利用實(shí)驗(yàn)室病原微生物抽檢控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量

汪 斌，王 倩

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院科研處實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，武漢 430100）

作為建立人類疾病模型篩選評(píng)價(jià)的重要載體，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是從事科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢定等工作的重要工具，在生命醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中起重要作用［1-3］。小鼠基因組與人類高度同源，且小鼠生殖能力強(qiáng)、繁育快、飼養(yǎng)成本低，因此是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中重要的模式動(dòng)物［4，5］，但是實(shí)驗(yàn)小鼠在生產(chǎn)、使用以及運(yùn)輸過程中存在感染病原體的可能，尤其是某些隱性感染，很有可能存在向環(huán)境擴(kuò)散的危害，造成生物安全問題，甚至引起疾病流行、暴發(fā)，危及人類的健康［6-8］。因此，加強(qiáng)對外來購入小鼠的病原微生物檢測，無疑是加強(qiáng)生物安全的有力手段［9］。為了確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)機(jī)構(gòu)提供合格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，確?？蒲泄ぷ鞯捻樌M(jìn)行，防止人畜共患病對動(dòng)物及飼養(yǎng)、科研人員的健康影響，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院科研處實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心堅(jiān)持對外購實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行抽檢監(jiān)測。本研究對2022 年抽檢的714 只實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行了病原菌、寄生蟲檢測，分析病毒檢測結(jié)果，為保障科研工作的開展和相關(guān)人員的安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

2022 年華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院科研處實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心共檢測境內(nèi)市售實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)小鼠714 只，分別來自7 家不同的生產(chǎn)機(jī)構(gòu)。

1.2 主要試劑

美國Xpress Bio 公司的ELISA 診斷試劑盒，蘇州西山生物有限公司的ELISA 診斷試劑盒和小鼠病毒熒光定量PCR 檢測試劑盒，梅里埃公司的API 20E型腸桿菌鑒定試劑盒、API STAPH 型葡萄球菌鑒定試劑盒、API 20NE 型非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒，廣州迪景公司的哥倫比亞血瓊脂，青島海博生物科技公司的多種細(xì)菌鑒別培養(yǎng)基等。

1.3 儀器設(shè)備

Bio-Rad CFX96 型實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（Bio-Rad 美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；生物安全柜（海爾生物醫(yī)療公司）；酶標(biāo)儀、自動(dòng)洗板機(jī)（Thermo 賽默飛世爾科技公司）；生物顯微鏡（LEICA 徠卡儀器有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)鼠的抽檢 對每家機(jī)構(gòu)售賣的不同品系實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行抽檢，每個(gè)品系抽取1 只進(jìn)行采樣解剖，隔離檢疫7 d后，檢測結(jié)果均為陰性才判為檢測合格。

1.4.2 隔離檢疫室的設(shè)置 傳遞倉作為運(yùn)輸通道傳遞檢疫動(dòng)物及其飼養(yǎng)所需器具和材料。隔離檢疫室配有無菌IVC 2 臺(tái)。

對進(jìn)入本動(dòng)物中心的外來小鼠都有隔離檢疫期，時(shí)長7 d，在此期間對實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)和臨床癥狀觀測。若發(fā)現(xiàn)小鼠有被毛雜亂無光澤、皮膚潰爛、眼部炎性反應(yīng)、口鼻黏膜潮紅、耳部青紫、四肢運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、肛門紅腫潰爛、體型消瘦、精神萎靡、步態(tài)失常、躁郁不安等癥狀，按照GB 14922.2—2011《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測》和GB 14922.1—2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測》的要求進(jìn)行取樣檢測。

1.4.3 病理剖檢 對在隔離檢疫過程中隨機(jī)抽樣檢測的實(shí)驗(yàn)鼠及有臨床表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)鼠實(shí)施剖檢，并對其各組織器官的病變情況進(jìn)行觀察。

