基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 信號(hào)通路探討化濁解毒消癰方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用

婁瑩瑩，李佃貴，楊 倩，李 燕，王思月，王志成，胡 賀

（1.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011； 2.河北省中西醫(yī)結(jié)合胃腸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050011； 3.河北中醫(yī)藥大學(xué)，河北 石家莊 050200）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC） 又稱(chēng)為慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，現(xiàn)病因不明并且反復(fù)發(fā)作、輕重不等，腹部疼痛、便中帶黏液膿血、頻繁腹瀉、里急后重為其臨床表現(xiàn)，病位在乙狀結(jié)腸和直腸。該病發(fā)病率逐年上升，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)約有1/5 慢性UC 患者可能發(fā)展成結(jié)直腸癌［1-2］，稱(chēng)之為“綠色癌癥”。UC 難以治愈，容易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響個(gè)人健康和生活質(zhì)量，對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生系統(tǒng)和社會(huì)造成巨大的挑戰(zhàn)［3］。

UC 普遍被認(rèn)為與感染、精神心理、先天遺傳、自身免疫等綜合因素相關(guān)，但發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［4］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs） 中含有大量豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS） 持續(xù)、嚴(yán)重的情況下，激活蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK） -真核細(xì)胞起始因子2α （eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α） -C/EBP 同源蛋白 （C/EBP homologous protein，CHOP） 凋亡信號(hào)通路會(huì)引起細(xì)胞過(guò)度凋亡，導(dǎo)致腸黏膜損傷，是UC 發(fā)病的重要病理機(jī)制［5-6］。李佃貴教授以化濁解毒法為基本治療大法，在此基礎(chǔ)上提出潰瘍性結(jié)腸炎濁毒致病論，建立化濁解毒有效方劑——化濁解毒消癰方。前期研究表明，該方通過(guò)恢復(fù)Th1/Th2平衡、抑制UC 大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡發(fā)揮抗炎作用［7-8］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從調(diào)控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 信號(hào)通路角度出發(fā)，探討化濁解毒消癰方對(duì)UC 小鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用，從而探討其深層作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 化濁解毒消癰方由白頭翁12 g、藿香12 g、佩蘭12 g、茵陳15 g、黃連12 g、黃柏9 g、當(dāng)歸12 g、白芍20 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮12 g、半邊蓮12 g、秦皮15 g、苦參9 g、廣木香9 g 組成，購(gòu)于河北省中醫(yī)院中藥房，經(jīng)河北省中醫(yī)院相聰坤主任藥師鑒定為正品。美沙拉嗪腸溶片（0.25 g/片，批號(hào)210817），購(gòu)自葵花藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量18 ～22 g，6～8 周齡，購(gòu)自斯貝福（北京） 生物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2019-0010］，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （冀） 2022-011］，SPF 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，溫度（23±5）℃，相對(duì)濕度30% ～60%，光照/黑暗12 h/12 h。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)河北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)DWLL2021053）。

1.3 試劑 葡聚糖硫酸鈉（DSS，北京百諾威生物科技有限公司，批號(hào)S414）； β-actin、eIF2α、ATF4 一抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào) AC2020730004、157018041802、82019051502）； PERK 一抗（美國(guó)CST 公司，批號(hào)437028）； CHOP 一抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)10003427）。

1.4 儀器 D3024R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)［大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京） 股份公司］； Epoch 酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek公司）； NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì) （美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； alphaEaseFC 灰度分析軟件（美國(guó)Alpha Innotech 公司）； BV-2 垂直電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、美沙拉嗪組和化濁解毒消癰方高、中、低劑量組，每組8 只。除正常組外，其余各組給予小鼠2.5%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS） 溶液自由飲用7 d，其間禁水，并每日更換新鮮DSS 溶液，誘導(dǎo)小鼠UC 模型。模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)為（1） 小鼠體質(zhì)量明顯下降，出現(xiàn)腹瀉、便血癥狀； （2） 光鏡下HE 染色可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有隱窩膿腫，杯狀細(xì)胞缺失，甚則可見(jiàn)潰瘍形成。根據(jù)人與小鼠劑量換算［9］，造模成功后化濁解毒消癰方高、中、低劑量組分別灌胃給予28.68、14.34、7.17 g/kg化濁解毒消癰方，美沙拉嗪組灌胃給予0.45 g/kg 美沙拉嗪，正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)7 d。

2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI） 評(píng)分 參照Murano 等制定的DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠的生理狀況，包括精神狀態(tài)、糞便、活動(dòng)、毛發(fā)、體質(zhì)量、飲食等變化，進(jìn)行DAI 評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。DAI ＝ （體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)＋糞便性狀分?jǐn)?shù)＋便血情況分?jǐn)?shù)） /3。

表1 DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 結(jié)腸黏膜大體觀與組織病理學(xué)觀察 取結(jié)腸組織，肉眼觀察其形態(tài)變化。取部分上述組織，經(jīng)脫水、包埋、制備切片后行常規(guī)HE 染色，于光鏡下觀察病理形態(tài)變化。

