基于生物信息學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗探討肝豆扶木湯調(diào)控鐵死亡治療肝豆?fàn)詈俗冃缘淖饔?/h1>
2023-10-30 06:12:26郝文杰楊文明魏濤華唐露露錢南南楊玉龍
中成藥 2023年10期
郝文杰，楊文明，魏濤華，唐露露，楊 悅，錢南南，楊玉龍
（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038； 3.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，安徽 合肥 230038）
肝豆?fàn)詈俗冃?，又稱Wilson 病，是銅代謝障礙導(dǎo)致以大腦基底節(jié)變性和肝功能損害為主要表現(xiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，臨床上以進(jìn)行性加重的肝損害、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等為主要特征［1］。研究發(fā)現(xiàn)該病不僅存在銅代謝障礙，其鐵代謝障礙在發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用［2］。由于肝臟是金屬離子代謝的主要靶器官，肝損害為Wilson 病患者最常見的癥狀，暴發(fā)性肝衰竭是最常見的致死因素［3］。進(jìn)行早期干預(yù)對保護(hù)患者肝損害具有重要的臨床意義。據(jù)相關(guān)研究報道，鐵死亡在Wilson 病肝損害中具有起到關(guān)鍵作用［4］。鐵死亡是一種被公認(rèn)的以鐵依賴性脂質(zhì)過氧化為特征的細(xì)胞調(diào)控死亡形式［5］。
肝豆扶木湯是楊文明教授根據(jù)新安醫(yī)學(xué)固本培元的理論，針對Wilson 病創(chuàng)制的專方，全方行滋補(bǔ)肝腎、豁痰化瘀之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝豆扶木湯能有效改善Wilson 病患者和模型鼠的肝功能及肝纖維化程度，發(fā)揮肝保護(hù)作用［6］，且其作用機(jī)制可能與調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1） /Smad［7］、活性氧（reactive oxygen species，ROS） /Jun 氨基末端激酶，Jun Nterminal kinase，JNK）［8］信號通路有關(guān)，但與鐵死亡相關(guān)作用機(jī)制尚待深入研究。故本研究借助生物信息學(xué)系統(tǒng)預(yù)測肝豆扶木湯干預(yù)鐵死亡的活性成分、潛在靶點(diǎn)，并結(jié)合體外實(shí)驗進(jìn)行初步驗證。
1 材料
1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞HepG2 （貨號CL-0103） 購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70% ～80%時開始傳代，用于后續(xù)實(shí)驗。
1.2 藥物 肝豆扶木湯由制何首烏4 g、枸杞子20 g、三七3 g、土茯苓12 g、白芍15 g、郁金12 g、柴胡12 g 組成，均購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，符合2020 年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)，加10 倍量水浸泡30 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火再煎30 min，濾過，再加8 倍量水重復(fù)以上步驟，將2次水煎液混勻，紗布過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至0.3 g/mL，冷凍干燥得凍干粉17.5 g，得率為22.4%，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。肝豆扶木湯凍干粉溶液用無菌PBS 制成1 g/L （1 g 凍干粉相當(dāng)于4.46 g 生藥量） 母液，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。
1.3 試劑 DMEM 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號WH0022C021）； Erastin 試劑（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號C13632104）； PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （日本TaKaRa 公司，批號AJ51485A）； CCK8 檢測試劑盒、2 × SYBR Green qPCR Master Mix （High ROX） （武漢賽維爾生物科技有限公司，批號CR2112050、LT202201）； 山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG （上海張沈生物醫(yī)藥科技有限公司，批號142637、139931）； 溶質(zhì)載體家族7 成員11 （solute carrier family 7 member 11，SLC7A11） 抗體、谷胱甘肽過氧化酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4） 抗體、P53 抗體 （美國Affinity 公司，批號84a5792、78p5366、23y9837）； RIPA 裂解液（強(qiáng)）（合肥白鯊生物科技有限公司，批號69128033）；PAGE 膠促凝劑 （北京索萊寶科技有限公司，批號1020F024）； PVDF 膜 （ 美國 Millipore 公司，批號R8KA7385）； 胰酶、Western 一抗二抗去除液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0201、051418180626）； ECL 超敏發(fā)光試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號S1257444）； 丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH） 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20220518、20220525）； 活性氧（ROS） 檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，批號BB20081）。
