山柰酚對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化、MRC-5 細(xì)胞膠原蛋白生成的影響

王遠(yuǎn)敏，羅 敏，蘇 穆，李美燕，徐明興

［遵義市第一人民醫(yī)院（遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院），貴州 遵義 563000］

肺部纖維化（pulmonary fibrosis，PF） 是由于慢性支氣管疾病、病毒性肺炎等肺部疾病，以及長(zhǎng)期的吸煙、環(huán)境等因素導(dǎo)致的不同程度呼吸困難的疾病，是一種慢性、進(jìn)行性、致命性的纖維化間質(zhì)疾病，可導(dǎo)致肺組織硬化、肺功能喪失，最終死亡，臨床治療多以激素控制，副作用較大［1］。尼達(dá)尼布和吡非尼酮是最新開(kāi)發(fā)的抗纖維化藥物，在減輕肺功能下降和肺部纖維化進(jìn)展方面有一定的應(yīng)用前景［2-3］，但它們不能逆轉(zhuǎn)或阻止結(jié)構(gòu)損傷和肺功能的喪失，因此，開(kāi)發(fā)治療肺纖維化的新藥或治療方法仍任重道遠(yuǎn)?，F(xiàn)有研究表明，山柰酚屬于黃酮類化合物，存在于多種藥材、水果、蔬菜中，如八角茴香、白果、貫眾黃芪等［4］，其因具有防癌、抗癌、抗感染、抗菌、抗病毒等多種功效而受到人們的廣泛關(guān)注［5］，可用于治療多種急慢性炎癥、椎間盤退變、結(jié)腸炎、絕經(jīng)后骨丟失、急性肺損傷等疾病。此外，山柰酚有益于癌癥、肝損傷、糖尿病、肥胖患者，可抑制血管內(nèi)皮炎癥，保護(hù)顱神經(jīng)和心臟功能，但其對(duì)于肺部纖維化是否具有預(yù)防或治療作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究探索山柰酚對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的作用和對(duì)MRC-5人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖、膠原生成的影響。

1 材料

1.1 藥物 山柰酚對(duì)照品，購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，批號(hào)1092382910。

1.2 動(dòng)物與細(xì)胞 SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2） g，由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （湘） 2019-0014］。MRC-5人胚肺成纖維細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 試劑 磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS） 溶液； 博來(lái)霉素（批號(hào)S1214，上海藍(lán)木化工有限公司）； 二甲苯、無(wú)水乙醇分析純?nèi)芤海ㄅ?hào)20190801、20180907，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； β-actin 蛋白抗體［批號(hào)4970，賽信通（上海） 生物試劑有限公司］； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA） 抗體、Ⅰ型膠原蛋白 （Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（ Collagen Ⅲ） 抗 體 ［批 號(hào) ab215715、ab124964、ab270993、ab7778，艾博抗（上海） 貿(mào)易有限公司］； 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG （H＋L）、極超敏（enhanced chemiluminescent，ECL） 化學(xué)發(fā)光試劑盒、蘇木素伊紅染色液、CCK-8 試劑盒 （批號(hào)A0181、P0018FS、C0105M、C0037，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）； 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 制備試劑盒、Masson染色試劑盒、羧甲基纖維素鈉、MEM 培養(yǎng)基、羥脯氨酸試劑盒（批號(hào)P1200、G1340、C8621、41500、BC0250，北京索萊寶生物科技有限公司）； MinuteTM動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒（批號(hào)SD-1，北京英文特生物技術(shù)有限公司）； 微量BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)CW0014，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）； PVDF 膜（批號(hào)ISEQ00010，密理博中國(guó)有限公司）； 免疫組化試劑盒、DAB 顯影液（批號(hào)PV-9000、ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）； GIBCO 胎牛血清（批號(hào)2045512CP，上海賽默飛世爾科技公司）； 重組人TGF-β1 蛋白［批號(hào)abs04204，愛(ài)必信（上海） 生物科技有限公司］； Collagen Ⅰ、Collagen ⅢELISA 試劑盒（批號(hào)CSB-E08082h、CSB-E04799h，武漢華美生物工程有限公司）。

