炆黃精炮制工藝優(yōu)化及其成分與色澤相關(guān)性分析

鄧延文，鐘凌云，劉 洪，王 碩，盧興美

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

黃精味甘，性平，具有補(bǔ)氣養(yǎng)脾、健脾潤肺益腎的功效，臨床常用于脾胃氣虛、胃陰不足等癥［1］。生品黃精口服有麻舌感及刺喉感［2］，需經(jīng)炮制才可服用。常見的炮制方法主要有清蒸、酒蒸、九蒸九曬制、炆制等［3-6］。炆制法首載于《肘后備急方》［7］，《建昌幫中藥炮制全書》［8］記載：“黃精經(jīng)炆或蒸制可去其副作用，使藥材味厚氣香，增強(qiáng)補(bǔ)脾益腎之力； 加酒則補(bǔ)而不膩，并增強(qiáng)補(bǔ)中氣，強(qiáng)筋骨之力”。2008 年版《江西省中藥炮制規(guī)范》［9］亦有收錄，但是其僅以黃精不同飲片的外觀性狀作為區(qū)分生、制黃精的手段，且炆黃精古法繁瑣，工藝參數(shù)不明確，難以保證產(chǎn)品質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃精炆制加工炮制工藝進(jìn)行深入探討，以Box-Behnken 響應(yīng)曲面法［10-12］結(jié)合層次分析法（AHP）、變異系數(shù)法優(yōu)選炆黃精炮制工藝； 并引入色差分析技術(shù)，測定炆黃精的色度值，研究其色度與成分的內(nèi)在變化規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)在保證炆黃精飲片療效，控制其質(zhì)量的基礎(chǔ)上，精簡炆黃精炮制工藝，使炆黃精的生產(chǎn)更加規(guī)范，質(zhì)控更加有效，以期為炆黃精飲片在炮制過程中質(zhì)量監(jiān)控提供數(shù)據(jù)支持，更好規(guī)范炆黃精生產(chǎn)工藝。

1 材料

1.1 儀器 SR-62 高品質(zhì)電腦色差儀（深圳市三恩時(shí)科技有限公司）； Waters 2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； 高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； 電子分析天平［十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； 二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）； 普析通用新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 多花黃精（批號(hào)202103） 由江西繼中堂健康科技有限公司提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院教授龔千鋒老師鑒定為正品。黃酒（批號(hào)20210608） 由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供。5-羥甲基糠醛、薯蕷皂苷元、D-無水葡萄糖對(duì)照品 （ 批號(hào) CHB-Q-096、CHB-S-094、CHB201122，純度≥98%） 均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。蒽酮為分析純（批號(hào)20150906），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 濃硫酸、無水乙醇為分析純，購自西隴科學(xué)股份有限公司； 水為純凈水，購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備 取生黃精適量，清水洗凈后加水浸泡12 h，取出，置入炆藥壇中炆制12 h，密閉，燜制12 h，取出，曬干，置于容器中，加入余汁、定量黃酒，拌勻浸潤，武火蒸制4 ～6 h，?；穑瑺F制12 h，待表面轉(zhuǎn)黑色時(shí)取出，曬至半干，切成斜厚片，曬干，即得。

2.2 多糖含量測定 參考文獻(xiàn)［1］ 報(bào)道。

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品3.3 mg，置于10 mL 量瓶中，加水定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取炮制品約0.25 g，加入150 mL 80%乙醇，加熱回流提取1 h，濾過，10 mL 80%熱乙醇洗滌殘?jiān)?，重?fù)3 次，收集殘?jiān)V紙，置于圓底燒瓶中，加熱回流提取1 h，濾過，10 mL 熱水洗滌殘?jiān)?、燒? 次，冷卻至室溫，移至250 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，加水至2.0 mL，搖勻，放入冰水浴中，緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，在冰水浴中放冷，保溫10 min，立即取出，再放入冰水浴中冷卻10 min，取出，在582 nm 波長處測定吸光度，以0.2% 蒽酮-硫酸溶液為空白對(duì)照。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝32.312X-0.022 （R2＝0.999 5），在0.003 3～0.019 8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 方法學(xué)考察 按照2020 年版 《中國藥典》［1］方法，測得精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率RSD 分別為0.03%、2.69%、2.78%、0.31%，平均加樣回收率為97.30%，均符合相關(guān)要求。

