蘚生馬先蒿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

焦興蘋(píng)，達(dá)洛嘉，楊鳳梅

［青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥（藏藥） 質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016］

蘚生馬先蒿是傳統(tǒng)藏藥，在《四部醫(yī)典》 《度母本草》 《宇妥本草》 《藍(lán)琉璃》 中均有記載［1］，原標(biāo)準(zhǔn)收載于1995 年版《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（藏藥第一冊(cè)） 》 中，來(lái)源為玄參科植物蘚生馬先蒿PedicularismuscicolaMaxim.的干燥花。夏季采收，陰干。藏文名“露如木保” “漏日莫?！保哂袛慷?、生肌、清胃熱的作用，藏醫(yī)常用于食肉中毒。主治“培根木布” 病、熱性腹瀉、胃潰瘍、胃出血、肺病等［2-3］，在藏成藥“解毒膠囊” “四味石榴散” 中均有應(yīng)用［1］。其根為民間中藥材，異名土人參，具補(bǔ)元?dú)?、生津安神，?qiáng)心之功［4］。目前收載標(biāo)準(zhǔn)中僅有基原、性狀、顯微鑒別等檢驗(yàn)項(xiàng)目，缺少TLC 鑒別、檢查、含量測(cè)定等關(guān)鍵項(xiàng)目，無(wú)法有效控制該藥材質(zhì)量。

課題組對(duì)青海省部分藏醫(yī)院和藏藥制藥廠進(jìn)行實(shí)地考察，發(fā)現(xiàn)蘚生馬先蒿實(shí)際用藥部位為“干燥的全草”。調(diào)研結(jié)果顯示蘚生馬先蒿花難采集，且采集晾干后質(zhì)量嚴(yán)重?fù)p失，大規(guī)模生產(chǎn)中較難收集到大批量“干燥的花”，同時(shí)在《青海高原本草概要》［5］等部分文獻(xiàn)中記載其可以全草入藥［6-7］，因此實(shí)際應(yīng)用中均以“干燥的全草” 入藥。課題組在收集樣品的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)調(diào)研結(jié)果與實(shí)際情況相符，以花收集樣品較為困難。因此本實(shí)驗(yàn)以10批蘚生馬先蒿“干燥的全草” 為對(duì)象來(lái)研究。

1 材料

1.1 儀器 BX53 生物顯微鏡（日本Olympus 公司）； SQP 電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）； LC-20高效液相色譜儀（日本島津公司）； SX-4-10 箱式高溫電阻爐 （天津市泰斯特儀器有限公司）；101A-2E 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）； LINOMAT 5 半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪公司）；DT1028 CH 超聲波提取器（德國(guó)Bandelin 公司）。

1.2 藥材 10 批蘚生馬先蒿于2017 年至2020 年在青海、西藏、甘肅等地采集或收集，經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院焦興蘋(píng)主管藥師鑒定為玄參科植物蘚生馬先蒿PedicularismuscicolaMaxim.干燥全草，具體見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.3 試劑與藥物 桃葉珊瑚苷 （批號(hào)111761-200601）、毛蕊花糖苷 （批號(hào)111530-201713，純度92.5%）、京尼平苷酸 （批號(hào)111828-201805，純度98.1%） 對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院）。硅膠G 薄層板（10 cm×20 cm，青島海洋化工廠、德國(guó)默克公司）。甲醇為色譜純（德國(guó)默克公司）； 乙酸乙酯等其他試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 基原鑒別 本品為多年生草本，干時(shí)多少變黑，多毛。根莖粗，有分枝，端有宿存鱗片。莖叢生，在中間者直立，在外圍者多彎曲上升或傾臥，常成密叢。葉有柄； 葉片橢圓形至披針形，羽狀全裂?；ń砸干曰考撮_(kāi)始著生； 萼圓筒形，長(zhǎng)達(dá)11 mm，基部三角形而連于萼管，向上漸細(xì)，均全緣，至近端處膨大卵形，具有少數(shù)鋸齒； 花冠玫瑰色，外面有毛，盔直立部分很短，幾在基部即向左方扭折使其頂部向下，前方漸細(xì)為卷曲或S 形的長(zhǎng)喙，喙因盔扭折之故而反向上方卷曲。

2.2 性狀鑒別 本品為干燥帶花的全草。莖多斷裂，細(xì)長(zhǎng)且彎曲，偶見(jiàn)互生的葉，葉片細(xì)小多破碎?；ǘ喟櫩s，棕褐色或淺紫色。花梗細(xì)長(zhǎng)，萼齒5 枚?；ü诮颗まD(zhuǎn)，前方漸細(xì)成卷曲或S 形的長(zhǎng)喙。氣微香，味淡，微苦。見(jiàn)圖1。

圖1 蘚生馬先蒿性狀鑒別圖Fig.1 Trait identification image for P.muscicola

2.3 顯微鑒別 本品為粉末黃綠色?；ǚ哿o(wú)色或淡黃色，球形直徑18 ～25 μm，外壁薄，表面近光滑； 草酸鈣晶體眾多，散在或包含于細(xì)胞中； 網(wǎng)紋狀細(xì)胞類圓形，成群存在于細(xì)胞中； 導(dǎo)管以螺紋為主。見(jiàn)圖2。

圖2 蘚生馬先蒿顯微鑒別圖Fig.2 Microscopic identification image for of P.muscicola

2.4 TLC 鑒別 取本品粉末0.5 g，加10 mL 甲醇超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取桃葉珊瑚苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg 該成分的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部TLC 法（通則0502），吸取供試品、對(duì)照品溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（8 ∶0.5 ∶1 ∶1） 為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，3%三氯化鋁乙醇溶液顯色，在105 ℃下加熱，室溫放涼，在紫外光燈（365 nm） 下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，供試品在對(duì)照品相應(yīng)位置處顯相同的棕紅色熒光斑點(diǎn)。

