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    紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠黑素細(xì)胞功能的影響

    2023-10-30 06:12:26彭子輝王潤(rùn)和李進(jìn)先
    中成藥 2023年10期
    關(guān)鍵詞:涂藥黑素細(xì)胞紫草

    王 解,彭子輝,王潤(rùn)和,李進(jìn)先,李 剛

    [襄陽(yáng)市中心醫(yī)院(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院) 皮膚科,湖北 襄陽(yáng) 441003]

    白癜風(fēng)是一種多見(jiàn)于青少年的皮膚科常見(jiàn)疾病,患者黑素細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)目減少及功能受損,臨床癥狀以毛發(fā)、黏膜或皮膚色素脫失為主,發(fā)病部位常定位于手腳,但有時(shí)也能蔓延到面部,使患者常因外表而痛苦尷尬,導(dǎo)致部分患者抑郁[1-2]。白癜風(fēng)是一種慢性炎癥性皮膚病,免疫T 細(xì)胞的分化參與介導(dǎo)其發(fā)病過(guò)程,Th17 細(xì)胞及其表達(dá)合成的促炎因子IL-17 在白癜風(fēng)患者體內(nèi)增加,抑制Th17 細(xì)胞分化,可保護(hù)黑素細(xì)胞,減輕白癜風(fēng)患者色素脫失癥狀[3-4];IL-23 作為一種炎性因子,可激活Th17 細(xì)胞信號(hào),引發(fā)炎癥,在胸腺炎等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用[5],且IL-23 及Th17 細(xì)胞因子IL-17 水平在白癜風(fēng)患者血清中升高[6],表明IL-23/Th17 信號(hào)是白癜風(fēng)的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。紫草素是紫草科紫草LithospermumerythrorhizonSieb.et Zucc.根中的活性成分,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等生物學(xué)功效,可降低炎癥因子IL-6、IL-17 和IL-23 水平,抑制其促炎癥作用,改善銀屑病患者癥狀,對(duì)白癜風(fēng)也有較好療效[7-8],但其藥理機(jī)制目前還未明確。本文以紫草素處理白癜風(fēng)模型小鼠,探討其對(duì)白癜風(fēng)小鼠黑素細(xì)胞功能的影響及作用機(jī)理。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 C57BL/6 小鼠,SPF 級(jí),體質(zhì)量13 ~17 g,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK (魯) 2019-0003],在動(dòng)物中心適應(yīng)飼養(yǎng)1 周,溫度21 ℃,相對(duì)濕度45%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循國(guó)家及單位關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則,并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)2019-10)。

    1.2 試劑 氫醌、羧甲基纖維素鈉 (批號(hào)20170704、F20090916,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。紫草素對(duì)照品(純度≥98%,美國(guó)Sigma-Aldrich 公司)。白癜風(fēng)膠囊(0.45 g/粒,批號(hào)20170527,長(zhǎng)春銀諾克藥業(yè)有限公司)。HE 染色試劑盒、小鼠IL-23 ELISA 試劑盒、小鼠IL-17 ELISA 試劑盒、紅細(xì)胞裂解液、動(dòng)物總RNA 快速抽提試劑盒[生工生物工程(上海) 股份有限公司]; 小鼠α-黑色素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)ELISA 試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒(日本TaKaRa 公司);IL-23、β-actin、IL-17 引物(蘇州吉瑪基因股份有限公司); FITCCD4 單克隆抗體、FITC-IL-17 單克隆抗體(上海北諾生物科技有限公司)。

    1.3 儀器 Multiskan FC 型酶標(biāo)儀(上海騰名生物科技有限公司); DM4000 型光學(xué)顯微鏡、RM2245 型切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司); 7900HT 型熒光定量PCR 儀、3900 型高通量DNA 合成儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司); FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dicknson 公司); TD-4M 型低溫高速離心機(jī)(濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司)。

