基于PI3K/Akt 信號通路探討溫下方乙酸乙酯部位對A549 細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤生長的抑制作用

王 盟，李 慧，呂傳峰，鄭 斌

（濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272000）

最新的 《全球癌癥年報(bào)》 顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率均排在全球疾病的第一位，其中非小細(xì)胞肺癌為肺癌的主要類型，約占肺癌病例的85%［1-2］。目前針對腫瘤的治療主要有化療、放療等手段，均存在不同程度的副作用。中醫(yī)藥能夠改善患者的臨床癥狀，起到一定的抑制腫瘤作用，具有整體調(diào)節(jié)、多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)［3-4］。

溫下方以溫下祖方大黃附子湯加減而得，由人參、大黃、附子、當(dāng)歸組成［5］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，溫下方乙酸乙酯部位為溫下方抗腫瘤的有效部位，其對4 種肺癌細(xì)胞的體外抑制作用強(qiáng)于其他3 種提取部位（石油醚、二氯甲烷、正丁醇） 和水煎液，其中對A549 細(xì)胞的IC50為（198.70±1.25）μg/mL。溫下方乙酸乙酯部位在一定程度上可以抑制A549 細(xì)胞移植瘤裸鼠肺腫瘤的生長，但具體的作用機(jī)制尚未明確［6］。因此，本研究觀察了溫下方乙酸乙酯部位對磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt） 信號通路的干預(yù)特點(diǎn)，深入探討其抑制肺腫瘤可能的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 BALB/c 裸鼠，雌性，5 周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京） 2016-0011］。本研究通過山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理會批準(zhǔn)（倫理號SDUTCM2018111601）。

1.2 細(xì)胞 人肺腺癌A549 細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.3 藥物 人參、大黃、附子、當(dāng)歸均購自山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)王海軍教授鑒定為正品。注射用順鉑（凍干型） （齊魯制藥有限公司，批號52112CE）。

1.4 試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國HyClone 公司，貨號SH30022.01B）； 胎牛血清 （德國Sera Pro 公司，貨號S601S-500）； 胰酶（美國Amresco公司，貨號0457）； Matrigel （美國康寧公司，貨號356234）； PBS 緩沖液、RIPA 裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G4202、G2002）。

1.5 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本Panasonic 公司，型號MCO-18AC）； 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號SW-CJ-1FD）； 熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號CFX）； 電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號BV-2）； 化學(xué)發(fā)光儀 （上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號6300）； 凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech 公司，型號AlphaEaseFC）。

2 方法

2.1 溫下方乙酸乙酯部位制備 取干燥人參、大黃、附子、當(dāng)歸共9 750 g （9 ∶12 ∶12 ∶6），粉碎后用6 倍量75%乙醇超聲提取2 次，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，得到醇提物，然后依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并萃取液，濃縮，得到石油醚部分浸膏、氯仿部分浸膏、乙酸乙酯部分浸膏、正丁醇部分浸膏，4 ℃冷藏。

2.2 造模、分組及給藥 人肺腺癌A549 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中，收集對數(shù)生長期者，調(diào)整密度至8×107/mL，接種于裸鼠右側(cè)腋下（前肢），定期觀察腫瘤生長情況。接種約1 周待腫瘤生長至平均體積100 mm3時(shí)，根據(jù)其大小和裸鼠體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、順鉑組和溫下方高、中、低劑量組，每組5 只，溫下方高、中、低劑量組分別灌胃給予400、200、100 mg/kg 溫下方乙酸乙酯部位，每天1 次； 順鉑組腹腔注射2.0 mg/kg 順鉑注射液，每周2 次； 模型組灌胃給予生理鹽水，每天1 次，連續(xù)5 周。

2.3 裸鼠狀態(tài)觀察及腫瘤生長情況測定 接種腫瘤細(xì)胞后，常規(guī)監(jiān)測裸鼠腫瘤生長、體質(zhì)量、眼睛、被毛及其他異常情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用安樂死方式（戊巴比妥鈉，每只0.2 mL） 處死裸鼠，完整剝?nèi)∧[瘤組織，稱定質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。

2.4 HE 染色觀察腫瘤組織病理學(xué)變化 取部分裸鼠腫瘤組織，4% 多聚甲醛固定，嚴(yán)格按照HE染色步驟進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，在光鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)。