1.4 儀器 WBP 動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能呼吸檢測(cè)系統(tǒng)（上海塔望智能科技有限公司）； 免疫組化成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）； 酶標(biāo)分析儀和細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海賽默飛世爾科技公司）； SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái)（上海谷寧儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理 將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（10 只）和模型組（30 只），腹腔注射4%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，碘伏酒精消毒頸部皮膚，剪開(kāi)頸部皮膚，剝離頸前組織（避免出血） 并仔細(xì)分離出氣管，假手術(shù)組氣管內(nèi)注射0.1 mL生理鹽水，模型組氣管內(nèi)注射生理鹽水溶解的博來(lái)霉素（5 mg/kg），每組0.1 mL，注射后小鼠快速倒立旋轉(zhuǎn)，使博來(lái)霉素注射液或生理鹽水混勻于肺組織內(nèi)，術(shù)后小鼠保溫蘇醒后正常喂食喂水飼養(yǎng)。將博來(lái)霉素誘導(dǎo)后肺纖維化小鼠模型隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、山柰酚組（20 mg/kg）、吡非尼酮組（100 mg/kg），每組10 只。第2天開(kāi)始，假手術(shù)組和模型組灌胃純凈水，給藥組灌胃相應(yīng)劑量藥物，給藥28 d，其間小鼠正常飲水進(jìn)食。末次給藥1 h 后檢測(cè)每組小鼠呼吸功能，隨后脫頸處死并測(cè)量臟器系數(shù)，摘取左肺用于檢測(cè)羥脯氨酸水平，右肺用于Masson 膠原染色、免疫組化檢測(cè)。

2.2 小鼠呼吸功能檢測(cè)和臟器系數(shù)分析 將小鼠放入WBP 動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能呼吸檢測(cè)系統(tǒng)附帶的密閉容器內(nèi)，設(shè)定參數(shù)，先讓其適應(yīng)陌生黑暗環(huán)境10 min，啟動(dòng)機(jī)器監(jiān)測(cè)記錄潮氣量（tidal volume，TVB）、吸氣時(shí)間（inspiration time，Ti）、呼氣時(shí)間（expiration time，Te）。小鼠稱重后快速脫頸處死，摘取肺臟并稱重，記錄并計(jì)算臟器系數(shù)。

2.3 小鼠肺組織羥脯氨酸水平檢測(cè) 根據(jù)試劑盒要求將0.2 g 小鼠左肺樣本組織放入試管中，將組織盡量剪碎以便消化，蓋子稍松不密閉，加入2 mL 的提取液，置于110 ℃烘箱中消化6 h 至無(wú)明顯團(tuán)塊，25 ℃、16 000 r/min 離心20 min，用10 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至6～8，蒸餾水定容至4 mL，取上清液并加入相應(yīng)檢測(cè)試劑，混勻，60 ℃水浴20 min 后室溫靜置15 min，于560 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.4 Masson 膠原染色觀察小鼠肺組織膠原增殖情況 取每組左肺于多聚甲醛中固定12 h，自來(lái)水沖洗，70%乙醇中浸泡24 h，隨后經(jīng)80%、90%、100% 乙醇各浸泡3 h，二甲苯透明20 min，液體石蠟浸泡3 h，包埋組織，蠟塊室溫冷卻后以4 μm 厚度切片，37 ℃烘干后二甲苯脫蠟30 min，切片分別經(jīng)100%、90%、80%、70% 乙醇浸泡，Masson 膠原染色試劑染色，90% 乙醇脫水后二甲苯浸泡5 min，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察并評(píng)價(jià)肺組織膠原增殖程度變化。根據(jù)Szapiel 病理評(píng)價(jià)方法評(píng)分，0 分為無(wú)纖維化；1 分為輕度纖維化，病變范圍≤全肺20%； 2 分為中度纖維化，病變范圍全肺20% ～50%； 3 分為重度纖維化，病變范圍≥全肺50%，并且結(jié)構(gòu)改變。

2.5 免疫組化法檢測(cè)小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá) 每組右肺石蠟切片后二甲苯脫蠟30 min，切片分別經(jīng)100%、90%、80%、70%乙醇浸泡，PBS 水化組織切片，根據(jù)PV-9000 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，3%過(guò)氧化氫封閉30 min，PBS 緩沖液沖洗后滴加一抗（1 ∶100），4 ℃孵育過(guò)夜后PBS 緩沖液沖洗，滴加二抗室溫孵育60 min，PBS 緩沖液沖洗后，DAB 顯影5 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染5 min，自來(lái)水沖洗，95%乙醇浸泡10 min，二甲苯浸泡透明10 min 后中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，計(jì)算光密度。