1.4.4 寄生蟲檢測 采用透明膠帶粘取法粘取小鼠眼周、腹股溝及肛周樣本，刀片刮取皮層物取樣后顯微鏡下觀察，進(jìn)行體外節(jié)肢寄生蟲檢測；取血后收集血清，采用ELISA 法對弓形蟲進(jìn)行檢測；將回盲內(nèi)容物或糞便直接涂片，顯微鏡下觀察檢測蠕蟲、腸道鞭毛蟲和纖毛蟲。

1.4.5 病原菌檢測 將氣管內(nèi)容物接種于血平皿；回盲內(nèi)容物接種于膽硫乳（DHL）瓊脂、高鹽甘露醇（SP）瓊脂以及NAC 液體培養(yǎng)基。篩選可疑菌后分離純化，革蘭氏染色鏡檢后，接種到相對應(yīng)的API 20E 型腸桿菌鑒定試劑盒、API STAPH 型葡萄球菌鑒定試劑盒、API 20NE 型非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒中進(jìn)行生化反應(yīng)。使用API 微生物系統(tǒng)檢測國家標(biāo)準(zhǔn)要求必檢的沙門菌、鼠棒狀桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌。對于國家標(biāo)準(zhǔn)未明確要求檢測的潛在病原菌采取伴隨檢測和取病灶于哥倫比亞血瓊脂涂板，在恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取可疑菌，采用哥倫比亞血瓊脂純培養(yǎng)后取樣的方式進(jìn)行細(xì)菌鑒定。使用Elisa 法對支原體和泰澤病原體進(jìn)行檢測。

1.4.6 病毒檢測 小鼠心臟取血后離心收集血清，使用Elisa 法檢測鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠仙臺(tái)病毒、小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、小鼠細(xì)小病毒，并使用熒光定量PCR 的方法對可疑樣本進(jìn)行復(fù)檢。若抽檢小鼠為裸鼠或其他免疫缺陷小鼠，則取該小鼠的糞便以及氣管、肺、肝臟等組織提取RNA或DNA，使用熒光定量PCR 的方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)檢疫，7 個(gè)不同生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)小鼠質(zhì)量不同，有兩家公司的合格率為100%，其他公司都有檢測出病原體，具體結(jié)果如表1 所示。在65 批次的小鼠中，共檢出4 種病原菌，其中綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌是國家標(biāo)準(zhǔn)要求為陰性的人獸共患病病原菌（表2）；奇異變形桿菌是對人致病，但未被定為人獸共患病的病原菌［10-12］。木糖葡萄球菌則是在4 家公司多次檢測到（表3）。

表1 2022 年購入的實(shí)驗(yàn)小鼠檢疫情況

表2 65 批次實(shí)驗(yàn)小鼠的病原檢測結(jié)果

表3 國家標(biāo)準(zhǔn)未做要求但對屏障系統(tǒng)具有損害的病原菌檢出結(jié)果

檢出的病原菌大多以條件致病菌為主，其中金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌可導(dǎo)致化膿性感染，其他單位也有檢出，應(yīng)引起生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的重視［13，14］。奇異變形桿菌是一種條件致病菌，可引起人和動(dòng)物感染，主要存在于人與動(dòng)物的體表黏膜與消化道，產(chǎn)生的相關(guān)毒素可引起食物中毒，有些可以和化膿性球菌混合感染，引起繼發(fā)性感染等，并可引起多種疾病，如尿道炎、腎盂腎炎、中耳炎和菌血癥等［15，16］。該菌廣泛存在于土壤、水和被糞便污染的物質(zhì)中，在腸道和醫(yī)院環(huán)境中也大量存在，是重要的醫(yī)源性感染條件致病菌［17，18］。木糖葡萄球菌一直被認(rèn)為是非致病菌或條件致病菌，但已有研究者分離出強(qiáng)β-溶血菌株，并結(jié)合其生化特性，推測判定該菌是導(dǎo)致病鼠腿部潰爛的致病菌［19，20］。4家公司的4個(gè)品系小鼠都檢測出該菌，因此木糖葡萄球菌的檢測應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。