2.3 5-羥甲基糠醛含量測定 參考文獻(xiàn) ［13］報(bào)道。

2.3.1 色譜條件 Diamon-sil-C18（2）色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A） -水（B），梯度洗脫（0 ～8 min，13% A； 8 ～13 min，13% ～20% A； 13 ～18 min，20% ～50% A； 18 ～25 min，50% ～80%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長284 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，得0.238 mg/mL 貯備液，倍比稀釋至0.001 19、0.011 9、0.029 75、0.041 65、0.053 55、0.071 4、0.101 15、0.238 mg/mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取炮制品約2.0 g，加50 mL 50% 乙醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz） 處理1 h，50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上層，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝66 026 253.831 2X-248 276.698 7 （R2＝0.999 0），在0.001 19～0.238 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 方法學(xué)考察 按照2020 年版《中國藥典》［1］方法，測得精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率RSD 分別為0.74%、0.47%、0.82%、1.08%，平均加樣回收率為98.33%，均符合相關(guān)要求。

2.4 醇溶性浸出物測定 參考文獻(xiàn)［1］ 報(bào)道，精密稱取炮制品3 g，加100 mL 稀乙醇，稱定質(zhì)量，靜置1 h，水浴回流并維持微沸1 h，冷卻后稱定質(zhì)量，稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，量取25 mL 濾液蒸干，在105 ℃下烘干3 h，冷卻30 min，稱定質(zhì)量，以干燥品計(jì)算醇溶性浸出物含量。

2.5 總皂苷含量測定 參考文獻(xiàn)［4，14］ 報(bào)道。

2.5.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷元對(duì)照品5.08 mg，置于5 mL 量瓶中，80%乙醇定容，搖勻，即得（該成分質(zhì)量濃度為1.016 mg/mL）。

2.5.2 供試品溶液制備 稱取炮制品1.0 g，加入20 mL 80%乙醇超聲提取30 min，共2 次，合并濾液至50 mL 量瓶中，80%無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.3 線性關(guān)系考察 精密吸取0.2 mL “2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液至1 mL 量瓶中，定容，搖勻，精密吸取0.4 mL，再分別吸取0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于具塞試管中，揮去乙醇，加入0.2 mL 5% 香草醛-冰醋酸溶液，在冰水浴中加入0.8 mL 高氯酸，搖勻，在60 ℃水浴中加熱15 min，迅速取出放入冰浴中5 min，加入5 mL 冰醋酸溶液，搖勻，靜置5 min，在550 nm 波長處測定吸光度（A）。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝2.336 1X＋0.163 4 （R2＝0.999 0），在0.008 128～0.711 2 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.4 方法學(xué)考察 按照2020 年版《中國藥典》［1］方法，測得精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率RSD 分別為0.70%、0.41%、0.91%、0.28%，平均加樣回收率為96.07%，均符合相關(guān)要求。

2.6 水溶性浸出物測定 參考文獻(xiàn)［1］ 報(bào)道，精密稱取炮制品3 g，加100 mL 水，稱定質(zhì)量，靜置1 h，水浴回流并維持微沸1 h，冷卻，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，量取25 mL 濾液蒸干，在105 ℃下烘干3 h，冷卻30 min，稱定質(zhì)量，以干燥品計(jì)算水溶性浸出物含量。

2.7 外觀性狀評(píng)分

2.7.1 色度值 采用黑白板校正現(xiàn)代色差儀，選擇D65 光源、4 mm 孔徑、SCE 模式，測定L*、a*、b*，重復(fù)3 次，得總色度 （E*ab）。其中，L*表示白-黑軸，白色為“＋”，黑色為“-”； a*表示紅-綠軸，紅色為“＋”，綠色為“-”； b*表示黃-藍(lán)軸，黃色為“＋”，藍(lán)色為“-”。

2.7.2 方法學(xué)考察 按照相關(guān)方法，測得精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD 均小于3%，均符合相關(guān)要求。

2.8 指標(biāo)權(quán)重確定

2.8.1 變異系數(shù)法 根據(jù)文獻(xiàn)［15-16］ 報(bào)道，變異系數(shù)計(jì)算公式為，其中Vi是第i項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)，即標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)，σi是第i項(xiàng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差，i是第i項(xiàng)指標(biāo)的平均數(shù)。各指標(biāo)權(quán)重計(jì)算公式為。結(jié)果，多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛、醇溶性浸出物、水溶性浸出物含量權(quán)重系數(shù)分別為0.152 0、0.267 5、0.544 1、0.024 9、0.011 5。