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 MRC-5 細(xì)胞采用含10% 胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)胰酶消化傳代，以每孔5.0×103個(gè)的密度接種至96 孔板，貼壁24 h 后參考文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道設(shè)置空白組、TGF-β 組（10 ng/mL） 和20、40、80 μmol/L 山柰酚組（10 ng/mL TGF-β1＋20、40、80 μmol/L 山柰酚），每組4個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)試劑和藥物后孵育48 h，加入CCK-8 試劑繼續(xù)孵育4 h，于酶標(biāo)儀上450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，計(jì)算抑制率，重復(fù)上述操作，取細(xì)胞培養(yǎng)基，檢測(cè)CollagenⅠ、Collagen Ⅲ水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠呼吸功能的影響 如表1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠呼吸功能明顯受到限制，潮氣量降低（P＜0.01），且吸氣時(shí)間和呼吸時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.01）； 與模型組比較，山柰酚組和吡非尼酮組小鼠呼吸功能有所改善，潮氣量增加（P＜0.05），吸氣時(shí)間、呼吸時(shí)間縮短（P＜0.05）。

表1 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠呼吸功能的影響（±s，n＝10）

表1 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠呼吸功能的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別TVB/mLTi/msTe/ms假手術(shù)組0.44±0.1266.60±15.2552.11±12.49模型組0.24±0.11** 164.30±32.11** 154.30±20.20**山柰酚組0.36±0.08＃90.41±22.21＃101.50±11.38＃吡非尼酮組0.38±0.11＃88.43±20.46＃99.40±14.06＃

3.2 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺臟系數(shù)的影響 如表2 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠肺臟系數(shù)升高 （P＜0.01）； 與模型組比較，山柰酚組和吡非尼酮組小鼠肺臟系數(shù)降低（P＜0.05）。

表2 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺臟系數(shù)的影響（±s，n＝10）

表2 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺臟系數(shù)的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別肺臟系數(shù)/（mg·g-1）假手術(shù)組0.004±0.002模型組0.024±0.010**山柰酚組0.013±0.002＃吡非尼酮組0.013±0.004＃

3.3 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸水平的影響 如表3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠肺組織羥脯氨酸水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，山柰酚組和吡非尼酮組小鼠肺組織羥脯氨酸水平降低（P＜0.01）。

表3 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸水平的影響（±s，n＝10）

表3 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸水平的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別羥脯氨酸/（μg·mg-1）假手術(shù)組0.88±0.54模型組2.27±1.15**山柰酚組1.10±0.66＃＃吡非尼酮組1.03±0.49＃＃

3.4 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織膠原蛋白增殖的影響 如圖1、表4 所示，假手術(shù)組箭頭所示在肺泡和細(xì)支氣管周圍有少量的膠原，組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)出血滲出； 與假手術(shù)組比較，模型組箭頭所示膠原蛋白圍繞氣管和肺泡大量增殖，導(dǎo)致正常肺泡結(jié)構(gòu)消失并有粘連、充血，病理評(píng)分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，山柰酚組和吡非尼酮組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)較完整，雖有膠原蛋白異常增殖，但程度較輕，病理評(píng)分降低（P＜0.01）。

圖1 各組小鼠肺組織Masson 染色（×100）

表4 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織膠原蛋白增殖的影響（±s，n＝10）

表4 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織膠原蛋白增殖的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別病理評(píng)分/分假手術(shù)組0.13±0.32模型組2.22±0.71**山柰酚組1.47±0.70＃＃吡非尼酮組1.73±0.48＃＃

3.5 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響 如圖2、表5 所示，假手術(shù)組TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白平均光密度較低； 與假手術(shù)組比較，模型組TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白平均光密度升高（P＜0.01）； 與模型組比較，山柰酚組、吡非尼酮組小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白平均光密度降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各組小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ免疫組化染色（×200）

表5 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝10）

表5 山柰酚對(duì)肺纖維化小鼠肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別TGF-β1ɑ-SMACollagen ⅠCollagen Ⅲ假手術(shù)組0.22±0.100.11±0.050.02±0.010.06±0.04模型組0.44±0.11**0.43±0.10**0.33±0.06**0.34±0.06**山柰酚組0.25±0.09＃＃0.22±0.12＃＃0.14±0.11＃0.24±0.06＃＃吡非尼酮組0.26±0.13＃＃0.19±0.16＃＃0.15±0.10＃0.19±0.10＃＃

3.6 山柰酚對(duì)MRC-5 人胚肺成纖維細(xì)胞增殖活性和Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ水平的影響 如表6 所示，與空白組比較，TGF-β1 組MRC-5 細(xì)胞增殖抑制率無(wú)明顯變化（P＞0.05），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ水平升高（P＜0.01）；與TGF-β1 組比較，各濃度山柰酚組MRC-5 細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.01），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ水平降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

