漢黃芩素通過調(diào)控JNK/AP-1 信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能障礙、腦組織損傷的影響

葉 維，張 紅，王 莉，徐建奇

（長江航運(yùn)總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430010）

缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）占所有腦卒中病例的80% ～85%，其會引發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等，造成腦損傷［1］。目前僅存在2 種已獲批準(zhǔn)的治療選擇，即組織纖溶酶原激活劑和血管內(nèi)血栓切除術(shù)，但較窄的治療窗和額外損傷的高風(fēng)險(xiǎn)限制了其適用性［2］。因此，探究CIS后腦損傷的新治療措施具有重要意義。漢黃芩素是從黃芩根中分離出來的天然成分。已有研究報(bào)道，其可抑制永久性大腦中動脈閉塞模型大鼠的缺血性腦損傷［3-4］。但關(guān)于漢黃芩素減輕CIS 大鼠腦損傷的具體機(jī)制尚不完全清楚。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） /激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1） 可介導(dǎo)腦損傷的發(fā)生，抑制該信號通路可改善腦出血后的神經(jīng)炎癥［5］。而漢黃芩素能否通過調(diào)控JNK/AP-1 通路影響CIS大鼠神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷尚不明確。因此，本研究主要探究漢黃芩素對CIS 大鼠神經(jīng)功能障礙、腦組織損傷的影響，以及漢黃芩素的作用機(jī)制，旨在為CIS 的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 120 只雄性SD 大鼠，體質(zhì)量220 ～240 g，購自廣東南模生物科技有限公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK （粵） 2022-0062］。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑 漢黃芩素 ［貨號 YLK-B0292D，20 mg，純度≥98%，優(yōu)利科（上海） 生命科學(xué)有限公司］。丁苯酞（貨號CS-B4908，上海莼試生物技術(shù)有限公司）； JNK 激活劑Anisomycin （貨號T6758，南京賽泓瑞生物科技有限公司）； 大鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 試劑盒 （貨號FKkl1921、YM-SZ1922，上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）； TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 ［貨號KTA2010-1，亞科因（武漢） 生物技術(shù)有限公司］；JNK1、c-Jun、c-Fos、p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos、β-actin、辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的羊抗兔二抗 （ 貨號 ab110724、ab40766、ab208942、ab47337、ab32137、ab278642、ab6276、ab6721，英國Abcam 公司）。

2 方法

2.1 模型構(gòu)建 大鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，在頸正中部作一切口，分離頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈近心端，在頸總動脈近心端剪一小口，遠(yuǎn)心端掛線，然后緩慢向頸內(nèi)動脈插入線栓直至有阻力不能插入為止，回抽少許線栓，結(jié)扎頸內(nèi)動脈，縫合傷口。術(shù)后神經(jīng)功能評分高于1 分且低于4 分則為造模成功［6］。

2.2 分組及給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組、模型組、漢黃芩素低劑量組、漢黃芩素高劑量組、丁苯酞組、漢黃芩素高劑量＋JNK 激活劑（Anisomycin） 組，每組20 只。對照組大鼠僅切開皮膚、分離血管，不進(jìn)行拴線處理； 其余各組大鼠均按“2.1” 項(xiàng)下方法構(gòu)建模型。建模成功后，漢黃芩素低劑量組、漢黃芩素高劑量組［7］、丁苯酞組［8］大鼠分別灌胃 0.07 mg/kg 漢黃芩素、0.14 mg/kg漢黃芩素、20 mg/kg 丁苯酞，并腹腔注射等體積生理鹽水； 漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組［9］大鼠灌胃0.14 mg/kg 漢黃芩素，并腹腔注射5 mg/kg Anisomycin，每天1 次，持續(xù)14 d。

2.3 標(biāo)本收集 造模結(jié)束后及末次給藥12 h 后，所有大鼠均進(jìn)行神經(jīng)功能評分。評分后取大鼠腦組織，其中5 個用于腦梗死體積測定，5 個用于腦組織含水量測定，5 個固定于4%多聚甲醛中用于HE染色、TUNEL 染色，5 個保存在液氮中用于Western blot 實(shí)驗(yàn)和SOD 活性、MDA 水平檢測。

2.4 Zea-Longa 法評價神經(jīng)功能 根據(jù)Zea-Longa評分系統(tǒng)［10］對每組20 只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，其中0 分為無神經(jīng)功能障礙癥狀，1 分為無法伸展對側(cè)前爪，2 分為行走時轉(zhuǎn)向偏癱側(cè)，3 分為傾倒到偏癱一側(cè)，4 分為不能自發(fā)行走、無意識。

