赤雹根化學成分的研究

毛曉霞，聶 佳，佟繼銘，馬 帥，劉永平，郝 婷

（承德醫(yī)學院，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德 067000）

赤雹為葫蘆科赤雹屬植物，以果實或塊根入藥，塊根在民間主要用來治療腰腿疼痛、軟組織挫傷、痛經(jīng)、乳汁不下等癥［1］?？傇碥帐浅啾⒏闹饕钚猿煞?，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、抗類風濕性關節(jié)炎等作用［2-3］。為了進一步闡明赤雹根總皂苷的化學組成，尋找天然活性皂苷類化合物，本研究采用硅膠、ODS、制備HPLC 等方法對赤雹根總皂苷開展了分離純化、結構鑒定、活性評價等，首次從赤雹根中分離得到的5 個齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，其中3 個化合物為新化合物，結構見圖1。

圖1 化合物1～3 結構Fig.1 Structures of compounds 1-3

1 材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； AVANCE Ⅲ400 NMR 波譜儀（德國Bruker公司）； IRAffinity-1 紅外光譜儀、LC-10AS 半制備色譜儀（日本島津公司）； Waters XBridgeTMPrep C18、Discovery C18、ultimate HILI Amide 色譜柱（美國Waters 公司）； 層析硅膠、硅膠板（青島海洋化工廠）； ODS RP-18 硅膠、硅膠60 F254薄層色譜板（德國Merck 公司）。L-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽、鄰甲苯異硫氰酸酯（上海麥克林生化科技股份有限公司）；D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸對照品（中國食品藥品檢定研究院）。乙腈、甲醇為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）； 其他試劑均為分析純； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

赤雹根于2016 年10 月采自河北省青龍縣，經(jīng)承德醫(yī)學院趙春穎研究員鑒定為葫蘆科植物赤雹ThladianthadubiaBunge 的干燥塊根，標本（編號20161006） 保存于承德醫(yī)學院中藥研究所。

2 方法

2.1 提取與分離 將13 kg 赤雹根粉碎，45%乙醇加熱回流提取3 次，每次1 h，回收乙醇濃縮至1.15 g/mL，加入95%乙醇至體積分數(shù)為80%，靜置24 h，濾過，回收乙醇，得粗浸膏1.2 kg，用水稀釋，過HPD-100 型大孔樹脂柱，依次用水、30%乙醇、75%乙醇梯度洗脫，收集75%乙醇洗脫液，回收乙醇至無醇味，用水飽和的正丁醇萃取，得相應萃取物，即為總皂苷。

總皂苷（120 g） 經(jīng)硅膠柱分離，以三氯甲烷-甲醇-水（18 ∶7 ∶1、14 ∶7 ∶1） 梯度洗脫，TLC檢識合并，得Fr.A ～Fr.H。Fr.B （32 g） 經(jīng)硅膠柱分離，以乙酸乙酯-甲醇-0.1%甲酸（26 ∶2 ∶1）洗脫，TLC 檢識合并，得Fr.B1 ～Fr.B6，F(xiàn)r.B2（4.6 g） 經(jīng)ODS 柱分離，以30% ～90%甲醇梯度洗脫，合并相似組分，得Fr.B2-1～Fr.B2-5，F(xiàn)r.B2-5（3 g） 經(jīng)制備HPLC 純化，以乙腈-0.1% 甲酸（40 ∶60） 洗脫，得化合物1 （67 mg）、2 （52 mg）、4 （18 mg）； Fr.B6 （4 g） 經(jīng)ODS 柱分離，以30% ～70% 甲醇梯度洗脫，合并相似組分，得Fr.B6-1～Fr.B6-7，F(xiàn)r.B6-3 （0.8 g） 經(jīng)制備HPLC純化，以甲醇-0.1%甲酸（62 ∶38） 洗脫，得化合物3 （30 mg）。Fr.H （5 g） 經(jīng)ODS 柱分離，以30% ～70% 甲醇梯度洗脫，合并相似組分，得Fr.H1～Fr.H6，F(xiàn)r.H6 經(jīng)重結晶，得化合物6 （14 mg）； Fr.H5 （1.5 g） 經(jīng)制備HPLC 純化，以乙腈-0.1%甲酸（32 ∶68） 洗脫，得化合物5 （30 mg）。