圖3 蘚生馬先蒿TLC 色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of P.muscicola

2.5 水分 參照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部通則水分測(cè)定法第二法（烘干法） 測(cè)定，重復(fù)2 次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水分、灰分、浸出物含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝2）Tab.2 Results of water，ash and extract content determination （%，n＝2）

2.6 灰分 參照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部通則灰分測(cè)定法測(cè)定，重復(fù)2 次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.7 浸出物 參照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部通則浸出物測(cè)定法中水浸出物測(cè)定法測(cè)定，重復(fù)2次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.8 京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)［8-10］ 報(bào)道。

2.8.1 色譜條件 Waters XBridge ?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相甲醇（A） -0.5%醋酸（B），梯度洗脫（0 ～10 min，10% A；10 ～55 min，10% ～57% A； 55 ～60 min，57% ～10%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.8.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取京尼平苷酸對(duì)照品13.08 mg、毛蕊花糖苷對(duì)照品12.73 mg，置于50 mL 棕色量瓶中，60% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到兩者質(zhì)量濃度分別為256.62、235.50 μg/mL 的母液，分別精密吸取5 mL，置于25 mL 棕色量瓶中，60% 甲醇稀釋至刻度，即得（兩者質(zhì)量濃度分別為51.32、47.10 μg/mL）。

2.8.3 供試品溶液制備 取蘚生馬先蒿粉末（過(guò)3 號(hào)篩） 約0.1 g，精密稱定，置于具塞棕色三角瓶中，加入25 mL 60%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.8.4 系統(tǒng)適用性考察 取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.8.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。以京尼平苷酸峰計(jì)，各成分色譜峰理論塔板數(shù)應(yīng)大于3 000，分離度應(yīng)大于1.5。

圖4 各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.8.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.8.2”項(xiàng)下母液0.5、1.0、2.0、3.5、5.0 mL，置于10 mL 棕色量瓶中，60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度，在“2.8.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷方程分別為Y＝7 326.1X＋1 474 （r＝0.999 7）、Y＝6 788X＋13 360 （r＝0.999 9），分別在12.83 ～128.31、11.77 ～117.75 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.8.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.8.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD分別為0.75%、0.43%，表明儀器精密度良好。

2.8.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一份蘚生馬先蒿（S10） 粉末6 份，按“2.8.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.8.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量RSD 分別為1.86%、0.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（S10），于0、2、4、8、12、24 h 在“2.8.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為0.28%、1.14%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.9 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的蘚生馬先蒿（S10） 粉末6 份，每份約0.05 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 對(duì)照品溶液，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，在“2.8.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，京尼平苷酸平均加樣回收率為101%，RSD 為1.16%； 毛蕊花糖苷平均加樣回收率為101%，RSD 為1.08%。

2.8.10 樣品含量測(cè)定 取10 批蘚生馬先蒿粉末（過(guò)3 號(hào)篩） 各2 份，每份約0.1 g，精密稱定，按“2.8.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.8.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量 （以干燥品計(jì)），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝2）Tab.3 Results of content determination of various constituents （%，n＝2）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇、稀乙醇、70% 乙醇、水為溶劑，分別采用冷浸法、熱浸法對(duì)樣品進(jìn)行浸出物測(cè)定［11］，結(jié)果各方法所得含量依次為水浸出物-冷浸法（34.5%） ＞水浸出物-熱浸法（34.3%） ＞稀乙醇浸出物-冷浸法（30.9%） ＞稀乙醇浸出物-熱浸法（30.7%） ＞70% 乙醇浸出物-熱浸法（26.2%）＞70%乙醇浸出物-冷浸法（25.3%） ＞乙醇浸出物-熱浸法＞乙醇浸出物-冷浸法，考慮到操作方便、能源節(jié)約，最終采用水浸出物-冷浸法。另外，浸出物平均值為36.7%，下浮10% 約為33.0%，擬定蘚生馬先蒿中浸出物不得少于33.0%。

粉末鑒別中，顯微鏡下可觀察到較多花粉粒、草酸高晶體、網(wǎng)紋狀細(xì)胞、螺紋導(dǎo)管。檢查項(xiàng)中，總灰分偏高，平均值為15.8%，故對(duì)其進(jìn)行酸不溶性灰分測(cè)定，結(jié)果均較低，平均值為2.0%，說(shuō)明蘚生馬先蒿總灰分偏高是其生理性灰分較高所致，擬定總灰分不得超過(guò)20.0%，酸不溶性灰分不得超過(guò)4.0%。

蘚生馬先蒿中含有環(huán)烯醚萜類、酚酸類、多種糖苷類成分［12］。所含桃葉珊瑚苷具有肝臟保護(hù)、抗氧化等作用［13-14］； 京尼平苷酸具有消炎利膽等作用，在臨床上降壓作用明顯［15-16］； 毛蕊花糖苷有抗炎、抗氧化等作用［17-18］，均與蘚生馬先蒿主治功能相符，因此將桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷作為定性定量指標(biāo)。采用不同生產(chǎn)廠家的硅膠G 板（青島海洋化工廠、德國(guó)默克公司），在不同溫度（15、25 ℃）、相對(duì)濕度（20%、35%）下桃葉珊瑚苷斑點(diǎn)均顯色清晰，分離度均良好。另外，京尼平苷酸含量平均值為0.31%，毛蕊花糖苷含量平均值為1.78%，根據(jù)測(cè)定結(jié)果并結(jié)合采收季節(jié)、采收年限不同，暫定本品按干燥品計(jì)算，含京尼平苷酸（C16H22O10） 不得少于0.25%，毛蕊花糖苷（C29H36O15） 不得少于1.70%。