1.4 儀器 3111 型恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 超凈工作臺（上海力辰儀器科技有限公司）； CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）； 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）； 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）； 自動曝光儀（上海培清科技有限公司）；酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。
2 方法
2.1 生物信息學(xué)
2.1.1 活性成分篩選 利用BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http： / /bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/） 檢索肝豆扶木湯方中何首烏、枸杞子、三七、柴胡、白芍、土茯苓、郁金7 味中藥的化學(xué)成分，以靶點(diǎn)預(yù)測的得分值（Score cutoff） ≥20、靶點(diǎn)分析P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)［9］，篩選出具有較高活性的成分和潛在靶點(diǎn)。利用 PubChem 數(shù)據(jù)庫（https： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 下載對應(yīng)的活性成分信息，以3D 結(jié)構(gòu)保存為SDF 格式，用于分子對接。
2.1.2 鐵死亡靶點(diǎn)篩選 在GeneCards （https： / /www.genecards.org/）、OMIM （http： / /www.omim.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫 （http： / /db.idrblab.net/ttd/） 中輸入檢索詞“Ferroptosis”，收集鐵死亡相關(guān)的非重復(fù)靶基因。將鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)的相關(guān)度值（Relevance score） 定義為≥3，與藥物活性成分作用潛在靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終獲得肝豆扶木湯干預(yù)鐵死亡的作用靶點(diǎn)，用于后續(xù)分析。
2.1.3 分子對接 選取匹配后篩選得到的核心靶蛋白作為核心受體蛋白，在PDB 數(shù)據(jù)庫（https： / /www.rcsb.org）中輸入靶蛋白名稱，設(shè)置種屬為“Homosapiens”，選取分辨率高的靶蛋白三維結(jié)構(gòu)。使用CB-Docking 數(shù)據(jù)庫［10］（http： / /clab.labshare.cn/cb-dock/php/index.php） 將篩選出來的受體與配體進(jìn)行在線對接處理，比較對接后的Vina score 值，再進(jìn)行對比分析。
2.2 細(xì)胞實(shí)驗
2.2.1 Erastin 誘導(dǎo)劑最佳作用劑量和時間篩選 將HepG2細(xì)胞分為空白組、Erastin 誘導(dǎo)劑組，空白組只加DMEM 培養(yǎng)基，Erastin 誘導(dǎo)劑組分別加入含10、20、30、40 μmol/L Erastin 的DMEM 培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、36、48 h 后棄培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm 波長處測量各孔吸光度。
2.2.2 肝豆扶木湯凍干粉最佳作用劑量和時間篩選 將HepG2 細(xì)胞分為空白組、肝豆扶木湯凍干粉組，空白組只加DMEM 培養(yǎng)基，肝豆扶木湯凍干粉組分別加入含5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL 凍干粉和最佳作用濃度Erastin 的DMEM 培養(yǎng)基，在Erastin 最佳作用時間點(diǎn)換液3 次后棄培養(yǎng)液，每孔加10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm 波長處測量各孔吸光度。
2.2.3 分組及給藥 實(shí)驗分為空白組 （HepG2 細(xì)胞＋PBS）、模型組（HepG2 細(xì)胞＋Erastin 誘導(dǎo)劑） 和肝豆扶木湯低、中、高劑量組（HepG2 細(xì)胞＋Erastin 誘導(dǎo)劑＋160、320、640 μg/mL 肝豆扶木湯凍干粉）。取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞，接種于平底培養(yǎng)板，每組設(shè)3 個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，模型組加入最佳濃度的Erastin 誘導(dǎo)劑，肝豆扶木湯組同時加入最佳濃度的Erastin 誘導(dǎo)劑和不同質(zhì)量濃度的凍干粉，空白組加入等量PBS 溶液，處理至Erastin 誘導(dǎo)劑最佳時間點(diǎn)時進(jìn)行換液，繼續(xù)處理至凍干粉最佳作用時間后檢測相關(guān)指標(biāo)。
2.2.4 GSH、MDA 水平檢測 取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞，接種于6 孔板，按“2.2.3” 項下方法處理，按照相關(guān)試劑盒說明書操作步驟檢測GSH、MDA 水平。
2.2.5 ROS 水平檢測 取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞，接種于6 孔板，按“2.2.3” 項下方法處理，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min，其間顛倒混勻4 ～5 次，使細(xì)胞與探針充分接觸，再用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，除去多余的DCFH-DA，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，NovoExpress 軟件分析并計算熒光強(qiáng)度值。
2.2.6 Western blot 法檢測細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá) 按“2.2.3” 項下方法處理細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加P53 （1 ∶500）、SLC7A11 （1 ∶500）、GPX4 （1 ∶500）、β-actin （1 ∶500）一抗，4 ℃孵育過夜，加相應(yīng)二抗繼續(xù)孵育2 h，顯影，用Image J 軟件分析條帶灰度值。
2.2.7 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA表達(dá) 按“2.2.3” 項下方法處理細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)，引物序列見表1。