2.2 糖種類及其絕對構型確定

2.2.1 糖種類 取各化合物3 mg，溶于2 mL 2 mol/L HCl 溶液中，密封，90 ℃加熱3 h，反應液冷卻后加3 mL 水，乙酸乙酯萃取3 次，每次5 mL，萃取后水層減壓濃縮，甲醇溶解，濾過，得單糖部分，與標準糖對照品進行HPLC 分析。色譜條件為Ultimate HILI Amide 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.2% 甲酸（80 ∶20）； 柱溫35 ℃； ELSD 檢測器溫度80 ℃； 氮氣體積流量2.5 mL/min （葡萄糖12.53 min，半乳糖13.25 min，葡萄糖醛酸10.34 min）。

2.2.2 糖絕對構型 單糖部分與標準糖對照品分別溶于1 mL 0.2%L-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽吡啶溶液中，60 ℃加熱1 h，加入1.8 μL 鄰甲苯異硫氰酸酯，60 ℃加熱1 h，對反應混合物進行HPLC 分析。參考文獻［4］ 報道，色譜條件為Discovery C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-水（24 ∶76）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長250 nm； 進樣量10 μL （保留時間分別為D-葡萄糖醛酸42.55 min，D-半乳糖11.05 min，D-葡萄糖12.47 min）。見圖2。

圖2 化合物1～4 糖衍生化后的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of compound 1-4 after sugar derivatization

3 結構鑒定

化合物1： 白色無定形粉末，易溶于吡啶、DMSO、甲醇等有機溶劑，熔點261 ～263 ℃。Liebermann-Burchard 反應、Molish 反應均呈陽性，提示為皂苷類化合物，酸水解、衍生化HPLC 檢出D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸。HR-TOF-MS 顯示準分子離子峰m/z： 851.445 4 ［M-H］-（理論值851.442 8），推測分子式C44H68O16，相對分子量852。UV 光譜顯示最大吸收峰為194 nm，IR 光譜顯示含有羥基 （3 418 cm-1）、C ＝O 鍵 （1 723 cm-1）、C ＝C 鍵（1 635 cm-1）。1H-NMR （C5D5N，400 MHz） 顯示6 個甲基質(zhì)子信號δ： 1.40 （3H，s），0.82 （3H，s），0.98 （3H，s），1.94 （3H，s），1.08 （3H，s），1.19 （3H，s），1 個環(huán)內(nèi)烯氫信號δ： 5.62 （1H，brs，H-12），1 個醛基氫信號δ： 9.93 （1H，s，H-23）；13C-NMR （C5D5N，100 MHZ） 譜可見2 個烯碳信號δ： 122.5 （C-12），145.7 （C-13），1 個醛基碳信號δ： 209.8 （C-23），1 個羧基碳信號δ： 180.4 （C-28），6 個甲基信號δ： 11.3，16.2，17.9，27.7，33.8，25.3。以上特征信號提示，化合物1 苷元為皂樹皮酸［5-6］。

除了苷元信號外，1H-NMR 譜可見2 個糖端基質(zhì)子信號δ： 4.93 （1H，d，J＝7.5 Hz），5.26（1H，d，J＝7.5 Hz），13C-NMR 譜也顯示相應端基碳信號δ： 103.8，106.8，而糖端基氫信號δ：4.93 （1H，d，J＝7.5 Hz） 結合其碳信號δ：103.8、羧基碳信號δ： 170.3，進一步證實葡萄糖醛酸基的存在。

