶性蛋白含量(141.8%～660.8%),增強(qiáng)根系的保水能力,但隨施鉛含量的升高,可溶性蛋白增加量有所降低,說明施鉛含量的增加抑制了AMF的作用。

3 討論

農(nóng)田土壤中重金屬含量過高會對作物生長產(chǎn)生明顯毒害作用,其中鉛具有毒性強(qiáng)、污染面積大等特點(diǎn),被認(rèn)為是我國土壤污染的主要污染物之一[14]。研究發(fā)現(xiàn)鉛脅迫下植物株高、干鮮重下降,抗氧化系統(tǒng)受損,抑制植物生長[15]。EKMEK?I等[16]研究發(fā)現(xiàn),外源施加Pb(NO3)2為414 mg·kg-1時(shí)便可抑制植株生長,降低玉米干重和根莖長度。筆者研究中,外源Pb(NO3)2老化后在鉛含量達(dá)到970 mg·kg-1時(shí)對玉米株高、鮮重產(chǎn)生抑制。植物機(jī)體受到脅迫等傷害時(shí)通過SOD、POD、CAT等抗氧化酶轉(zhuǎn)化體內(nèi)應(yīng)激產(chǎn)物如H2O2和O2·-等為無毒或低毒的物質(zhì),降低對植物的損傷[17]。外源鉛脅迫(100 mg·kg-1)導(dǎo)致玉米根系和葉片中抗氧化酶活性比對照降低50%[18],而在該試驗(yàn)中玉米葉片POD、CAT活性在施鉛含量為970 mg·kg-1時(shí)受到抑制,這是由老化后土壤鉛的有效性降低所致。

叢枝菌根真菌通過菌絲體和孢子來束縛重金屬向植物地上部轉(zhuǎn)移,此外AM菌絲可促進(jìn)土壤有機(jī)物的釋放,借助AMF和微生物所建立的復(fù)雜微生物菌根網(wǎng)絡(luò),植株根際土壤的細(xì)菌等微生物豐度得到提高,促進(jìn)微生物的代謝和土壤養(yǎng)分循環(huán)[19],提高植物根系對土壤養(yǎng)分吸收,增強(qiáng)對重金屬脅迫的抗性,進(jìn)而促進(jìn)植物生長[20]。重金屬脅迫下接種根內(nèi)球囊霉(Rhizophagusintraradices,Ri)顯著提高玉米生物量,同時(shí)增強(qiáng)玉米根系對重金屬的固持效果,降低重金屬對玉米的毒害作用[21]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在施鉛含量為570、970 mg·kg-1下菌根共生時(shí),在叢枝菌根真菌的菌絲體和孢子的作用下莖葉鉛含量降低,根系鉛含量增加,抑制鉛往地上部轉(zhuǎn)移,降低對玉米毒害,這與前人研究結(jié)果[22]一致。鉛污染條件下接種AMF使玉米葉片葉綠素含量增加3.9%～15.3%,光合作用增強(qiáng),玉米株高和生物量顯著提高,促進(jìn)玉米生長,這與張春楠等[23]研究結(jié)果基本一致。

接種AMF能不同程度提高植物抗氧化能力,鉛脅迫下接種Fm和Ri對刺梅(Robiniapseudoacacia)葉片SOD活性有促進(jìn)作用,但MDA含量卻降低,POD含量無顯著變化[24]。YANG等[25]發(fā)現(xiàn)鉛脅迫下接種Fm增加玉米葉片的SOD和CAT含量,該試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)接種Fm、Ce、Gv可提高玉米SOD、POD、CAT活性,增強(qiáng)其對活性氧的清除能力,保證細(xì)胞正常生長,但在 970 mg·kg-1下接種Fm和Gv使CAT活性下降,僅接種Ce提高CAT活性,可能是高濃度鉛污染使玉米根系受損的同時(shí)影響菌根生長,因而未能起到促進(jìn)作用。

植物吸收重金屬使體內(nèi)MDA含量增加,細(xì)胞膜脂過氧化程度加劇[26]。筆者試驗(yàn)中,接種AMF后玉米體內(nèi)MDA含量居高不下,可能是因?yàn)榻泳缶鶑挠衩左w內(nèi)奪取養(yǎng)分,加劇玉米細(xì)胞的受損狀況,因此MDA含量增加。

脯氨酸和可溶性蛋白是玉米滲透調(diào)節(jié)的重要貢獻(xiàn)者,接菌并未降低玉米體內(nèi)脯氨酸含量,但可溶性蛋白含量比不接菌植株顯著增加,可溶性蛋白的增加使玉米滲透調(diào)節(jié)能力增強(qiáng),提高保水能力,保證細(xì)胞中各生化反應(yīng)的正常進(jìn)行,提高玉米對重金屬的耐性,這與SHENG等[27]研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

外源施加Pb(NO3)2經(jīng)過老化后對玉米毒性降低,只有w(鉛)較高(970 mg·kg-1)時(shí)才對玉米生長造成脅迫作用,玉米生長受到明顯抑制。鉛污染條件下,菌根侵染率提高,菌根共生顯著提高土壤鉛污染條件下玉米的株高、鮮重及葉綠素含量,降低鉛轉(zhuǎn)移系數(shù),緩解鉛對玉米的損傷,促進(jìn)玉米的生長;鉛污染條件下玉米抗氧化能力降低,而接種AMF通過提高玉米葉片和根系SOD、POD、CAT活性及可溶性蛋白含量,提高抗氧化和保水能力,從而增強(qiáng)玉米對重金屬鉛污染的抗性,保證其在鉛污染土壤中的正常生長。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土壤老化后,僅在鉛含量為970 mg·kg-1時(shí)對玉米產(chǎn)生一定的抑制作用,因此后續(xù)試驗(yàn)中需提高鉛含量,以確定玉米接種AMF后所能承受的最大鉛脅迫濃度,為AMF在污染農(nóng)田的使用提供依據(jù),了解接種AMF對土壤微生物的影響,同時(shí)從分子角度研究接菌后不同生理指標(biāo)產(chǎn)生變化的原因,以揭示鉛脅迫下叢枝菌根真菌共生提高玉米抗性的機(jī)制。