    2 方法

    2.1 模型建立、分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、白癜風(fēng)膠囊(504 mg/kg) 組和紫草素低、中、高劑量(20、40、80 mg/kg) 組,每組12 只。除對(duì)照組外其余各組按參照文獻(xiàn)[9] 報(bào)道制備白癜風(fēng)模型,小鼠頸背部脫毛,每天均勻涂抹0.5 mL 2.5%氫醌軟膏(將1 g 羧甲基纖維素鈉、2.5 g 氫醌加到100 mL 去離子水中,磁力攪拌1 h,即得),持續(xù)60 d (每5 d 脫毛1 次),觀察到小鼠脫毛區(qū)毛發(fā)、膚色變白,表示造模成功。對(duì)照組12 只小鼠于背部脫毛處每日均勻涂抹空白基質(zhì)(將1 g 羧甲基纖維素鈉加到100 mL 去離子水中,磁力攪拌1 h,即得)。

    以生理鹽水溶解紫草素、白癜風(fēng)膠囊內(nèi)容物,制得2、4、8 mg/mL 紫草素[10],50.4 mg/mL 白癜風(fēng)膠囊[11]藥液,用藥組小鼠每天上午10: 00 灌胃給予對(duì)應(yīng)藥液10 mL/kg,模型組、對(duì)照組小鼠每天上午10: 00 灌胃給予生理鹽水10 mL/kg,每天1 次,持續(xù)21 d。

    2.2 小鼠毛發(fā)脫色情況檢測(cè)及標(biāo)本采集 末次給藥24 h后,觀察小鼠涂藥(2.5%氫醌軟膏) 部位和非涂藥部位脫色情況,參照文獻(xiàn)[12] 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分,每個(gè)部位總分5分。毛發(fā)基本無(wú)脫色為0 分,0<毛發(fā)脫色面積≤10% 為1分,11%≤毛發(fā)脫色面積≤25%為2 分,26%≤毛發(fā)脫色面積≤50% 為3 分,51% ≤毛發(fā)脫色面積≤75% 為4 分,76%≤毛發(fā)脫色面積≤100%為5 分。脫頸處死小鼠,取腹主動(dòng)脈血2.0 mL,6 只小鼠血液中加入紅細(xì)胞裂解液,冰水浴孵育0.5 h,100×g離心,取細(xì)胞沉淀備用; 剩余6 只小鼠血液100×g離心,取血清備用(保存于-80 ℃)。剪取小鼠造模處皮膚組織0.5 g (保存于液氮),再剪取小鼠造模處皮膚組織(1 cm×1 cm),多聚甲醛固定。

    2.3 HE 染色觀察小鼠皮膚病理組織學(xué) 取“2.2” 項(xiàng)下固定的小鼠皮膚組織,脫水、透明、包埋后切片,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行HE 染色,封片后置于顯微鏡下觀察皮膚組織病理形態(tài),并掃描橫切面,采用CaseViewer 軟件分析同等放大倍數(shù)下視野中黑色素毛囊、基底層黑素細(xì)胞數(shù)。

    2.4 小鼠血清α-MSH、TYR、IL-23、IL-17 水平檢測(cè) 取“2.2” 項(xiàng)下小鼠血清,冰水浴中提前解凍,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)α-MSH、TYR、IL-23、IL-17 水平。

    2.5 小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例檢測(cè) 取“2.2” 項(xiàng)下小鼠外周血細(xì)胞沉淀,以PBS 緩沖液洗滌后重懸,計(jì)數(shù)后調(diào)整密度為1.0×106/mL,取1 mL 懸液,依次加入FITC-CD4、FITC-IL-17 單克隆抗體混勻,上機(jī)檢測(cè),計(jì)算Th17 細(xì)胞比例。

    2.6 小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取“2.2” 項(xiàng)下于-80 ℃保存的小鼠皮膚組織,提取總RNA 后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),制得cDNA,均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,配制RT-qPCR 反應(yīng)預(yù)混液,加入皮膚組織cDNA 模板,混勻后上機(jī)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系配制和反應(yīng)條件設(shè)定均按照熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)進(jìn)行,以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,2-ΔΔCT法分析IL-23、IL-17 mRNA 相對(duì)表達(dá),引物序列見(jiàn)表1。