通過HSQC 結合1H-1H COSY、HMBC、TOCSY譜（圖3） 將化合物1 的碳氫相關信號進行歸屬，得到2 個糖基的自旋偶合體系、碳氫信號。糖的連接位置、順序通過HMBC 譜加以確定，δ： 84.0（C-3） 與δ： 4.93 （GlcA-H-1） 相關，證明糖基GlcA 連接在苷元的C-3 位上；δ： 5.26 （Gal-H-1）與δ： 82.8 （GlcA-C-2） 存在相關峰，證明化合物1 的C-3 位糖鏈為Gal- （1→2） -GlcA，再結合糖端基偶合常數(shù)，確定兩者構型均為β 型。1H-NMR中δ： 4.26 （2H，m），1.17 （3H，t，J＝7.0 Hz）提示結構中存在乙氧基，再結合HMBC 譜中δ：4.26 （乙基中的-CH2） 與δ： 170.3 （GlcA-C-6）存在相關峰，證明化合物1 結構中存在6-O-乙基-葡萄糖醛酸基。基于以上數(shù)據(jù)，確定化合物1 結構為皂樹皮酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖- （1→2） -6-O-乙基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，經(jīng)Scifinder 系統(tǒng)檢索確定為新化合物，結構見圖1，1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)見表1～2。

表1 化合物1～3 苷元的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR data on compounds 1-3 aglycones

圖3 化合物1～3 的關鍵1H-1HCOSY （-） 和HMBC （H→C） 相關Fig.3 Key 1H-1HCOSY （-） and HMBC （H→C） correlations of compounds 1-3

化合物2： 白色無定形粉末，易溶于甲醇、吡啶等有機溶劑，熔點258 ～259 ℃。Liebermann-Burchard、Molish 反應均呈陽性，提示為皂苷類化合物，酸水解、衍生化HPLC 檢出D-葡萄糖。HRTOF-MS 顯示準分子離子峰m/z： 809.435 9 ［MH］-（理論值809.432 3），推測分子式C42H66O15，相對分子量810。UV 光譜顯示最大吸收峰為190 nm，IR 光譜顯示含有羥基（3 405 cm-1）、C ＝O 鍵（1 715 cm-1）、C ＝C 鍵 （1 635 cm-1）。1H-NMR（C5D5N，400 MHz） 顯示6 個甲基質(zhì)子信號δ：1.32 （3H，s），0.84 （3H，s），0.99 （3H，s），1.85 （3H，s），1.08 （3H，s），1.19 （3H，s），1 個環(huán)內(nèi)烯氫質(zhì)子信號δ： 5.65 （1H，brs），1 個醛基氫質(zhì)子信號δ： 9.73 （1H，s，H-23）。13CNMR （C5D5N，100 MHz） 譜可見2 個烯碳信號δ：122.5 （C-12），145.7 （C-13），1 個醛基碳信號δ： 207.2 （C-23），1 個羧基碳信號δ： 180.4 （C-28），6 個甲基信號δ： 10.8，16.2，17.9，27.7，33.8，25.3。以上特征信號提示，化合物1 苷元為皂樹皮酸。

除了苷元信號外，1H-NMR 顯示兩端基質(zhì)子信號δ： 4.82 （1H，d，J＝7.7 Hz），5.28 （1H，d，J＝7.7 Hz），13C-NMR 譜也顯示相應端基碳信號δ：104.7，106.4。通過 HSQC 結合1H-1H COSY、HMBC、TOCSY 譜（圖3） 將化合物2 的碳氫相關信號進行歸屬，得到2 個糖基的自旋偶合體系和碳氫信號。糖的連接位置和順序通過HMBC 譜加以確定，δ： 4.82 （Glc1-H-1） 與δ： 82.1 （C-3） 存在相關峰，證明糖基Glc1連接在苷元的C-3 位上；δ： 5.28 （Glc2-H-1） 與δ： 89.2 （Glc1-C-3） 存在相關峰，證明C-3 糖鏈為Glc2- （1→3） -Glc1，再結合糖端基偶合常數(shù)確定兩者構型均為β 型?；谝陨蠑?shù)據(jù)，最終鑒定化合物2 結構為皂樹皮酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖- （1 →3） -β-D-吡喃葡萄糖苷。經(jīng)Scifinder 系統(tǒng)檢索，化合物2 為新化合物，結構見圖1，1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1～2。

