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    基于TLR4 /MyD88/NF-κB 通路探討茯磚茶改善ApoE-/- 小鼠非酒精性脂肪肝的作用

    2023-10-30 06:12:22張文將段麗芳楊冬梨劉圓月
    中成藥 2023年10期
    關(guān)鍵詞:磚茶汀組灌胃

    張文將,段麗芳,孟 濤,李 鑫,楊冬梨,劉圓月

    (1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西 咸陽 712046; 2.益陽醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,湖南 益陽 413000;3.湖南省白沙溪茶廠股份有限公司,湖南 安化 413500)

    非酒精性脂肪肝 (nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD) 為慢性進行性肝臟疾病,我國NAFLD 患病率高達29.2%,已經(jīng)逐漸超越病毒性肝炎,成為我國第一大肝病,該病可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌,同時NAFLD 的長期存在增加了動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS) 和2 型糖尿病罹患風(fēng)險,且中晚期很難逆轉(zhuǎn),因此早期防治尤為關(guān)鍵[1-3]?!岸未驌簟?學(xué)說無法解釋NAFLD 形成的復(fù)雜機制,“多重平行打擊” 學(xué)說認為慢性、持續(xù)性、低度非感染性炎癥反應(yīng)為NAFLD 發(fā)展過程中的一個重要病理特征[4]。有研究證實長期高脂飲食可破壞腸黏膜屏障功能,大量內(nèi)毒素隨門靜脈入血進入肝臟,激活肝實質(zhì)細胞和肝庫普弗細胞上的Toll 樣受體4 (Toll-like receptor 4,TLR4) /髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor88,MyD88) /核因子Kappa B (nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路,引起肝臟炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗的發(fā)生,促使脂質(zhì)在肝臟的沉積,從而為NAFLD 的發(fā)生創(chuàng)造條件[5]。

    NAFLD 防治尚無特效藥物,抗氧化劑的應(yīng)用為防治NAFLD 提供新思路。茯磚茶屬于黑茶類,除了具有抗氧化作用的茶多糖及茶多酚外,在發(fā)酵過程中形成了冠突散囊菌屬等優(yōu)勢益生菌,是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有應(yīng)用潛力的微生物[6-7]。課題組前期實驗證實茯磚茶可通過抑制甘油三酯合成,減輕機體炎癥反應(yīng),抑制肥胖和AS 形成,降低肝重及肝指數(shù),但是深入機制尚不明確[8]。因此,本研究通過高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng)載脂蛋白E 敲除 (apolipoprotein E,ApoE-/-) 小鼠4 個月的方法復(fù)制NAFLD 模型,同時予以茯磚茶灌胃干預(yù),檢測TLR4/MyD88/NF-κB 通路上的關(guān)鍵因子的基因表達變化,以期為NAFLD 的早期防治提供新的實驗依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動物 50 只8 周齡SPF 級雄性ApoE-/-小鼠,體質(zhì)量(20±5) g,品系名ApoE Cas9-KO,遺傳背景C57BL/6; 10只8 周齡C57BL/6J 雄性野生型小鼠,購于南京大學(xué)生物模式中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK (蘇) 2015-0001]。小鼠飼養(yǎng)于SPF 實驗室,室內(nèi)IVC 獨立送風(fēng)隔離籠,儀器壓差20 Pa,相對濕度50% ~70%,溫度(24±0.5)℃,晝夜光照節(jié)律,每籠5 只,各組小鼠定量喂養(yǎng),自由飲水(Ⅲ級水),每2 d 更換1 次墊料,籠具及水瓶定期消毒。ApoE-/-小鼠采用高脂輻照飼料(含21%脂肪、0.15%膽固醇,貨號H10141,北京華阜康生物科技股份有限公司) 喂養(yǎng),飼料于-20 ℃下保存,取需用量于4 ℃冰箱中短期保存。

    1.2 藥物 2014 年茯磚茶(湖南省白沙溪茶廠),經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉柏炎教授鑒定原料為茶葉一級嫩料壓筑而成,色澤黑褐,金花茂盛。阿托伐他?。ㄝx瑞制藥有限公司,批號110590)。