2.8.2 層次分析法 （AHP） 根據(jù)2020 年版《中國藥典》 及文獻(xiàn)［17-18］ 報(bào)道，將各指標(biāo)劃分為4 個(gè)層次，分別為多糖含量，權(quán)重系數(shù)為7；總皂苷、5-羥甲基糠醛含量，權(quán)重系數(shù)為4； 醇溶性浸出物含量，權(quán)重系數(shù)為2； 水溶性浸出物含量，權(quán)重系數(shù)為1。CR 為隨機(jī)一致性比率，公式為，其中CI 為一致性指標(biāo)，其數(shù)值越小，一致性越大，公式為，小于0.1 表示矩陣符號(hào)一致性良好，即權(quán)重系數(shù)合理有效［19］，結(jié)果見表1。

表1 各指標(biāo)成對(duì)比較優(yōu)先判斷矩陣、權(quán)重系數(shù)Tab.1 Priority judgment matrices and weight coefficients for pair comparison of various indices

2.8.3 變異系數(shù)-AHP 復(fù)合加權(quán)法 根據(jù)文獻(xiàn)［20-21］ 報(bào)道，公式為，其中Wi為變異系數(shù)法所得權(quán)重，WA為AHP 法所得權(quán)重。結(jié)果，多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛、醇溶性浸出物、水溶性浸出物含量復(fù)合權(quán)重分別為0.243 4、0.244 7、0.497 8、0.011 4、0.002 6。

2.9 炮制工藝優(yōu)化 采用Box-Behnken 響應(yīng)面法。

取400 g 黃精，以黃酒用量（A）、炆制時(shí)間（B）、蒸制時(shí)間（C） 為影響因素，每個(gè)因素3 個(gè)水平，具體見表2，按“2.8.4” 項(xiàng)下方法計(jì)算綜合評(píng)分（Y），測定色度值，結(jié)果見表3～4、圖1。

圖1 生黃精、炆黃精圖Fig.1 Images of raw Polygonati Rhizoma and stewed Polygonati Rhizoma

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n＝3）Tab.3 Design and results of tests （n＝3）

表4 色度值測定結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of colorimetric value determination（n＝3）

采用DesignExpert 8.06 軟件對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得方程為Y＝30.58-5.67A-9.43B＋0.823 8C＋15.24AB-4.73AC-1.47BC＋22.10A2＋7.17B2-11.90C2，方差分析見表5。由此可知，模型P＜0.05，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型擬合度良好，無失擬因素存在；各因素影響程度依次為B＞A＞C； 因素B、AB、A2、C2有顯著影響（P＜0.05）。響應(yīng)面分析見圖2。

圖2 黃酒用量、炆制時(shí)間的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for Chinese yellow rice wine dosage and stewing time

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

采用Design-Expert 8.06 軟件，得到最優(yōu)炮制工藝為400 g 生黃精以清水洗凈，加水浸泡12 h 后取出，置入炆藥壇中炆制8 h，密閉，燜制12 h，取出，曬干，置于容器內(nèi)，加入余汁、定量黃酒，拌勻浸潤，武火蒸5 h 后?；?，燜制12 h，待表面轉(zhuǎn)黑色時(shí)取出。曬至半干，切成斜厚片，曬干，即得，每100 kg 黃精用15 kg 黃酒。

2.10 相關(guān)性分析 將L*、a*、b*與“2.9” 項(xiàng)下指標(biāo)成分含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)，采用Origin 2021 軟件繪制變化趨勢圖，見圖3，再采用GraphPad Prism 8 軟件將兩者進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果見表6、圖4。由此可知，L*值與多糖含量呈極顯著正相關(guān)，與總皂苷、5-羥甲基糠醛含量呈顯著正相關(guān)，表現(xiàn)為L*值越大，多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛含量越高； a*值與醇溶性浸出物含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為a*值越大，醇溶性浸出物含量越低，表明多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛含量與黃精色度值存在關(guān)聯(lián)。

圖3 指標(biāo)成分含量、色度值趨勢圖Fig.3 Trend charts for index component contents and colorimetric values