化合物3： 白色無定形粉末，易溶于甲醇、吡啶等有機溶劑，熔點258 ～260 ℃。Liebermann-Burchard、Molish 反應均呈陽性，提示為皂苷類化合物，酸水解、衍生化HPLC 檢出D-葡萄糖、D-半乳糖。FT-ESI-MS 顯示準分子離子峰m/z：995.484 8 ［M＋Na］＋（理論值995.482 7），推測分子式C48H76O20，相對分子量972。UV 光譜顯示最大吸收峰為192 nm。IR 光譜顯示含有羥基（3 390 cm-1）、C ＝O 鍵（1 716 cm-1）、C ＝C 鍵（1 634 cm-1）。1H-NMR （C5D5N，400 MHZ） 顯示6 個甲基質(zhì)子信號δ： 1.44 （3H，s），0.80 （3H，s），0.96 （3H，s），1.79 （3H，s），1.06 （3H，s），1.17 （3H，s），1 個環(huán)內(nèi)烯氫質(zhì)子信號δ： 5.61（1H，brs，H-12），1 個醛基質(zhì)子信號δ： 9.91（1H，s，23-CHO）。13C-NMR （C5D5N，100 MHz）譜可見2 個烯碳信號δ： 122.5 （C-12），145.7（C-13），1 個醛基碳信號δ： 210.5 （C-23），1 個羧基碳信號δ： 180.4 （C-28），6 個甲基信號δ：11.4，16.2，17.9，27.6，33.8，25.5。以上特征信號提示，化合物3 苷元為皂樹皮酸。

除了苷元信號外，1H-NMR 譜中可見3 個糖端基質(zhì)子信號δ： 4.73 （1H，d，J＝7.5 Hz），5.28（1H，d，J＝7.7 Hz），5.54 （1H，d，J＝7.8 Hz），13C-NMR 譜也顯示相應端基碳信號δ： 103.8，105.2，104.8。通過 HSQC 結合1H-1H COSY、HMBC、TOCSY 譜（圖3） 將化合物3 的碳氫相關信號進行歸屬，得到3 個糖基的碳氫信號。糖的連接位置、順序通過HMBC 譜加以確定，δ： 84.4（C-3） 與δ： 4.73 （Glc1-H-1） 存在相關峰，證明糖基Glc1連接在苷元的C-3 位上；δ： 5.28 （Glc2-H-1） 與δ： 89.3 （Glc1-3），δ： 5.54 （Gal-H-1）與δ： 79.1 （Glc1-2） 相關，證明C-3 糖鏈為Gal-（1→2） - ［Glc2- （1→3）］ -Glc1，再結合糖端基偶合常數(shù)確定3 個糖構型均為β 型?；谝陨蠑?shù)據(jù)，確定化合物3 結構為皂樹皮酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖- （1→2） - ［β-D-吡喃葡萄糖- （1→3）］ -β-D-吡喃葡萄糖苷。經(jīng)Scifinder 系統(tǒng)檢索，化合物3 為新化合物，結構見圖1，1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)見表1～2。