表1 引物序列
2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，若滿足正態(tài)性和方差齊性，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，組間多重比較采用LSD 法； 反之，采用Kruskal-Wallis 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 生物信息學(xué)
3.1.1 活性成分及作用靶點(diǎn) 以Score cutoff≥20、P＜0.05為條件進(jìn)行檢索，得到肝豆扶木湯方中化學(xué)成分226 種，其中何首烏16 種，枸杞子46 種，白芍18 種，三七51 種，土茯苓13 種，柴胡63 種，郁金18 種。以O(shè)B ≥30%、DL≥0.18 為條件，篩選得到214 種化學(xué)成分。
3.1.2 作用靶點(diǎn)篩選 共得到肝豆扶木湯活性成分潛在作用靶點(diǎn)10 463 個，其中何首烏298 個，枸杞子2 077 個，白芍300 個，三七3 964 個，土茯苓367 個，柴胡1 845個，郁金1 612 個，剔除重復(fù)部分，得到潛在作用靶點(diǎn)1 741個。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得274 個與鐵死亡相關(guān)的靶基因，相關(guān)度值（Relevance score） 定義為≥3，最終獲得與鐵死亡相關(guān)的靶基因23 個。將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，最終收集11 個共同作用靶點(diǎn)用于分子對接分析，見圖1。
圖1 肝豆扶木湯活性成分靶點(diǎn)與鐵死亡靶點(diǎn)的韋恩圖
3.1.3 分子對接 將11 個鐵死亡核心靶蛋白與對應(yīng)的肝豆扶木湯活性成分進(jìn)行分子對接，并根據(jù)Vina score 值繪制熱圖（圖2），其中Vina score＜-7.0，表明靶蛋白與活性成分結(jié)合性好，而且Vina score 值越小，兩者結(jié)合能力越強(qiáng)［11］。由此可知，肝豆扶木湯的主要活性成分維生素B2、抗壞血酸、γ-氨基丁酸、尼克酸、維生素C、核黃素、芍藥二酮、鬼傘毒素、苯乙酮、3，4-二甲基苯甲酸、鄰苯二酸辛酯、白芷素、壬烯酸、亞麻酸、姜黃酮、莪術(shù)二酮、姜黃烯、香芹酮與鐵死亡核心靶點(diǎn)SLC7A11 蛋白均有很強(qiáng)的結(jié)合能力，再繪制對接模式圖（圖3）。此外，維生素B2、核黃素、芍藥二酮、白芷素、莪術(shù)二酮與TP53、ACSL4、ACSL4、VDAC2、VDAC3、ALOX15、PRKAA1、MDM2 靶蛋白均有良好的結(jié)合能力。
圖2 肝豆扶木湯活性成分與鐵死亡核心靶蛋白分子對接熱圖
圖3 肝豆扶木湯活性成分與SLC7A11 蛋白對接模式圖
3.2 細(xì)胞實(shí)驗
3.2.1 Erastin 誘導(dǎo)劑最佳作用劑量、時間篩選 與空白組比較，10 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)劑作用12、24、36、48 h 時細(xì)胞活性均高于50%，20 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)劑作用12、24 h時細(xì)胞活性均高于50%，30 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)劑作用36、48 h 時細(xì)胞活性均低于50%，40 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)劑作用12、24、36、48 h 時細(xì)胞活性均低于50%，故選擇30 μmol/L、24 h 分別作為Erastin 誘導(dǎo)劑最佳作用劑量、時間，見表2。
表2 Erastin 誘導(dǎo)劑不同作用劑量、時間下細(xì)胞相對活性（±s，n＝3）
表2 Erastin 誘導(dǎo)劑不同作用劑量、時間下細(xì)胞相對活性（±s，n＝3）
注： 與空白組比較，*P＜0.05。
組別劑量/（μmol·L-1）12 h24 h36 h48 h空白組01.002±0.0111.003±0.0221.014±0.0161.001±0.021 Erastin 誘導(dǎo)劑組100.879±0.041*0.825±0.029*0.783±0.027*0.692±0.063*200.688±0.017*0.649±0.044*0.509±0.040*0.469±0.014*300.557±0.060*0.496±0.029*0.282±0.011*0.249±0.018*400.287±0.044*0.214±0.021*0.176±0.014*0.146±0.012*
3.2.2 肝豆扶木湯凍干粉最佳作用劑量、時間篩選 與空白組比較，5 μg/mL 凍干粉作用48、72 h 時，10、20、40、80 μg/mL 凍干粉作用24、48 h 時，以及160 μg/mL 凍干粉作用24 h 時細(xì)胞活性降低（P＜0.05）； 40、80、160 μg/mL凍干粉作用72 h 時，320 μg/mL 凍干粉作用48、72 h 時，以及640 μg/mL 凍干粉作用24、48、72 h 時細(xì)胞活性升高（P＜0.05），故選擇160、320、640 μg/mL 分別作為低、中、高劑量，見表3。
表3 肝豆扶木湯凍干粉不同作用劑量、時間下細(xì)胞相對活性（±s，n＝3）
表3 肝豆扶木湯凍干粉不同作用劑量、時間下細(xì)胞相對活性（±s，n＝3）
注： 與空白組比較，*P＜0.05。
組別劑量/（μg·mL-1）24 h48 h72 h空白組01.003±0.0221.001±0.0210.999±0.013肝豆扶木湯凍干粉組50.984±0.0140.824±0.033*0.914±0.072*100.935±0.010*0.846±0.068*0.991±0.048 200.867±0.013*0.853±0.078*1.037±0.049 400.822±0.008*0.917±0.034*1.084±0.061*800.787±0.018*0.950±0.066*1.129±0.042*1600.920±0.014*1.075±0.0341.174±0.01*3201.051±0.0221.286±0.027*1.305±0.009*6401.170±0.061*1.330±0.068*1.364±0.029*
3.2.3 肝豆扶木湯對Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞GSH、MDA、ROS 水平的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞GSH 水平降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01），ROS 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯各劑量組細(xì)胞GSH 水平升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01），ROS 熒光強(qiáng)度減弱（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖4。結(jié)果表明，肝豆扶木湯能提高HepG2 細(xì)胞GSH 水平，降低MDA、ROS 水平，提高抗氧化能力，抑制HepG2 細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。