    1.3 試劑 TRIzol 試劑 (美國Invitrogen 公司,批號50175111); 熒光定量PCR 試劑盒(日本TaKaRa 公司,批號A152172A); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (美國 Thermo Fisher Scientific 公司,批號00692424)。引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

    1.4 儀器 Z32HK 型高速冷凍離心機(德國Hermle 公司); BX-51 型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司); 核酸蛋白濃度測定儀(英國Bio-Drop 公司); PCR 擴增儀(美國Bio-Rad 公司); 熒光定量PCR 儀(德國Eppendorf 公司)。

    2 方法

    2.1 藥物制備 茯磚茶掰成分散片狀后用無菌紗布包裹投入無菌燒杯中,加入實驗用Ⅲ級水浸泡30 min (加水量沒過茶葉2~3 cm),武火煮開后文火煎煮30 min,藥液冷卻后過濾,取汁; 二次煎煮加水量以淹沒藥包為準,沸騰后冷卻,將2 次濾液合并,濃縮至所需體積,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?,依?jù)茶吸收實驗推薦成人每日攝入量為10 g (166.7 mg/kg),參照人與小鼠體表面積換算得小鼠所需劑量為1.44 g/kg[9],設(shè)置茯磚茶高、中、低劑量分別為2.16、1.44、0.72 g/kg。阿托伐他汀使用前將藥片放入干凈研缽中碾碎,加入生理鹽水溶解,攪拌成混懸液,按10 mg/kg劑量進行灌胃,現(xiàn)配現(xiàn)用。

    2.2 分組、造模與給藥 將50 只8 周齡雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機分為模型組(10 mL/kg 生理鹽水)、阿托伐他汀組(10 mg/kg) 和茯磚茶高、中、低劑量組(2.16、1.44、0.72 g/kg),每組10 只,定量予以高脂飼料喂養(yǎng); 另設(shè)同周齡雄性C57BL/6J 小鼠10 只作為空白組,定量予以普通維持飼料喂養(yǎng)。各組小鼠于每天早上9 點予以相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃干預(yù)17 周[10-11]。

    2.3 標本收集與處理 各組小鼠給藥第17 周末禁食不禁水12 h,麻醉后摘眼球取血,全血室溫靜置2 h,4 ℃、3 000 r/min 離心15 min,取血清于-80 ℃冰箱中保存待測。頸椎脫臼處死小鼠,取肝臟稱重,預(yù)冷生理鹽水漂洗,取各組小鼠相同部位肝葉(約1 cm×1 cm×1 cm) 于4%多聚甲醛中固定,用于HE 染色; 取約100 mg 肝組織于盛有1 mL 預(yù)冷TRIzol 的無RNA 酶凍存管中,液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存,用于RT-qPCR 檢測。

    2.4 HE 染色觀察肝組織病理形態(tài) 肝組織于4 ℃、4%多聚甲醛中固定48 h,經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、4 μm 切片、烤片、染色后封片,于顯微鏡下觀察。按照《NASH 臨床研究網(wǎng)病理工作指南》 對NAFLD 活動度積分 (NAFLD activity score,NAS) 進行半定量分析[12],具體評判標準為①肝細胞脂肪變,0 分(<5%),1 分(5% ~33%),2 分(34% ~66%),3 分(>66%); ②小葉內(nèi)炎癥(20 倍鏡計數(shù)壞死灶),0 分(無),1 分(>2 個),2 分(2 ~4 個),3 分(>4 個); ③肝細胞氣球樣變,0 分(無),1 分(少見),2 分(多見)。

    2.5 RT-qPCR 法檢測肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達 TRIzol 法提取肝組織總RNA,采用核酸蛋白濃度測定儀測定RNA 濃度和質(zhì)量,按試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)程序為42 ℃,60 min;70 ℃,5 min; 4 ℃維持。隨后進行PCR 擴增反應(yīng),反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,循環(huán)40 次。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA 相對表達,引物序列見表1。