    表1 引物序列

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料以(±s) 表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠毛發(fā)脫色評(píng)分的影響 與對(duì)照組比較,模型組小鼠涂藥部位、非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分升高(P<0.05); 與模型組比較,紫草素各劑量組小鼠涂藥部位、非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分降低(P<0.05),并呈劑量依賴(lài)性(P<0.05); 與白癜風(fēng)膠囊組比較,紫草素高劑量組小鼠涂藥部位、非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表2。

    表2 各組小鼠毛發(fā)脫色評(píng)分比較(分,±s,n=12)

    表2 各組小鼠毛發(fā)脫色評(píng)分比較(分,±s,n=12)

    注: 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05; 與紫草素低劑量組比較,△P<0.05; 與紫草素中劑量組比較,▲P<0.05。

    組別涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分對(duì)照組0±00±0模型組4.25±0.67*2.00±0.43*紫草素低劑量組2.75±0.52#1.42±0.16#紫草素中劑量組1.42±0.31#△0.75±0.08?!髯喜菟馗邉┝拷M0.42±0.05?!鳌?.08±0.03#△▲白癜風(fēng)膠囊組0.50±0.10?!鳌?.17±0.04?!鳌?/p>

    3.2 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠皮膚病理組織學(xué)和黑素細(xì)胞的影響 對(duì)照組小鼠皮膚組織表皮無(wú)增生,含有大量黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞; 與對(duì)照組比較,模型組小鼠皮膚組織表皮增生,黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05); 與模型組比較,紫草素各劑量組小鼠皮膚組織表皮增生減輕,黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05),并呈劑量依賴(lài)性; 與白癜風(fēng)膠囊組比較,紫草素高劑量組小鼠皮膚組織表皮增生程度相似,黑色素毛囊、基底層黑素細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)圖1、表3。

    圖1 各組小鼠皮膚組織HE 染色(×200)

    表3 各組小鼠黑色素毛囊、基底層黑素細(xì)胞數(shù)比較(個(gè),±s,n=12)

    表3 各組小鼠黑色素毛囊、基底層黑素細(xì)胞數(shù)比較(個(gè),±s,n=12)

    注: 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05; 與紫草素低劑量組比較,△P<0.05; 與紫草素中劑量組比較,▲P<0.05。

    組別黑色素毛囊數(shù)基底層黑素細(xì)胞數(shù)對(duì)照組112.06±17.34143.37±20.02模型組38.52±6.12*58.86±8.78*紫草素低劑量組65.42±7.54#80.92±10.61#紫草素中劑量組85.23±10.07?!?07.75±12.07#△紫草素高劑量組109.58±12.19?!鳌?40.83±18.04?!鳌遵帮L(fēng)膠囊組108.06±11.94#△▲138.96±17.47?!鳌?/p>

    3.3 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠血清α-MSH、TYR 水平的影響 與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清α-MSH、TYR 水平降低(P<0.05); 與模型組比較,紫草素各劑量組小鼠血清α-MSH、TYR 水平升高(P<0.05),并呈劑量依賴(lài)性; 與白癜風(fēng)膠囊組比較,紫草素高劑量組小鼠血清α-MSH、TYR 水平無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表4。

    表4 各組小鼠血清α-MSH、TYR 水平比較(μg/L,±s,n=6)

    表4 各組小鼠血清α-MSH、TYR 水平比較(μg/L,±s,n=6)

    注: 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05; 與紫草素低劑量組比較,△P<0.05; 與紫草素中劑量組比較,▲P<0.05。

    組別α-MSHTYR對(duì)照組24.03±2.1092.67±7.08模型組13.95±1.02*60.02±3.42*紫草素低劑量組16.73±1.25#70.43±4.10#紫草素中劑量組20.44±1.46?!?1.98±4.23?!髯喜菟馗邉┝拷M23.78±1.43#△▲91.41±3.94#△▲白癜風(fēng)膠囊組23.57±1.50?!?0.76±4.05?!鳌?/p>