2.4 RT-qPCR 法檢測(cè)結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達(dá) 取100 mg 結(jié)腸組織，TRIzol 一步法提取總RNA，使用Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度、純度，稀釋至終質(zhì)量濃度100 ～500 ng/μL。RNA 于PCR 儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)。引物序列見(jiàn)表2。

2.5 Western blot 法檢測(cè)結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá) 取100 mg 結(jié)腸組織，加10 倍量裂解液進(jìn)行勻漿，于冰上裂解30 min，離心后取上清液，使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，蛋白加熱變性后上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉30 min，加一抗（1 ∶1 000） 4 ℃搖床孵育過(guò)夜，次日洗膜3 次，加二抗（1 ∶3 000） 室溫孵育30 min，洗膜3 次后在暗室中顯影、定影，使用Alpha 軟件處理并分析目標(biāo)條帶的光密度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 26.0 軟件，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間比較采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊者組間比較采用Dunnett’s 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠一般情況 正常組小鼠皮毛光滑，精神狀態(tài)佳，反應(yīng)靈敏，飲水量及進(jìn)食量正常，體質(zhì)量稍增加； 模型組小鼠皮毛光澤度差，易掉毛，精神狀態(tài)差，反應(yīng)遲鈍，飲水量、進(jìn)食量及體質(zhì)量下降； 給藥7 d 后，美沙拉嗪組和化濁解毒消癰方各劑量組小鼠一般情況改善，掉毛減少，精神狀態(tài)尚可，活動(dòng)度尚可，飲水量、進(jìn)食量及體質(zhì)量有一定程度恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組死亡2 只，化濁解毒消癰方高、中劑量組各死亡1 只，低劑量組死亡1 只。

3.2 化濁解毒消癰方對(duì)UC 小鼠DAI 評(píng)分的影響 與正常組比較，模型組小鼠DAI 評(píng)分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，化濁解毒消癰方各劑量組和美沙拉嗪組小鼠DAI 評(píng)分均降低（P＜0.05）； 與美沙拉嗪組比較，化濁解毒消癰方高劑量組小鼠DAI 評(píng)分無(wú)明顯變化（P＞0.05），中、低劑量組小鼠DAI 評(píng)分升高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠DAI 評(píng)分比較（±s）

表3 各組小鼠DAI 評(píng)分比較（±s）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與美沙拉嗪組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只DAI 評(píng)分/分正常組80.00±0.00模型組62.25±0.24*美沙拉嗪組80.92±0.24?；瘽峤舛鞠b方高劑量組71.07±0.43?；瘽峤舛鞠b方中劑量組71.67±0.27＃▲化濁解毒消癰方低劑量組61.62±0.30＃▲

3.3 化濁解毒消癰方對(duì)UC 小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響 正常組小鼠結(jié)腸組織正常，黏膜光滑，可見(jiàn)上皮組織與腺體結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，未出現(xiàn)充血、水腫及潰瘍；模型組小鼠結(jié)腸組織嚴(yán)重?fù)p傷，黏膜水腫、充血，發(fā)現(xiàn)糜爛、潰瘍?cè)钚纬?，腺體排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)腸組織； 與模型組比較，化濁解毒消癰方高劑量組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織病理性損傷緩解，黏膜基本光滑，充血、水腫程度減輕，潰瘍較少并出現(xiàn)已愈合的潰瘍面，有基本完整的腺體結(jié)構(gòu)伴隨較少的被炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的腸組織； 化濁解毒消癰方中、低劑量組結(jié)腸組織病理性損傷減輕，黏膜表面欠光滑，輕度充血水腫，可見(jiàn)潰瘍面和少量被破壞的腺體結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)潰瘍面及邊緣覆少量新生腺體，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織HE 染色

3.4 化濁解毒消癰方對(duì)UC 小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）； 與模型組比較，化濁解毒消癰方各劑量組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）； 與美沙拉嗪組比較，化濁解毒消癰方高劑量組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），中、低劑量組PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA 表達(dá)比較（±s）

表4 各組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA 表達(dá)比較（±s）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與美沙拉嗪組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只PERKeIF2αATF4CHOP正常組80.68±0.070.77±0.090.89±0.090.78±0.11模型組61.71±0.14*1.90±0.18*2.08±0.14*2.34±0.29*美沙拉嗪組80.92±0.05＃1.07±0.04＃1.16±0.05＃1.09±0.14?；瘽峤舛鞠b方高劑量組70.88±0.09＃1.06±0.13＃1.19±0.12＃1.11±0.12＃化濁解毒消癰方中劑量組71.09±0.11?！?.34±0.13＃▲1.44±0.11?！?.43±0.09?！瘽峤舛鞠b方低劑量組61.39±0.12?！?.62±0.13?！?.70±0.12?！?.85±0.10?！?/p>

3.5 化濁解毒消癰方對(duì)UC 小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）； 與模型組比較，化濁解毒消癰方各劑量組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與美沙拉嗪組比較，化濁解毒消癰方高劑量組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化 （P＞0.05），中、低劑量組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)表5、圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織 PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白條帶