化合物4： 白色粉末，易溶于甲醇、吡啶等有機溶劑，熔點249 ～251 ℃。Liebermann-Burchard、Molish 反應均呈陽性，提示為皂苷類化合物，酸水解及衍生化HPLC 檢出D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸。ESI-MSm/z： 836.9 ［M-H］-，861.0 ［M＋Na］＋，分子式C43H66O16。1H-NMR （C5D5N，400 MHz）δ：1.37 （ 3H，s，24-CH3），0.82 （ 3H，s，25-CH3），0.98 （3H，s，26-CH3），1.94 （3H，s，27-CH3），1.08 （3H，s，29-CH3），1.19 （3H，s，30-CH3），5.62 （1H，brs，H-12），9.93 （1H，s，H-23），3.72 （3H，s，-OCH3），4.90 （1H，d，J＝7.2 Hz，GlcA-H-1），5.22 （1H，d，J＝7.6 Hz，Gal-H-1）；13C-NMR （C5D5N，100 MHz）δ：38.5 （C-1），25.2 （C-2），83.9 （C-3），55.5（C-4），48.8 （C-5），20.8 （C-6），33.2 （C-7），40.6 （C-8），47.7 （C-9），36.8 （C-10），24.2（C-11），122.5 （C-12），145.7 （C-13），42.6（C-14），36.7 （C-15），75.0 （C-16），49.3 （C-17），41.9 （C-18），47.5 （C-19），31.5 （C-20），36.5 （ C-21），33.4 （ C-22），209.8 （ C-23），11.3 （C-24），16.2 （C-25），17.8 （C-26），27.7（C-27），180.4 （C-28），33.8 （C-29），25.3 （C-30），GlcA： 103.8 （C-1），82.8 （C-2），77.9（C-3），73.0 （C-4），77.2 （C-5），170.8 （C-6），52.6 （-OCH3），Gal： 106.8 （C-1），75.1 （C-2），75.5 （C-3），70.6 （C-4），77.7 （C-5），62.6（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］ 報道基本一致，故鑒定為皂樹皮酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖- （1→2） -6-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷。

化合物5： 白色粉末，易溶于吡啶、DMSO、水，可溶于甲醇。Liebermann-Burchard、Molish 反應均呈陽性，提示為皂苷類化合物。FT-ESI-MSm/z： 1 351.620 0 ［M＋H］＋（計算值1 351.616 8），分子式C63H98O31。1H-NMR （DMSO-d6，400 MHz）δ： 1.06 （3H，s，24-CH3），0.88 （3H，s，25-CH3），0.65 （3H，s，26-CH3），1.11 （3H，s，27-CH3），0.88 （3H，s，29-CH3），0.88 （3H，s，30-CH3），1.14 （3H，d，J＝6.0 Hz，Rha-H-6），5.21 （1H，brs，H-12），9.46 （1H，s，23-CHO），4.27 （1H，d，J＝8.0 Hz，GlcA-H-1），4.27 （1H，d，J＝8.0 Hz，Gal-H-1），5.59 （1H，s，Ara-H-1），4.79 （ 1H，s，Rha-H-1），4.48（1H，d，J＝8.0 Hz，Xyl-H-1），4.43 （1H，d，J＝8.0 Hz，Xyl-H-1）；13C-NMR （DMSO-d6，100 MHZ）δ： 37.4 （C-1），24.1 （C-2），82.2 （C-3），53.9 （C-4），47.1 （C-5），19.7 （C-6），31.7 （C-7），41.2 （C-8），46.7 （C-9），35.5（C-10），23.4 （C-11），121.7 （C-12），143.4（C-13），41.2 （C-14），27.2 （C-15），22.9 （C-16），46.1 （C-17），40.7 （C-18），45.3 （C-19），30.4 （ C-20），33.1 （ C-21），31.7 （ C-22），209.2 （ C-23），10.2 （ C-24），15.3 （ C-25），16.6 （ C-26），25.5 （ C-27），175.1 （ C-28），32.7 （C-29），23.4 （C-30），GlcA： 101.6 （C-1），81.1 （C-2），75.8 （C-3），71.2 （C-4），75.1 （C-5），170.6 （C-6），Gal： 104.5 （C-1），72.3 （C-2），72.9 （C-3），67.7 （C-4），74.9（C-5），59.8 （C-6），Ara： 91.5 （C-1），73.7（C-2），70.0 （C-3），67.7 （C-4），64.2 （C-5），Rha： 99.3 （C-1），70.5 （C-2），69.4 （C-3），81.8 （C-4），67.7 （C-5），17.5 （C-6），Xyl1：104.4 （C-1），73.7 （C-2），85.2 （C-3），67.1（C-4），65.5 （C-5），Xyl2： 104.2 （C-1），73.7（C-2），76.1 （C-3），69.4 （C-4），65.7 （C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］ 報道基本一致，故鑒定為3-O-β-D-吡喃半乳糖基（1→2） -β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-絲石竹酸-28-O-β-D-吡喃木糖基（1→3） -β-D-吡喃木糖基（1→4） -α-L-吡喃鼠李糖基（1→2） -α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物6： 黃色針狀結晶，熔點202 ～204 ℃。鹽酸-鎂粉反應呈陽性。ESI-MSm/z： 285.085 5［M＋H］＋（計算值285.076 3），分子式C16H12O5。1HNMR （C5D5N，400 MHz）δ： 7.00 （1H，s，H-6），8.08 （1H，d，J＝6.0 Hz，H-2′），7.62（1H，d，J＝6.4 Hz，H-3′），7.63 （1H，s，H-4′），7.62 （1H，d，J＝6.4 Hz，H-5′），8.08（1H，d，J＝6.0 Hz，H-6′），12.51 （1H，s，5-OH），10.82 （1H，s，7-OH），3.87 （3H，s，8-CH3）；13C-NMR （C5D5N，100 MHz）δ： 163.0 （C-1），105.0 （C-2），182.0 （C-3），156.2 （C-4），99.1 （C-5），157.3 （C-6），127.7 （C-7），149.6（C-8），103.7 （C-9），130.8 （C-10），126.2 （C-1′），129.2 （C-2′），132.0 （C-3′），129.2 （C-4′），126.2 （C-5′），61.0 （8-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］ 基本一致，故鑒定為漢黃芩素。