表6 山柰酚對(duì)MRC-5 細(xì)胞增殖和Collagen Ⅰ、CollagenⅢ水平的影響（±s，n＝4）

表6 山柰酚對(duì)MRC-5 細(xì)胞增殖和Collagen Ⅰ、CollagenⅢ水平的影響（±s，n＝4）

注： 與空白組比較，**P＜0.01； 與TGF-β1 組比較，＃＃P＜0.01。

組別抑制率/%Collagen Ⅰ/（ng·mL-1）Collagen Ⅲ/（ng·mL-1）空白組0.00±0.0025.35±0.4328.76±0.35 TGF-β1 組0.00±0.0040.78±0.67** 47.44±0.61*20 μmol/L 山柰酚組 14.37±2.35＃＃35.12±0.35＃＃ 37.23±0.58＃＃40 μmol/L 山柰酚組 21.56±1.73＃＃36.22±0.21＃＃ 36.55±0.62＃＃80 μmol/L 山柰酚組 26.15±2.43＃＃33.37±0.40＃＃ 36.79±0.43＃＃

4 討論

肺部纖維化是以肌成纖維細(xì)胞異常活化、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚、肺瘢痕形為主要特征［7］，其中肺細(xì)胞外基質(zhì)在肺纖維化過(guò)程中可發(fā)生生物特性的改變并促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。多種細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白參與了肺纖維化的病理過(guò)程，如膠原蛋白、羥脯氨酸等蛋白與細(xì)胞增殖、遷移、分化、氣道上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換以及各種分泌型介質(zhì)的產(chǎn)生和激活，在肺纖維化的發(fā)展中起重要的促進(jìn)作用，因此，細(xì)胞外基質(zhì)可作為肺纖維化治療的潛在靶點(diǎn)［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺部纖維化小鼠肺組織潮氣量降低，呼氣時(shí)間和吸氣時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)山柰酚干預(yù)可有效改善肺部纖維化小鼠的呼吸功能，增加小鼠肺組織潮氣量，縮短吸氣時(shí)間，與陽(yáng)性藥相當(dāng)。Masson 染色發(fā)現(xiàn)，模型組肺部纖維化小鼠肺組織膠原蛋白水平升高，肺組織結(jié)構(gòu)病理性改變，正常的肺泡結(jié)構(gòu)被大量異常增殖的膠原組織替代，肺泡間氣體交換功能損害； 經(jīng)山柰酚和吡非尼酮干預(yù)后，小鼠膠原蛋白水平整體下降，殘留的肺泡結(jié)構(gòu)較多，有效改善了肺纖維小鼠的通氣功能。羥脯氨酸是膠原蛋白的組成成分，占其氨基酸總量的13%，本研究結(jié)果表明，模型組小鼠肺組織羥脯氨酸水平較高； 給予山柰酚和吡非尼酮干預(yù)后降低，提示山柰酚和吡非尼酮都具有改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化膠原形成的作用。

TFG-β1 是一種重要的生長(zhǎng)因子，參與了成纖維細(xì)胞的分化和微環(huán)境的形成［9］，是目前已開(kāi)發(fā)肺纖維化治療藥物針對(duì)的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，如吡非尼酮［10-11］。ɑ-SMA 作為細(xì)胞骨架蛋白，是成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志，其表達(dá)與肺纖維化程度呈正相關(guān)性［12-13］。Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白是肺組織細(xì)胞外基質(zhì)中膠原的主要成分［14］，肺組織細(xì)胞外基質(zhì)與肺纖維化關(guān)系最為密切，肺組織損傷后，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量沉積于肺間質(zhì)，使肺結(jié)構(gòu)破壞，換氣面積減少，肺泡膜增厚，最終發(fā)生呼吸衰竭［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織TGF-β1、ɑ-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達(dá)均升高；經(jīng)山柰酚和吡非尼酮干預(yù)后，這些蛋白表達(dá)降低，表明山柰酚和吡非尼酮都能夠改善肺纖維化小鼠肺組織細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積或表達(dá)。體外MRC-5 人胚肺成纖維細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，山柰酚能降低MRC-5 細(xì)胞分泌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ水平。

綜上所述，山柰酚能夠改善因博來(lái)霉素引發(fā)的小鼠肺纖維化病理改變，抑制體外TGF-β1 刺激的MRC-5 細(xì)胞增殖活性，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β/smad 通路中的TGF-β1蛋白表達(dá)來(lái)減少膠原蛋白和纖維的形成，以及下調(diào)ɑ-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)有關(guān)。