3 討論

對市售實(shí)驗(yàn)小鼠的病原監(jiān)測，基本針對在生產(chǎn)單位進(jìn)行自檢或抽檢，往往忽略了運(yùn)輸過程等因素對小鼠的應(yīng)激而誘發(fā)疾病。本研究主要通過對來自省內(nèi)外的7 個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)小鼠病原菌、寄生蟲和病毒進(jìn)行監(jiān)測，了解不同機(jī)構(gòu)之間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)輸?shù)韧饨鐥l件對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的影響，以期為改善和提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量方面提供參考。不同機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)小鼠品質(zhì)參差不齊，主要原因可能有以下幾種。①實(shí)驗(yàn)小鼠生產(chǎn)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制存在缺陷。各省區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢驗(yàn)監(jiān)督機(jī)構(gòu)的抽檢、復(fù)檢頻率不同，檢測資源、人員等都有所限制，市售實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的送檢頻率、數(shù)量不同，導(dǎo)致不同生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量不同。因此，加強(qiáng)對生產(chǎn)機(jī)構(gòu)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自檢管理勢在必行。②實(shí)驗(yàn)小鼠運(yùn)輸環(huán)節(jié)的質(zhì)控存在問題。從本研究統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)來看，本中心大部分使用的小鼠都是從外省購入，這就涉及包裝、運(yùn)輸?shù)葐栴}，運(yùn)輸是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)的必要環(huán)節(jié)，在監(jiān)測中，春季和秋季的運(yùn)輸出現(xiàn)問題較少，夏季和冬季由于溫度問題，開箱時(shí)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有小鼠死亡，尤其是裸鼠的死亡情況較為嚴(yán)重。在運(yùn)輸過程中運(yùn)輸盒內(nèi)小鼠密度、運(yùn)輸時(shí)間、禁食禁水、機(jī)場等候或車輛運(yùn)輸中的環(huán)境溫度、包裝是否破損、搬運(yùn)裝載等因素若處理不當(dāng)，均會(huì)使實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生應(yīng)激導(dǎo)致其抵抗力下降，直接影響實(shí)驗(yàn)小鼠的質(zhì)量，誘發(fā)條件致病菌大量繁殖甚至使小鼠死亡。因此，注意在運(yùn)輸途中的動(dòng)物福利問題顯得尤為重要。③隔離檢疫的質(zhì)控環(huán)節(jié)存在問題。《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》中有規(guī)定明確指出，對引入的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須進(jìn)行隔離檢疫。但根據(jù)監(jiān)測管理經(jīng)驗(yàn)，許多潛在的條件致病菌往往在隔離檢疫期過后才能被檢測出，3～5 d 的隔離檢疫期內(nèi)攜帶病原的小鼠也不會(huì)發(fā)病，導(dǎo)致抽檢結(jié)果不夠準(zhǔn)確，因此，延長隔離檢疫的時(shí)間、增加抽檢小鼠的數(shù)量也是非常必要的。

雖然對外購小鼠進(jìn)行抽檢能夠有效避免其攜帶的病原微生物進(jìn)入本中心的動(dòng)物屏障設(shè)施，但也有一些問題亟待解決。①未被列入國家標(biāo)準(zhǔn)但存在致病性的病原體在抽檢過程中被檢出。如奇異變形桿菌在2022 年的抽檢中被檢出，該病原菌雖然不在國家標(biāo)準(zhǔn)要求不得檢出的病原菌范圍內(nèi)，但這種菌是醫(yī)源性感染的重要條件致病菌，這種細(xì)菌很有可能會(huì)影響相關(guān)人員的身體健康，對實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行造成干擾。因此，針對不同的實(shí)驗(yàn)操作人員和實(shí)驗(yàn)環(huán)境，擴(kuò)大病原體的檢測項(xiàng)目非常重要。②細(xì)菌的致病性并不是不變的，有些非致病菌也有轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【目赡埽m然在本中心分離得到的木糖葡萄球菌一般被認(rèn)為是非致病菌，但也有文獻(xiàn)報(bào)道這種菌有可能是一種新的致病菌，會(huì)導(dǎo)致病鼠的腿部潰爛，所以也應(yīng)該加強(qiáng)對于非致病菌致病性的跟蹤觀察。