4 討論

本研究主要報道了從赤雹根中首次分離得到的5 個齊墩果烷型三萜皂苷，其中3 個為新化合物。4 個三萜皂苷的苷元為皂樹皮酸，皂樹皮酸是C-28位為羧基，C-23 位為醛基，C-12 位為雙鍵的齊墩果烷型三萜，其C-3、C-28 位常連有糖鏈，常見單糖有葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、夫糖、雞納糖等。現(xiàn)已報道的同類型皂苷主要分布在葫蘆科的木鱉、苦瓜、赤雹，石竹科的九子參、圓錐石頭花、Acanthophyllum gypsophiloidesRegel、肥皂草，桔?？频腁denophora triphyllavar.japonica，罌粟科的荷青花，豆科的QuillajasaponariaMolina［10-11］中。此類皂苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、腎保護、免疫佐劑等藥理作用，如木鱉子皂樹皮酸皂苷通過NF-κB 途徑抑制脂多糖誘導的一氧化氮、IL-6 表達，對RAW 264.7 細胞顯示出抗炎活性； 皂樹皮酸類皂苷對人慢性髓原白血病細胞K562，人肝癌細胞Huh 7［12-13］，人胃癌細胞SNU-1、KATO Ⅲ、AGS，人肺癌細胞A549、H1264、H1299、Calu-6，人乳腺癌細胞MDA-MB-231，人前列腺癌細胞PC-3［14-16］等顯示出不同程度的細胞毒性。在皂苷類免疫佐劑研究方面，Idris［17］通過對含有皂樹皮酸的皂苷佐劑及其作用機制研究，發(fā)現(xiàn)皂樹皮酸可能是免疫佐劑活性的戰(zhàn)略分子，并且是開發(fā)新型佐劑的有力候選者。