    3.4 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例的影響 與對(duì)照組比較,模型組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例升高(P<0.05); 與模型組比較,紫草素各劑量組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例降低(P<0.05),并呈劑量依賴(lài)性; 與白癜風(fēng)膠囊組比較,紫草素高劑量組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表5。

    表5 各組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例比較(±s,n=6)

    表5 各組小鼠外周血Th17 細(xì)胞比例比較(±s,n=6)

    注: 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05; 與紫草素低劑量組比較,△P<0.05; 與紫草素中劑量組比較,▲P<0.05。

    組別Th17 細(xì)胞比例/%對(duì)照組1.13±0.09模型組3.45±0.31*紫草素低劑量組2.76±0.28#紫草素中劑量組1.98±0.20?!髯喜菟馗邉┝拷M1.25±0.19?!鳌遵帮L(fēng)膠囊組1.30±0.13?!鳌?/p>

    3.5 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠血清IL-23、IL-17 水平的影響 與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清因子IL-23、IL-17 水平升高(P<0.05); 與模型組比較,紫草素各劑量組小鼠血清IL-23、IL-17 水平降低(P<0.05),并呈劑量依賴(lài)性; 與白癜風(fēng)膠囊組比較,紫草素高劑量組小鼠血清IL-23、IL-17水平無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表6。

    表6 各組小鼠血清IL-23、IL-17 水平比較(ng/L,±s,n=6)

    表6 各組小鼠血清IL-23、IL-17 水平比較(ng/L,±s,n=6)

    注: 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05; 與紫草素低劑量組比較,△P<0.05; 與紫草素中劑量組比較,▲P<0.05。

    組別IL-23IL-17對(duì)照組123.00±8.74112.16±9.05模型組273.51±21.23*227.38±15.81*紫草素低劑量組227.64±15.41#190.95±12.63#紫草素中劑量組187.21±10.73?!?54.72±10.78#△紫草素高劑量組130.05±12.42?!鳌?19.84±9.47#△▲白癜風(fēng)膠囊組134.58±11.92?!鳌?22.91±10.04?!鳌?/p>

    3.6 紫草素對(duì)白癜風(fēng)小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)升高(P<0.05); 與模型組比較,紫草素各劑量組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)降低(P<0.05),并呈劑量依賴(lài)性; 與白癜風(fēng)膠囊組比較,紫草素高劑量組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表7。

    表7 各組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)比較(±s,n=12)

    表7 各組小鼠皮膚組織IL-23、IL-17 mRNA 表達(dá)比較(±s,n=12)

    注: 與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05; 與紫草素低劑量組比較,△P<0.05; 與紫草素中劑量組比較,▲P<0.05。

    組別IL-23/β-actinIL-17/β-actin對(duì)照組1.01±0.170.97±0.13模型組3.62±0.34*3.43±0.30*紫草素低劑量組2.75±0.27#2.65±0.28#紫草素中劑量組1.92±0.22?!?.90±0.20?!髯喜菟馗邉┝拷M1.10±0.19?!鳌?.09±0.16?!鳌遵帮L(fēng)膠囊組1.15±0.24?!鳌?.13±0.25?!鳌?/p>