圖4 肝豆扶木湯對HepG2 細(xì)胞GSH、MDA、ROS 水平的影響（±s，n＝3）
3.2.4 肝豆扶木湯對Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞P53 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），SLC7A11 和GPX4 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯中、高劑量組細(xì)胞P53 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），肝豆扶木湯各劑量組細(xì)胞SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖5。結(jié)果表明，肝豆扶木湯抑制HepG2細(xì)胞鐵死亡的作用可能與其下調(diào)P53 蛋白表達(dá)，上調(diào)SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)有關(guān)。
圖5 肝豆扶木湯對HepG2 細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）
3.2.5 肝豆扶木湯對Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞P53 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯各劑量組細(xì)胞P53 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖6。結(jié)果表明，肝豆扶木湯抑制HepG2 細(xì)胞鐵死亡的作用與其下調(diào)P53 mRNA 表達(dá)，上調(diào)SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)有關(guān)。
圖6 肝豆扶木湯對HepG2 細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝3）
4 討論
肝損害幾乎是每一個Wilson 病患者都存在的癥狀，如不能及時有效地進(jìn)行干預(yù)，易出現(xiàn)暴發(fā)性肝衰竭，甚至導(dǎo)致死亡［3］。如能早期有效干預(yù)，則能顯著延緩肝損害的病理進(jìn)程［12］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對Wilson 病肝損害的分子機(jī)制研究取得了一定的進(jìn)展［13-14］。Wilson 病患者存在鐵代謝障礙，鐵離子的沉積在疾病的進(jìn)展中起到重要作用［15-16］。分子對接技術(shù)是通過計算機(jī)模擬化合物與蛋白質(zhì)受體匹配的模式和親和力，是現(xiàn)代藥物探索和新藥發(fā)現(xiàn)的重要工具［17］。故本研究將肝豆扶木湯的活性成分與鐵死亡相關(guān)蛋白進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示鐵死亡關(guān)鍵蛋白SLC7A11 與肝豆扶木湯的活性成分具有良好的結(jié)合能力。
肝豆扶木湯是針對Wilson 病肝損害的病機(jī)特點(diǎn)創(chuàng)立而成［18］，由枸杞子、白芍、制何首烏、三七粉、土茯苓、柴胡、郁金組成，課題組前期臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗研究證實(shí)該方對Wilson 病肝損害具有保護(hù)作用［19］?，F(xiàn)代藥理表明，肝豆扶木湯的活性成分具有抗氧化等作用［20-21］。本研究采用Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞構(gòu)建鐵死亡模型，以肝豆扶木湯干預(yù)，發(fā)現(xiàn)肝豆扶木湯能提高HepG2 細(xì)胞的抗氧化能力，對細(xì)胞具有保護(hù)作用。細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA 升高及GSH 消耗是氧化應(yīng)激的標(biāo)志，也是鐵死亡發(fā)生的標(biāo)志之一。本研究結(jié)果顯示，HepG2 細(xì)胞經(jīng)Erastin 誘導(dǎo)后，其ROS 和MDA 水平升高，GSH 水平降低，說明Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激； 而肝豆扶木湯干預(yù)降低了ROS 和MDA 水平，提高了GSH 水平，說明肝豆扶木湯具有抗氧化的作用。
SLC7A11 可促進(jìn)細(xì)胞對胱氨酸的攝取和GSH 合成，提高抗氧化能力，保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡［22］。P53 可以抑制SLC7A11 表達(dá)，導(dǎo)致GSH 合成受損并增加消耗，促進(jìn)鐵死亡［23］。GPX4 是一種抗氧化酶，能降低ROS 水平來抑制鐵死亡的發(fā)生，而GSH 缺失可使GPX4 失活［24］。抑制GPX4活性可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物積累發(fā)生鐵死亡［25］。當(dāng)SLC7A11表達(dá)被抑制，胱氨酸吸收減少，GSH 合成被影響，導(dǎo)致GPX 活性降低，抗氧化能力下降，ROS 積聚，最終導(dǎo)致鐵死亡［26］。本研究采用Erastin 誘導(dǎo)處理HepG2 細(xì)胞后，其P53 蛋白和mRNA 表達(dá)升高，SLC7A11、GPX4 蛋白和mRNA 表達(dá)降低，說明Erastin 處理后的HepG2 細(xì)胞發(fā)生了鐵死亡； 而肝豆扶木湯干預(yù)后下調(diào)了P53 蛋白和mRNA 表達(dá)，上調(diào)了SLC7A11、GPX4 蛋白和mRNA 表達(dá)，說明肝豆扶木湯能夠抑制鐵死亡，且可能通過SLC7A11/GPX4 軸對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。
綜上所述，肝豆扶木湯能通過降低ROS 和MDA 水平，提高GSH 水平，下調(diào)P53 表達(dá)，上調(diào)SLC7A11 和GPX4 表達(dá)來減輕HepG2 細(xì)胞的鐵死亡，其作用可能是通過調(diào)控SLC7A11/GPX4 軸實(shí)現(xiàn)的。本研究為臨床運(yùn)用肝豆扶木湯治療Wilson 病患者肝損害提供科學(xué)證據(jù)。