    表1 引物序列

    2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理,實驗數(shù)據(jù)以(±s) 表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD 檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 茯磚茶對小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

    3.1.1 肉眼觀察 如圖1 所示,空白組小鼠肝臟大小適中,暗紅色,邊緣銳利; 模型組小鼠肝臟體積增大,黃色油膩感,邊緣較鈍; 茯磚茶高劑量組小鼠肝臟稍大,暗紅為主,色稍黃,邊緣稍鈍; 茯磚茶中劑量組小鼠肝臟體積適中,顏色暗紅,邊緣銳利; 茯磚茶低劑量組小鼠肝臟體積增大,顏色黃色油膩感,邊緣變鈍; 阿托伐他汀組小鼠肝臟體積變大,黃色油膩感,邊緣鈍。

    圖1 各組小鼠肝臟肉眼觀察

    3.1.2 HE 染色鏡觀察 如圖2 所示,空白組低倍鏡下肝小葉輪廓清晰,中央靜脈居中,肝索放射狀分布,肝血竇清晰; 高倍鏡下肝細胞大小均勻,細胞核居中,胞質(zhì)均質(zhì)紅染。模型組低倍鏡下肝小葉輪廓模糊,肝索非放射狀排列,肝血竇不清; 高倍鏡下肝細胞體積變大,大小不一,界限不清,胞漿疏松化,有大量的空泡形成。茯磚茶高劑量組低倍鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)完整,中央靜脈居中,部分細胞核偏位,胞漿淡染疏松化; 高倍鏡下肝細胞大小較均勻,細胞核居中,胞漿淡染,部分胞漿有少量空泡形成。茯磚茶中劑量組低倍鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)完整,中央靜脈居中,肝索呈放射狀,肝血竇較為清晰; 高倍鏡下細胞核居中、胞漿淡染疏松化,有部分體積較小空泡形成。茯磚茶低劑量組低倍鏡下肝小葉輪廓及肝血竇欠清晰; 高倍鏡下可見大量的空泡變性。阿托伐他汀組低倍鏡下肝小葉輪廓及肝血竇紋理欠清晰; 高倍鏡下可見胞漿淡染疏松化、細胞核偏位,存在大小不等的空泡形成。

    圖2 各組小鼠肝組織HE 染色

    3.1.3 NAS 評分 與空白組比較,模型組小鼠肝臟NAS 評分升高(P<0.05); 與模型組比較,阿托伐他汀組和茯磚茶各劑量組小鼠肝臟NAS 評分降低(P<0.05); 與阿托伐他汀組比較,茯磚茶各劑量組小鼠肝臟NAS 評分降低(P<0.05),見表2。

    表2 各組小鼠肝臟NAS 評分比較(±s,n=10)

    表2 各組小鼠肝臟NAS 評分比較(±s,n=10)

    注: 與空白組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05; 與阿托伐他汀組比較,△P<0.05。

    組別NAS 評分/分空白組0.00±0.00模型組6.72±0.49*阿托伐他汀組4.43±0.52#茯磚茶高劑量組3.24±0.42?!鬈虼u茶中劑量組2.92±0.57?!鬈虼u茶低劑量組3.82±0.42#△

    3.2 茯磚茶對TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關(guān)因子mRNA 表達的影響 與空白組比較,模型組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達升高(P<0.05);與模型組比較,阿托伐他汀組和茯磚茶各劑量組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達降低(P<0.05); 與阿托伐他汀組比較,茯磚茶高、中劑量組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、FASmRNA 表達降低(P<0.05),茯磚茶高劑量組小鼠肝組織IL-1βmRNA 表達降低(P<0.05),見表3。

    表3 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FAS mRNA 表達比較(±s,n=10)

    表3 各組小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FAS mRNA 表達比較(±s,n=10)