    4 討論

    目前白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制還未得到明確闡釋?zhuān)芯空哒J(rèn)為環(huán)境因素、遺傳因素、外傷、心理因素、自身免疫失衡等均與白癜風(fēng)發(fā)生有關(guān)。激素治療、手術(shù)與激光治療在臨床得到廣泛應(yīng)用,但療效并不顯著,且費(fèi)用高昂,副作用較多,因此探尋安全有效的治療方法是臨床迫切所需[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)背部脫毛區(qū)均勻涂抹2.5%氫醌軟膏的方法構(gòu)建白癜風(fēng)模型小鼠,結(jié)果顯示,建模小鼠皮膚組織表皮增生,涂藥部位和非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分、血清IL-23 及IL-17水平、皮膚組織IL-23 及IL-17 mRNA 表達(dá)升高,表明氫醌軟膏可誘導(dǎo)促炎因子大量合成釋放,引發(fā)炎癥,造成毛發(fā)脫色。α-MSH 是垂體產(chǎn)生的一種激素,可促進(jìn)黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素,而TYR 是調(diào)控黑色素合成的關(guān)鍵酶,血清α-MSH、TYR 水平可反映黑素細(xì)胞功能[9,15]。本研究結(jié)果顯示,模型小鼠黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞數(shù)、血清α-MSH、TYR 水平降低,表明氫醌軟膏可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞死亡,破壞其功能。以上結(jié)果提示白癜風(fēng)小鼠模型建立成功。

    紫草素是提取自紫草的天然藥物成分,還是治療白癜風(fēng)的中藥制劑白癜風(fēng)膠囊中含有的重要活性成分,可抑制促炎因子表達(dá),促使抗炎因子表達(dá),緩解人牙髓細(xì)胞炎癥,對(duì)銀屑病、白癜風(fēng)等多種皮膚病具有較明顯的治療作用[7-8,16-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,以不同劑量紫草素處理白癜風(fēng)模型小鼠,能減輕小鼠皮膚組織表皮增生,降低涂藥部位和非涂藥部位毛發(fā)脫色評(píng)分、血清IL-23 及IL-17 水平,升高黑色素毛囊及基底層黑素細(xì)胞數(shù)、血清α-MSH 及TYR水平,且呈劑量依賴(lài)性,表明紫草素可抑制促炎因子表達(dá)合成,減輕炎癥,緩解黑素細(xì)胞功能損傷,改善小鼠毛發(fā)脫色情況,且在一定劑量范圍內(nèi),紫草素劑量越高,作用越強(qiáng)。

    白癜風(fēng)是一種自身免疫性炎癥疾病,免疫細(xì)胞Th17 的激活分化與其發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。研究顯示,白癜風(fēng)患者體內(nèi)Th17 細(xì)胞數(shù)量增加,皮膚組織Th17 細(xì)胞因子IL-17 水平也升高,IL-23 是調(diào)控Th17 細(xì)胞活化的重要炎性因子,能刺激Th17 細(xì)胞激活,促使其生成促炎因子IL-17,引發(fā)黑素細(xì)胞受損,導(dǎo)致白癜風(fēng),因而IL-23/Th17 軸可作為白癜風(fēng)的一個(gè)防治靶點(diǎn)[3-6,18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,白癜風(fēng)模型小鼠外周血中Th17 細(xì)胞比例、皮膚組織IL-23 及IL-17 mRNA 表達(dá)升高; 經(jīng)紫草素給藥后,其外周血中Th17 細(xì)胞比例、皮膚組織IL-23 及IL-17 mRNA 表達(dá)降低,表明IL-23/Th17 軸參與介導(dǎo)白癜風(fēng)的發(fā)病過(guò)程,紫草素可阻止IL-23/Th17 通路激活,抑制免疫T 細(xì)胞向Th17 分化,降低炎性因子IL-23、IL-17 表達(dá)釋放,減輕白癜風(fēng)小鼠脫色癥狀。

    綜上所述,紫草素可下調(diào)IL-23、IL-17 表達(dá),抑制免疫Th17 細(xì)胞活化,降低其比例,減輕黑素細(xì)胞炎癥損傷,改善其功能,促進(jìn)黑色素合成,緩解白癜風(fēng)小鼠脫色癥狀,阻斷IL-23/Th17 信號(hào)傳導(dǎo)可能是其藥理機(jī)制之一。但本實(shí)驗(yàn)未通過(guò)上調(diào)和下調(diào)該信號(hào)進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證,后續(xù)會(huì)對(duì)其藥理機(jī)制進(jìn)行深入探討。

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