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郝文杰，楊文明，魏濤華，唐露露，楊 悅，錢南南，楊玉龍
（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038； 3.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，安徽 合肥 230038）
肝豆?fàn)詈俗冃?，又稱Wilson 病，是銅代謝障礙導(dǎo)致以大腦基底節(jié)變性和肝功能損害為主要表現(xiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，臨床上以進(jìn)行性加重的肝損害、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等為主要特征［1］。研究發(fā)現(xiàn)該病不僅存在銅代謝障礙，其鐵代謝障礙在發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用［2］。由于肝臟是金屬離子代謝的主要靶器官，肝損害為Wilson 病患者最常見的癥狀，暴發(fā)性肝衰竭是最常見的致死因素［3］。進(jìn)行早期干預(yù)對保護(hù)患者肝損害具有重要的臨床意義。據(jù)相關(guān)研究報道，鐵死亡在Wilson 病肝損害中具有起到關(guān)鍵作用［4］。鐵死亡是一種被公認(rèn)的以鐵依賴性脂質(zhì)過氧化為特征的細(xì)胞調(diào)控死亡形式［5］。
肝豆扶木湯是楊文明教授根據(jù)新安醫(yī)學(xué)固本培元的理論，針對Wilson 病創(chuàng)制的專方，全方行滋補(bǔ)肝腎、豁痰化瘀之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝豆扶木湯能有效改善Wilson 病患者和模型鼠的肝功能及肝纖維化程度，發(fā)揮肝保護(hù)作用［6］，且其作用機(jī)制可能與調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1） /Smad［7］、活性氧（reactive oxygen species，ROS） /Jun 氨基末端激酶，Jun Nterminal kinase，JNK）［8］信號通路有關(guān)，但與鐵死亡相關(guān)作用機(jī)制尚待深入研究。故本研究借助生物信息學(xué)系統(tǒng)預(yù)測肝豆扶木湯干預(yù)鐵死亡的活性成分、潛在靶點(diǎn)，并結(jié)合體外實(shí)驗進(jìn)行初步驗證。
1 材料
1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞HepG2 （貨號CL-0103） 購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70% ～80%時開始傳代，用于后續(xù)實(shí)驗。
1.2 藥物 肝豆扶木湯由制何首烏4 g、枸杞子20 g、三七3 g、土茯苓12 g、白芍15 g、郁金12 g、柴胡12 g 組成，均購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，符合2020 年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)，加10 倍量水浸泡30 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火再煎30 min，濾過，再加8 倍量水重復(fù)以上步驟，將2次水煎液混勻，紗布過濾后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至0.3 g/mL，冷凍干燥得凍干粉17.5 g，得率為22.4%，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。肝豆扶木湯凍干粉溶液用無菌PBS 制成1 g/L （1 g 凍干粉相當(dāng)于4.46 g 生藥量） 母液，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。
1.3 試劑 DMEM 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號WH0022C021）； Erastin 試劑（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號C13632104）； PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （日本TaKaRa 公司，批號AJ51485A）； CCK8 檢測試劑盒、2 × SYBR Green qPCR Master Mix （High ROX） （武漢賽維爾生物科技有限公司，批號CR2112050、LT202201）； 山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG （上海張沈生物醫(yī)藥科技有限公司，批號142637、139931）； 溶質(zhì)載體家族7 成員11 （solute carrier family 7 member 11，SLC7A11） 抗體、谷胱甘肽過氧化酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4） 抗體、P53 抗體 （美國Affinity 公司，批號84a5792、78p5366、23y9837）； RIPA 裂解液（強(qiáng)）（合肥白鯊生物科技有限公司，批號69128033）；PAGE 膠促凝劑 （北京索萊寶科技有限公司，批號1020F024）； PVDF 膜 （ 美國 Millipore 公司，批號R8KA7385）； 胰酶、Western 一抗二抗去除液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0201、051418180626）； ECL 超敏發(fā)光試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號S1257444）； 丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH） 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20220518、20220525）； 活性氧（ROS） 檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，批號BB20081）。
1.4 儀器 3111 型恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； 超凈工作臺（上海力辰儀器科技有限公司）； CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）； 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）； 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）； 自動曝光儀（上海培清科技有限公司）；酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。