2.5 TUNEL 染色觀察腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況 裸鼠腫瘤組織石蠟切片，脫蠟至水，蛋白酶K 修復(fù)，0.1%Triton 破膜液進(jìn)行破膜，稍甩干后加buffer 常溫孵育10 min，取適量TDT 酶、dUTP、buffer，按1 ∶5 ∶50 比例混合，加到組織切片上，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，封片，在熒光顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞凋亡情況（DAPI 染色細(xì)胞核為藍(lán)色，F(xiàn)ITC 熒光素標(biāo)記陽性凋亡細(xì)胞核為綠色）。

2.6 Western blot 法檢測腫瘤組織Akt、PI3K、MMP-3、caspase-3、Bcl-2 蛋白表達(dá) 取腫瘤組織，預(yù)冷PBS 洗滌去除血污，置于冰上裂解，提取組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，隨后進(jìn)行變性。蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉30 min，加入一抗4 ℃孵育搖床過夜，二抗室溫孵育30 min，化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 溫下方乙酸乙酯部位對裸鼠腫瘤生長的影響 與模型組比較，順鉑組、溫下方高劑量組裸鼠腫瘤質(zhì)量降低（P＜0.05），并且順鉑組、溫下方高劑量組抑瘤率均在50% 以上，見圖1、表1。

表1 各組裸鼠體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量、抑瘤率比較（±s，n＝5）Tab.1 Comparison of body weight，tumor weight and tumor inhibition rate of nude mice in each group（±s，n＝5）

表1 各組裸鼠體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量、抑瘤率比較（±s，n＝5）Tab.1 Comparison of body weight，tumor weight and tumor inhibition rate of nude mice in each group（±s，n＝5）

注： 與模型組比較，*P＜0.05。

組別體質(zhì)量/g腫瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型組23.53±1.101.04±0.37—溫下方低劑量組23.13±1.230.71±0.3331.73溫下方中劑量組23.36±0.960.63±0.1939.42溫下方高劑量組22.05±0.780.52±0.12*50.00順鉑組18.35±1.140.46±0.14*55.76

圖1 各組裸鼠腫瘤形態(tài)Fig.1 Morphology of tumor in nude mice of each group

3.2 溫下方乙酸乙酯部位對裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)的影響 由圖2 可知，模型組腫瘤細(xì)胞體積較大，異型、核質(zhì)比高，壞死較少，胞核固縮，嗜酸性增強(qiáng)； 與模型組比較，順鉑組、溫下方各劑量組均出現(xiàn)不同程度的腫瘤細(xì)胞壞死，其中順鉑組腫瘤組織2/3 面積壞死最明顯。

圖2 各組裸鼠腫瘤組織HE 染色（×400）Fig.2 HE staining of tumor tissue for nude mice of each group （×400）

3.3 溫下方乙酸乙酯部位對裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響 與模型組比較，順鉑組和溫下方中、高劑量組腫瘤組織凋亡陽性細(xì)胞面積比例升高（P＜0.05）； 與順鉑組比較，溫下方低、中劑量組腫瘤組織凋亡陽性細(xì)胞面積比例降低（P＜0.05），見圖3、表2。

表2 各組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞面積比例比較（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of area ratio of apoptosis-positive cells in tumor tissue of nude mice in each group （±s，n＝5）

表2 各組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞面積比例比較（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of area ratio of apoptosis-positive cells in tumor tissue of nude mice in each group （±s，n＝5）

注： 與模型組比較，*P＜0.05； 與順鉑組比較，△P＜0.05。

組別陽性細(xì)胞面積比例/%模型組1.38±0.16溫下方低劑量組1.95±0.17△溫下方中劑量組2.71±0.26*△溫下方高劑量組3.72±0.12*順鉑組4.14±0.05*

圖3 各組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞TUNEL 凋亡染色（×400）Fig.3 TUNEL apoptosis staining of tumor tissue cells for nude mice of each group （×400）

3.4 溫下方乙酸乙酯部位對裸鼠腫瘤組織Akt、PI3K、MMP-3、caspase-3、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，溫下方各劑量組Akt、PI3K蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 順鉑組、溫下方各劑量組MMP-3、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低 （P＜0.05），caspase-3 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖4、表3。

表3 各組裸鼠腫瘤組織Akt、PI3K、MMP-3、caspase-3、Bcl-2 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of Akt，PI3K，MMP-3，caspase-3 and Bcl-2 protein expressions in tumor tissue of nude mice in each group （±s，n＝5）