圖4 皮爾遜相關(guān)性分析熱圖Fig.4 Heatmap of Pearson correlation analysis

表6 皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果Tab.6 Results of Pearson correlation analysis

2.11 逐步回歸分析 采用SPSS 21.0 軟件中的逐步回歸分析，選擇色度值作為自變量，判斷色度值對(duì)指標(biāo)成分含量的影響程度，結(jié)果見表7～8，再轉(zhuǎn)換色度值作為因變量，分析指標(biāo)成分含量對(duì)色度值的影響程度，結(jié)果見表9～10。

表7 指標(biāo)成分含量逐步回歸方差分析Tab.7 Analysis of variance for stepwise regression of index component contents

表8 指標(biāo)成分含量、色度值回歸系數(shù)Tab.8 Regression coefficients for index component contents and colorimetric values

表9 色度值逐步回歸方差分析Tab.9 Analysis of variance for stepwise regression of colorimetric values

表10 色度值、指標(biāo)成分含量回歸系數(shù)Tab.10 Regression coefficients for colorimetric values and index component contents

由此可知，多糖含量與L*、b*值有顯著相關(guān)性，表現(xiàn)為L*值越大，多糖含量越高，b*值越大，多糖含量越低； 總皂苷與L*值有顯著相關(guān)性，表現(xiàn)為L*值越大，總皂苷含量越高； 醇溶性浸出物含量與a*值有顯著相關(guān)性，表現(xiàn)為a*值越大，醇溶性浸出物越低； 5-羥甲基糠醛含量與L*、a*值有顯著相關(guān)性，表現(xiàn)為L*值越大，5-羥甲基糠醛含量越高，a*值越大，5-羥甲基糠醛含量越低。

3 討論

建昌幫為全國中藥炮制的四大流派之一，以擅長傳統(tǒng)飲片加工炮制著稱，而炆黃精就是其傳統(tǒng)特色炮制飲片之一。本實(shí)驗(yàn)以2008 年版《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》［9］以及《建昌幫中藥傳統(tǒng)炮制法》［8］中記載的炆黃精炮制方法為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法，以多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛、醇溶性浸出物、水溶性浸出物等5 種成分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)炆黃精炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝為400 g 生黃精以清水洗凈，加水浸泡12 h 后取出，置入炆藥壇中炆制8 h，密閉，燜制12 h，取出，曬干，置于容器內(nèi)，加入余汁、定量黃酒，拌勻浸潤，武火蒸5 h 后?；穑瑺F制12 h，待表面轉(zhuǎn)黑色時(shí)取出，曬至半干，切成斜厚片，曬干，即得，每100 kg 黃精用15 kg 黃酒。研究表明，優(yōu)化后的炆黃精工藝，可較大程度保留多糖、總皂苷等有效成分的含量，可以保證炆黃精的藥效。其次，優(yōu)化后炆黃精工藝參數(shù)明確具體，與傳統(tǒng)工藝相比，縮短了炆制時(shí)間，減少了黃酒的用量，有利于工業(yè)化大生產(chǎn)和生產(chǎn)成本的降低。

本實(shí)驗(yàn)通過色差分析儀測定炆黃精的L*、a*、b*值，通過SPSS 21.0、GraphPad Prism 8.0軟件關(guān)聯(lián)炆黃精的化學(xué)成分含量和色度，得到皮爾遜相關(guān)性以及逐步回歸方差結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃精炮制品的成分與L*、a*值密切相關(guān)，L*值越大，多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛含量越高； a*值越大，醇溶性浸出物含量越低。由此可知，炆黃精顏色越黑，其多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛含量就越低。本方法的建立能夠?yàn)闇?zhǔn)確判定炆黃精炮制程度提供參考依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以多糖、總皂苷、5-羥甲基糠醛、醇溶性浸出物、水溶性浸出物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用變異系數(shù)法結(jié)合層次分析法（AHP） 優(yōu)選炆黃精炮制工藝，通過成分分析發(fā)現(xiàn)炆黃精經(jīng)炮制后外觀色澤與其自身化學(xué)成分具有顯著相關(guān)性，以特定某種顏色來判斷黃精炮制程度，揭示古人對(duì)炆黃精以“表面轉(zhuǎn)黑色” 為炮制終點(diǎn)的炮制科學(xué)內(nèi)涵。