2 方法
2.1 生物信息學(xué)
2.1.1 活性成分篩選 利用BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http： / /bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/） 檢索肝豆扶木湯方中何首烏、枸杞子、三七、柴胡、白芍、土茯苓、郁金7 味中藥的化學(xué)成分，以靶點(diǎn)預(yù)測的得分值（Score cutoff） ≥20、靶點(diǎn)分析P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)［9］，篩選出具有較高活性的成分和潛在靶點(diǎn)。利用 PubChem 數(shù)據(jù)庫（https： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 下載對應(yīng)的活性成分信息，以3D 結(jié)構(gòu)保存為SDF 格式，用于分子對接。
2.1.2 鐵死亡靶點(diǎn)篩選 在GeneCards （https： / /www.genecards.org/）、OMIM （http： / /www.omim.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫 （http： / /db.idrblab.net/ttd/） 中輸入檢索詞“Ferroptosis”，收集鐵死亡相關(guān)的非重復(fù)靶基因。將鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)的相關(guān)度值（Relevance score） 定義為≥3，與藥物活性成分作用潛在靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終獲得肝豆扶木湯干預(yù)鐵死亡的作用靶點(diǎn)，用于后續(xù)分析。
2.1.3 分子對接 選取匹配后篩選得到的核心靶蛋白作為核心受體蛋白，在PDB 數(shù)據(jù)庫（https： / /www.rcsb.org）中輸入靶蛋白名稱，設(shè)置種屬為“Homosapiens”，選取分辨率高的靶蛋白三維結(jié)構(gòu)。使用CB-Docking 數(shù)據(jù)庫［10］（http： / /clab.labshare.cn/cb-dock/php/index.php） 將篩選出來的受體與配體進(jìn)行在線對接處理，比較對接后的Vina score 值，再進(jìn)行對比分析。
2.2 細(xì)胞實(shí)驗
2.2.1 Erastin 誘導(dǎo)劑最佳作用劑量和時間篩選 將HepG2細(xì)胞分為空白組、Erastin 誘導(dǎo)劑組，空白組只加DMEM 培養(yǎng)基，Erastin 誘導(dǎo)劑組分別加入含10、20、30、40 μmol/L Erastin 的DMEM 培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、36、48 h 后棄培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm 波長處測量各孔吸光度。
2.2.2 肝豆扶木湯凍干粉最佳作用劑量和時間篩選 將HepG2 細(xì)胞分為空白組、肝豆扶木湯凍干粉組，空白組只加DMEM 培養(yǎng)基，肝豆扶木湯凍干粉組分別加入含5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL 凍干粉和最佳作用濃度Erastin 的DMEM 培養(yǎng)基，在Erastin 最佳作用時間點(diǎn)換液3 次后棄培養(yǎng)液，每孔加10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm 波長處測量各孔吸光度。
2.2.3 分組及給藥 實(shí)驗分為空白組 （HepG2 細(xì)胞＋PBS）、模型組（HepG2 細(xì)胞＋Erastin 誘導(dǎo)劑） 和肝豆扶木湯低、中、高劑量組（HepG2 細(xì)胞＋Erastin 誘導(dǎo)劑＋160、320、640 μg/mL 肝豆扶木湯凍干粉）。取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞，接種于平底培養(yǎng)板，每組設(shè)3 個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，模型組加入最佳濃度的Erastin 誘導(dǎo)劑，肝豆扶木湯組同時加入最佳濃度的Erastin 誘導(dǎo)劑和不同質(zhì)量濃度的凍干粉，空白組加入等量PBS 溶液，處理至Erastin 誘導(dǎo)劑最佳時間點(diǎn)時進(jìn)行換液，繼續(xù)處理至凍干粉最佳作用時間后檢測相關(guān)指標(biāo)。
2.2.4 GSH、MDA 水平檢測 取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞，接種于6 孔板，按“2.2.3” 項下方法處理，按照相關(guān)試劑盒說明書操作步驟檢測GSH、MDA 水平。
2.2.5 ROS 水平檢測 取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞，接種于6 孔板，按“2.2.3” 項下方法處理，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min，其間顛倒混勻4 ～5 次，使細(xì)胞與探針充分接觸，再用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，除去多余的DCFH-DA，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，NovoExpress 軟件分析并計算熒光強(qiáng)度值。
2.2.6 Western blot 法檢測細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá) 按“2.2.3” 項下方法處理細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加P53 （1 ∶500）、SLC7A11 （1 ∶500）、GPX4 （1 ∶500）、β-actin （1 ∶500）一抗，4 ℃孵育過夜，加相應(yīng)二抗繼續(xù)孵育2 h，顯影，用Image J 軟件分析條帶灰度值。
2.2.7 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA表達(dá) 按“2.2.3” 項下方法處理細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達(dá)，引物序列見表1。
表1 引物序列