    注: 與空白組比較,*P<0.05; 與模型組比較,#P<0.05; 與阿托伐他汀組比較,△P<0.05。

    組別TLR4MyD88NF-κBIL-1βFAS空白組1.00±0.071.09±0.071.12±0.181.06±0.121.01±0.13模型組5.64±0.80*2.05±0.16*2.00±0.27*3.04±0.84*3.74±0.49*阿托伐他汀組3.55±0.45#1.58±0.26#1.60±0.20#1.37±0.38#2.32±0.44#茯磚茶高劑量組1.96±0.54#△1.35±0.12?!?.34±0.28?!?.14±0.17?!?.42±0.20?!鬈虼u茶中劑量組1.82±0.41#△1.32±0.10?!?.27±0.30#△1.44±0.27#1.21±0.19?!鬈虼u茶低劑量組2.96±0.36#△1.70±0.08#1.58±0.34#1.73±0.28?!?.26±0.65#

    4 討論

    近年來提出的“腸-肝軸” 理論認為,腸道菌群失調(diào)在NAFLD 的形成中發(fā)揮著重要作用[13]。研究顯示,NAFLD患者比正常人群更容易出現(xiàn)小腸細菌過度生長,導(dǎo)致富有脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS) 成分的細菌含量升高[14]。腸道內(nèi)毒素通過門脈系統(tǒng)到達肝臟,被肝臟實質(zhì)細胞中的TLR4或者Kupffer 細胞所識別[15-16]。LPS 激活TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路后促使大量炎癥因子的釋放,造成肝細胞的損傷[17]。通過阻斷TLR4通路來抑制炎癥反應(yīng),已經(jīng)成為了干預(yù)肝臟疾病的有效途徑之一[18]。

    課題組前期實驗證實,茯磚茶預(yù)防性灌胃給藥可減輕NAFLD 小鼠肝臟氧化損傷[19],降低血清IL-1β、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α) 等炎癥因子表達[8],由此證實NAFLD 模型小鼠確實存在慢性非感染性炎癥現(xiàn)象,而茯磚茶灌胃給藥可以起到抑制炎癥反應(yīng)的效果,但其抗炎機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,茯磚茶各劑量組和阿托伐他汀組預(yù)防性灌胃給藥均可抑制小鼠肝組織TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、FASmRNA 表達,其中茯磚茶高、中劑量組抑制效果優(yōu)于低劑量組和阿托伐他汀組,由此可見適當濃度茯磚茶預(yù)防性灌胃給藥發(fā)揮著較好預(yù)防NAFLD 形成效果。阿托伐他汀為臨床抑制膽固醇合成常用降脂藥物,在本實驗中雖可抑制NAFLD 形成,但其效果不如茯磚茶高、中劑量組,考慮可能是研究過程中阿托伐他汀所用劑量并非治療最佳劑量所致。FAS 為催化乙酰輔酶A 和丙二酸單酰輔酶A 合成脂肪酸的關(guān)鍵限速酶,其表達量的增加會導(dǎo)致甘油三酯在體內(nèi)的蓄積,由此可見FAS 系統(tǒng)在NAFLD 的發(fā)生與發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[20]。本實驗結(jié)果顯示肝臟FAS基因表達和肝臟脂肪變性程度呈正相關(guān),由此可見茯磚茶預(yù)防性灌胃給藥可抑制肝臟脂類物質(zhì)的合成,從而達到了延緩肝脂變的效果。

    茯磚茶作為一種后發(fā)酵茶,有報道顯示茯磚茶水提物可明顯恢復(fù)高脂飲食小鼠引起的厚壁菌門/擬桿菌門比值的升高,提高雙歧桿菌科細菌的相對豐度[21]。茯磚茶中的冠突散囊菌增加了小鼠腸道中產(chǎn)生乙酸和丁酸的細菌,可以部分逆轉(zhuǎn)高脂飲食小鼠腸道菌群失調(diào)[22]。由此可見對腸道菌群失衡的調(diào)節(jié)可能是茯磚茶發(fā)揮作用的重要因素,但茯磚茶是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群而抑制肝臟TLR4/MyD88/NF-κB 通路激活尚不明確,后續(xù)將完善通路關(guān)鍵因子蛋白表達實驗,并配合細胞實驗對該通路進一步驗證。

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