表5 各組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組小鼠結(jié)腸組織PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達(dá)比較（±s）

注： 與正常組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與美沙拉嗪組比較，▲P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)/只PERK/β-actineIF2α/β-actinATF4/β-actinCHOP/β-actin正常組80.30±0.030.22±0.020.08±0.010.19±0.01模型組60.88±0.02*0.49±0.14*0.46±0.03*0.66±0.02*美沙拉嗪組80.38±0.01＃0.25±0.01＃0.12±0.01＃0.30±0.16?；瘽峤舛鞠b方高劑量組70.41±0.01＃0.27±0.01＃0.18±0.02＃0.29±0.12?；瘽峤舛鞠b方中劑量組70.57±0.02?！?.31±0.02?！?.17±0.02＃▲0.45±0.16?！瘽峤舛鞠b方低劑量組60.71±0.04＃▲0.38±0.02?！?.27±0.12?！?.60±0.17?！?/p>

4 討論

UC 作為炎癥性腸病中的一種，發(fā)病率和患病率增長(zhǎng)迅速，預(yù)計(jì)到2025 年我國(guó)將有150 萬(wàn)例炎癥性腸病患者［10］，且具有發(fā)展成結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)［11-13］。UC 發(fā)生發(fā)展的重要原因之一是腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡［14］。通過(guò)抑制腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡，可以促進(jìn)腸黏膜愈合，實(shí)現(xiàn)治療UC 的作用。

細(xì)胞凋亡可以通過(guò)內(nèi)在線粒體通路、外在死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路來(lái)觸發(fā)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路主要是通過(guò)ERS 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，強(qiáng)烈持續(xù)的ERS 是誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡的重要途徑。細(xì)胞器受到內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激因素的刺激，胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER） 功能紊亂，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白大量堆積，引起ERS，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞，引起蛋白質(zhì)翻譯程度下降、靶基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，這種反應(yīng)稱(chēng)為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）［15］。嚴(yán)重且持續(xù)的ERS 會(huì)造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)超負(fù)荷，促生存模式的UPR 會(huì)立即轉(zhuǎn)為促凋亡模式，下游通路PERK/eIF2α/ATF4、IRE1/JNK/caspase12 和ATF6 分別激活，形成ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 途徑可以調(diào)控ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PERK 通過(guò)對(duì)自身磷酸化并且催化elF2α，對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成起到抑制作用，進(jìn)而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，同時(shí)通過(guò)活化轉(zhuǎn)錄活化因子4 （activating transcription factor 4，ATF4），上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白CHOP 的表達(dá)。CHOP 一方面對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)抑制，另一方面對(duì)抗促凋亡蛋白基因BAX/BA、BIM 的表達(dá)上調(diào)，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜完整性，使Ca2＋向胞質(zhì)外流； 同時(shí)CHOP 激活一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑上調(diào)caspase3 表達(dá)，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡［17-19］。研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細(xì)胞發(fā)生ERS 時(shí)，PERK/eIF2α 通路的激活可導(dǎo)致UC 發(fā)生發(fā)展［20-21］。

目前中醫(yī)藥治療UC 在臨床上效果顯著。國(guó)醫(yī)大師李佃貴教授首創(chuàng)中醫(yī)新理論—— “濁毒理論”，認(rèn)為濁毒稽留體內(nèi)，會(huì)對(duì)人體氣血、臟腑等造成影響，致使人體陰陽(yáng)平衡失調(diào)而發(fā)病，“濁毒” 貫穿UC 發(fā)展始終，肝郁、脾弱、腎虛為本，以濁毒、瘀為標(biāo)［22］?；瘽峤舛鞠b方由白頭翁湯、當(dāng)歸芍藥散、香連丸三方加減化裁而來(lái)，治療UC 療效顯著。本研究結(jié)果表明，經(jīng)化濁解毒消癰方干預(yù)后，UC 小鼠DAI 評(píng)分降低，結(jié)腸組織病理形態(tài)有所改善。與正常組比較，模型組小鼠PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 表達(dá)均升高； 經(jīng)化濁解毒消癰方給藥后，小鼠PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 表達(dá)均降低，其中高劑量組作用最佳，并且與美沙拉嗪組效果相當(dāng)。

綜上所述，DSS 誘導(dǎo)UC 小鼠中，ERS 參與了UC 發(fā)生發(fā)展，化濁解毒消癰方對(duì)UC 小鼠的腸黏膜保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制ERS 介導(dǎo)的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 信號(hào)通路，抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，減輕腸道黏膜損傷實(shí)現(xiàn)的。本研究為開(kāi)發(fā)UC 相關(guān)的新靶點(diǎn)藥物提供了新的依據(jù)。課題組將進(jìn)一步挖掘化濁解毒中藥深層作用機(jī)制，探討與中醫(yī)“濁毒”契合的分子基礎(chǔ)，為臨床治療UC 進(jìn)一步提供特色、有效藥物。