2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，若滿足正態(tài)性和方差齊性，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，組間多重比較采用LSD 法； 反之，采用Kruskal-Wallis 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 生物信息學(xué)
3.1.1 活性成分及作用靶點(diǎn) 以Score cutoff≥20、P＜0.05為條件進(jìn)行檢索，得到肝豆扶木湯方中化學(xué)成分226 種，其中何首烏16 種，枸杞子46 種，白芍18 種，三七51 種，土茯苓13 種，柴胡63 種，郁金18 種。以O(shè)B ≥30%、DL≥0.18 為條件，篩選得到214 種化學(xué)成分。
3.1.2 作用靶點(diǎn)篩選 共得到肝豆扶木湯活性成分潛在作用靶點(diǎn)10 463 個，其中何首烏298 個，枸杞子2 077 個，白芍300 個，三七3 964 個，土茯苓367 個，柴胡1 845個，郁金1 612 個，剔除重復(fù)部分，得到潛在作用靶點(diǎn)1 741個。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得274 個與鐵死亡相關(guān)的靶基因，相關(guān)度值（Relevance score） 定義為≥3，最終獲得與鐵死亡相關(guān)的靶基因23 個。將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，最終收集11 個共同作用靶點(diǎn)用于分子對接分析，見圖1。
圖1 肝豆扶木湯活性成分靶點(diǎn)與鐵死亡靶點(diǎn)的韋恩圖
3.1.3 分子對接 將11 個鐵死亡核心靶蛋白與對應(yīng)的肝豆扶木湯活性成分進(jìn)行分子對接，并根據(jù)Vina score 值繪制熱圖（圖2），其中Vina score＜-7.0，表明靶蛋白與活性成分結(jié)合性好，而且Vina score 值越小，兩者結(jié)合能力越強(qiáng)［11］。由此可知，肝豆扶木湯的主要活性成分維生素B2、抗壞血酸、γ-氨基丁酸、尼克酸、維生素C、核黃素、芍藥二酮、鬼傘毒素、苯乙酮、3，4-二甲基苯甲酸、鄰苯二酸辛酯、白芷素、壬烯酸、亞麻酸、姜黃酮、莪術(shù)二酮、姜黃烯、香芹酮與鐵死亡核心靶點(diǎn)SLC7A11 蛋白均有很強(qiáng)的結(jié)合能力，再繪制對接模式圖（圖3）。此外，維生素B2、核黃素、芍藥二酮、白芷素、莪術(shù)二酮與TP53、ACSL4、ACSL4、VDAC2、VDAC3、ALOX15、PRKAA1、MDM2 靶蛋白均有良好的結(jié)合能力。
圖2 肝豆扶木湯活性成分與鐵死亡核心靶蛋白分子對接熱圖
圖3 肝豆扶木湯活性成分與SLC7A11 蛋白對接模式圖
3.2 細(xì)胞實(shí)驗
3.2.1 Erastin 誘導(dǎo)劑最佳作用劑量、時間篩選 與空白組比較，10 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)劑作用12、24、36、48 h 時細(xì)胞活性均高于50%，20 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)劑作用12、24 h時細(xì)胞活性均高于50%，30 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)劑作用36、48 h 時細(xì)胞活性均低于50%，40 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)劑作用12、24、36、48 h 時細(xì)胞活性均低于50%，故選擇30 μmol/L、24 h 分別作為Erastin 誘導(dǎo)劑最佳作用劑量、時間，見表2。
表2 Erastin 誘導(dǎo)劑不同作用劑量、時間下細(xì)胞相對活性（±s，n＝3）
表2 Erastin 誘導(dǎo)劑不同作用劑量、時間下細(xì)胞相對活性（±s，n＝3）
注： 與空白組比較，*P＜0.05。
組別劑量/（μmol·L-1）12 h24 h36 h48 h空白組01.002±0.0111.003±0.0221.014±0.0161.001±0.021 Erastin 誘導(dǎo)劑組100.879±0.041*0.825±0.029*0.783±0.027*0.692±0.063*200.688±0.017*0.649±0.044*0.509±0.040*0.469±0.014*300.557±0.060*0.496±0.029*0.282±0.011*0.249±0.018*400.287±0.044*0.214±0.021*0.176±0.014*0.146±0.012*
3.2.2 肝豆扶木湯凍干粉最佳作用劑量、時間篩選 與空白組比較，5 μg/mL 凍干粉作用48、72 h 時，10、20、40、80 μg/mL 凍干粉作用24、48 h 時，以及160 μg/mL 凍干粉作用24 h 時細(xì)胞活性降低（P＜0.05）； 40、80、160 μg/mL凍干粉作用72 h 時，320 μg/mL 凍干粉作用48、72 h 時，以及640 μg/mL 凍干粉作用24、48、72 h 時細(xì)胞活性升高（P＜0.05），故選擇160、320、640 μg/mL 分別作為低、中、高劑量，見表3。
表3 肝豆扶木湯凍干粉不同作用劑量、時間下細(xì)胞相對活性（±s，n＝3）
表3 肝豆扶木湯凍干粉不同作用劑量、時間下細(xì)胞相對活性（±s，n＝3）
注： 與空白組比較，*P＜0.05。
組別劑量/（μg·mL-1）24 h48 h72 h空白組01.003±0.0221.001±0.0210.999±0.013肝豆扶木湯凍干粉組50.984±0.0140.824±0.033*0.914±0.072*100.935±0.010*0.846±0.068*0.991±0.048 200.867±0.013*0.853±0.078*1.037±0.049 400.822±0.008*0.917±0.034*1.084±0.061*800.787±0.018*0.950±0.066*1.129±0.042*1600.920±0.014*1.075±0.0341.174±0.01*3201.051±0.0221.286±0.027*1.305±0.009*6401.170±0.061*1.330±0.068*1.364±0.029*
3.2.3 肝豆扶木湯對Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞GSH、MDA、ROS 水平的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞GSH 水平降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01），ROS 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯各劑量組細(xì)胞GSH 水平升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01），ROS 熒光強(qiáng)度減弱（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖4。結(jié)果表明，肝豆扶木湯能提高HepG2 細(xì)胞GSH 水平，降低MDA、ROS 水平，提高抗氧化能力，抑制HepG2 細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。