表3 各組裸鼠腫瘤組織Akt、PI3K、MMP-3、caspase-3、Bcl-2 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of Akt，PI3K，MMP-3，caspase-3 and Bcl-2 protein expressions in tumor tissue of nude mice in each group （±s，n＝5）

注： 與模型組比較，*P＜0.05； 與順鉑組比較，△P＜0.05。

組別Aktp-AktPI3Kp-PI3KMMP-3caspase-3Bcl-2模型組0.85±0.050.86±0.070.61±0.040.68±0.070.93±0.060.37±0.040.53±0.06溫下方低劑量組0.99±0.030.54±0.06*0.65±0.030.38±0.08*0.73±0.05*0.52±0.03*△ 0.46±0.06△溫下方中劑量組0.98±0.030.25±0.03*△ 0.60±0.030.29±0.09*△0.57±0.04*△0.64±0.04*△ 0.31±0.04*△溫下方高劑量組1.00±0.080.39±0.04*△ 0.69±0.060.17±0.06*△0.38±0.03*△0.86±0.08*△ 0.25±0.05*順鉑組0.91±0.050.78±0.050.57±0.020.51±0.050.78±0.05*1.14±0.12*0.21±0.02*

圖4 各組裸鼠腫瘤組織Akt、PI3K、MMP-3、caspase-3、Bcl-2 蛋白條帶Fig.4 Protein bands of Akt，PI3K，MMP-3，caspase-3 and Bcl-2 in tumor tissue of nude mice in each group

4 討論

肺癌是肺系最常見惡性腫瘤，屬于中醫(yī)“肺積” “息賁” “咯血” 等范疇。從中醫(yī)證型特點(diǎn)來看，肺癌多具有瘀滯、痰凝、正虛、毒邪的病理特點(diǎn)，其中正虛又以氣虛、陰虛為主，病者多陰不足而陽有余［7］。在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，課題組從虛入手，輔以祛邪提出了溫下法以用于肺癌的緩解與治療［8］。溫下法來源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》 中溫法和下法的理論結(jié)合，是根據(jù)寒盛凝滯的病機(jī)擬定的一種治法。張仲景創(chuàng)建的大黃附子湯是溫下方劑的祖方，也是溫下法經(jīng)典的代表方［9］。本研究所用溫下方為大黃附子湯加減而得，由人參、大黃、附子、當(dāng)歸組成。方中溫下消補(bǔ)四法合用，共奏溫里、攻下、逐瘀和益氣之功，既溫補(bǔ)以助陽散寒，改善機(jī)體陽虛狀態(tài)，又攻下逐瘀，給邪以出路，促使體內(nèi)的寒凝、血瘀、毒聚等病理產(chǎn)物排出［10］。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，溫下方加減治療可有效改善非小細(xì)胞肺癌化療后患者臨床癥狀，提高患者生活質(zhì)量［11］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，方中人參、大黃、當(dāng)歸、附子4 味中藥均具有抗腫瘤的功效［12-15］。本實(shí)驗(yàn)建立了人肺腺癌A549 細(xì)胞移植瘤裸鼠模型，評價(jià)了溫下方乙酸乙酯部位對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示，溫下方乙酸乙酯部位在一定程度上可以抑制腫瘤的生長，高劑量下抑瘤率可達(dá)到50%，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞不同程度的壞死； 還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

PI3K/Akt 信號通路在多種惡性腫瘤中存在異常激活的現(xiàn)象，與細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且該通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中也存在異常激活的情況［16-17］。caspase-3 是細(xì)胞凋亡中最重要的終末剪切酶，活化的caspase-3 能夠激活激酶級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而加快細(xì)胞的凋亡［18-19］。Bcl-2 為Bcl-2 家族中的一員，可以抑制由多種因素引起的細(xì)胞凋亡，被稱為抑凋亡蛋白［20-21］。MMP3 是MMPs 中重要的組成部分，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［22-23］。本研究顯示，溫下方乙酸乙酯部位可抑制人肺腺癌A549 細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤組織PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-3 的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白caspase-3 的表達(dá)，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)。以上結(jié)果顯示，溫下方乙酸乙酯部位可以調(diào)控PI3K/Akt信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞的侵襲。

綜上所述，溫下方乙酸乙酯部位在一定程度上可以抑制人肺腺癌A549 細(xì)胞移植瘤裸鼠腫瘤的生長，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt 信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞侵襲有關(guān)。