圖4 肝豆扶木湯對HepG2 細(xì)胞GSH、MDA、ROS 水平的影響（±s，n＝3）
3.2.4 肝豆扶木湯對Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞P53 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），SLC7A11 和GPX4 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯中、高劑量組細(xì)胞P53 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），肝豆扶木湯各劑量組細(xì)胞SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖5。結(jié)果表明，肝豆扶木湯抑制HepG2細(xì)胞鐵死亡的作用可能與其下調(diào)P53 蛋白表達(dá)，上調(diào)SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)有關(guān)。
圖5 肝豆扶木湯對HepG2 細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）
3.2.5 肝豆扶木湯對Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞P53 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，肝豆扶木湯各劑量組細(xì)胞P53 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖6。結(jié)果表明，肝豆扶木湯抑制HepG2 細(xì)胞鐵死亡的作用與其下調(diào)P53 mRNA 表達(dá)，上調(diào)SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)有關(guān)。
圖6 肝豆扶木湯對HepG2 細(xì)胞P53、SLC7A11、GPX4 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝3）
4 討論
肝損害幾乎是每一個Wilson 病患者都存在的癥狀，如不能及時有效地進(jìn)行干預(yù)，易出現(xiàn)暴發(fā)性肝衰竭，甚至導(dǎo)致死亡［3］。如能早期有效干預(yù)，則能顯著延緩肝損害的病理進(jìn)程［12］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對Wilson 病肝損害的分子機(jī)制研究取得了一定的進(jìn)展［13-14］。Wilson 病患者存在鐵代謝障礙，鐵離子的沉積在疾病的進(jìn)展中起到重要作用［15-16］。分子對接技術(shù)是通過計算機(jī)模擬化合物與蛋白質(zhì)受體匹配的模式和親和力，是現(xiàn)代藥物探索和新藥發(fā)現(xiàn)的重要工具［17］。故本研究將肝豆扶木湯的活性成分與鐵死亡相關(guān)蛋白進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示鐵死亡關(guān)鍵蛋白SLC7A11 與肝豆扶木湯的活性成分具有良好的結(jié)合能力。
肝豆扶木湯是針對Wilson 病肝損害的病機(jī)特點(diǎn)創(chuàng)立而成［18］，由枸杞子、白芍、制何首烏、三七粉、土茯苓、柴胡、郁金組成，課題組前期臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗研究證實(shí)該方對Wilson 病肝損害具有保護(hù)作用［19］?，F(xiàn)代藥理表明，肝豆扶木湯的活性成分具有抗氧化等作用［20-21］。本研究采用Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞構(gòu)建鐵死亡模型，以肝豆扶木湯干預(yù)，發(fā)現(xiàn)肝豆扶木湯能提高HepG2 細(xì)胞的抗氧化能力，對細(xì)胞具有保護(hù)作用。細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA 升高及GSH 消耗是氧化應(yīng)激的標(biāo)志，也是鐵死亡發(fā)生的標(biāo)志之一。本研究結(jié)果顯示，HepG2 細(xì)胞經(jīng)Erastin 誘導(dǎo)后，其ROS 和MDA 水平升高，GSH 水平降低，說明Erastin 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激； 而肝豆扶木湯干預(yù)降低了ROS 和MDA 水平，提高了GSH 水平，說明肝豆扶木湯具有抗氧化的作用。
SLC7A11 可促進(jìn)細(xì)胞對胱氨酸的攝取和GSH 合成，提高抗氧化能力，保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡［22］。P53 可以抑制SLC7A11 表達(dá)，導(dǎo)致GSH 合成受損并增加消耗，促進(jìn)鐵死亡［23］。GPX4 是一種抗氧化酶，能降低ROS 水平來抑制鐵死亡的發(fā)生，而GSH 缺失可使GPX4 失活［24］。抑制GPX4活性可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物積累發(fā)生鐵死亡［25］。當(dāng)SLC7A11表達(dá)被抑制，胱氨酸吸收減少，GSH 合成被影響，導(dǎo)致GPX 活性降低，抗氧化能力下降，ROS 積聚，最終導(dǎo)致鐵死亡［26］。本研究采用Erastin 誘導(dǎo)處理HepG2 細(xì)胞后，其P53 蛋白和mRNA 表達(dá)升高，SLC7A11、GPX4 蛋白和mRNA 表達(dá)降低，說明Erastin 處理后的HepG2 細(xì)胞發(fā)生了鐵死亡； 而肝豆扶木湯干預(yù)后下調(diào)了P53 蛋白和mRNA 表達(dá)，上調(diào)了SLC7A11、GPX4 蛋白和mRNA 表達(dá)，說明肝豆扶木湯能夠抑制鐵死亡，且可能通過SLC7A11/GPX4 軸對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。
綜上所述，肝豆扶木湯能通過降低ROS 和MDA 水平，提高GSH 水平，下調(diào)P53 表達(dá)，上調(diào)SLC7A11 和GPX4 表達(dá)來減輕HepG2 細(xì)胞的鐵死亡，其作用可能是通過調(diào)控SLC7A11/GPX4 軸實(shí)現(xiàn)的。本研究為臨床運(yùn)用肝豆扶木湯治療Wilson 病患者肝損害提供科學(xué)證據(jù)。
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