2.5 TTC 染色測定腦梗死體積 取各組大鼠腦組織，PBS 洗滌后切成2 mm 切片，于1% TTC 溶液中37 ℃染色30 min，然后在10%甲醛中固定24 h，拍照并測定腦梗死體積，未染色區(qū)域被定義為梗死區(qū)域。腦梗死體積百分比＝ （梗死體積/大腦總體積） ×100%。

2.6 腦組織含水量測定 稱量大鼠腦組織總濕重，記為W1，置于65 ℃烘箱中烘干24 h，稱量其干重，記為W2。腦組織含水量＝ ［（W1-W2）/W1］ ×100%。

2.7 HE 染色觀察腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理變化 將大鼠海馬CA1 區(qū)腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，清水洗滌4 h，分級乙醇脫水，按照標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)程序包埋在石蠟中，切片4 μm，進(jìn)行HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下拍攝海馬CA1 區(qū)腦組織病理變化。

2.8 腦組織SOD 活性、MDA 水平檢測 按照試劑盒說明書檢測大鼠腦組織SOD 活性、MDA水平。

2.9 TUNEL 染色檢測大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡 取大鼠腦組織石蠟切片，嚴(yán)格按照TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，Image Pro Plus 6.0 軟件分析細(xì)胞凋亡率。

2.10 Western blot 法檢測腦組織JNK/AP-1 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 大鼠腦組織采用RIPA 裂解緩沖液裂解并提取總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos、JNK1、c-Jun、c-Fos、β-actin 一抗4 ℃孵育過夜，然后與HRP 偶聯(lián)的二抗孵育2 h，ECL 法發(fā)光、顯影，Image J 軟件測量蛋白條帶灰度值。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 漢黃芩素對大鼠神經(jīng)功能評分的影響 與對照組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評分升高 （P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組和丁苯酞組大鼠神經(jīng)功能評分降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠神經(jīng)功能評分升高（P＜0.05），見表1。

表1 漢黃芩素對大鼠神經(jīng)功能評分的影響（±s，n＝20）Tab.1 Effect of wogonin on neurological function score in rats （±s，n＝20）

表1 漢黃芩素對大鼠神經(jīng)功能評分的影響（±s，n＝20）Tab.1 Effect of wogonin on neurological function score in rats （±s，n＝20）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別神經(jīng)功能評分/分對照組0.00±0.00模型組2.78±0.21*漢黃芩素低劑量組2.15±0.14＃漢黃芩素高劑量組1.37±0.12＃丁苯酞組1.34±0.13＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組2.23±0.11△

3.2 漢黃芩素對大鼠腦梗死體積百分比的影響 模型組大鼠腦梗死體積百分比高于對照組（P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組和丁苯酞組大鼠腦梗死體積百分比降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦梗死體積百分比升高 （P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色Fig.1 TTC staining of rat brain tissue in each group

表2 漢黃芩素對大鼠腦梗死體積百分比的影響（±s，n＝5）Tab.2 Effect of wogonin on the percentage of cerebral infarction volume in rats （±s，n＝5）

表2 漢黃芩素對大鼠腦梗死體積百分比的影響（±s，n＝5）Tab.2 Effect of wogonin on the percentage of cerebral infarction volume in rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別腦梗死體積百分比/%對照組0.00±0.00模型組36.21±3.23*漢黃芩素低劑量組28.13±2.25＃漢黃芩素高劑量組15.62±1.34＃丁苯酞組14.98±1.20＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組26.65±2.21△

3.3 漢黃芩素對大鼠腦組織含水量的影響 與對照組比較，模型組大鼠腦組織含水量升高 （P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織含水量降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織含水量升高（P＜0.05），見表3。

表3 漢黃芩素對大鼠腦組織含水量的影響（±s，n＝5）Tab.3 Effect of wogonin on water content in brain tissue of rats （±s，n＝5）

表3 漢黃芩素對大鼠腦組織含水量的影響（±s，n＝5）Tab.3 Effect of wogonin on water content in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別腦組織含水量/%對照組75.53±4.17模型組95.23±4.11*漢黃芩素低劑量組88.48±4.32＃漢黃芩素高劑量組79.18±4.26＃丁苯酞組79.76±4.22＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組87.28±5.88△

3.4 漢黃芩素對大鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理變化的影響 對照組大鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列致密均勻，結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)完整正常，核仁清晰可見； 模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞核萎縮，部分細(xì)胞呈點(diǎn)狀壞死，神經(jīng)細(xì)胞紊亂； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理損傷減輕；與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理損傷嚴(yán)重，見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織海馬CA1 區(qū)HE 染色（×200）Fig.2 HE staining of rat hippocampal CA1 area in each group （×200）

3.5 漢黃芩素對大鼠腦組織SOD 活性和MDA 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠腦組織SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織SOD 活性升高（P＜0.05），MDA水平降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05），見表4。

表4 漢黃芩素對大鼠腦組織SOD 活性、MDA 水平的影響（±s，n＝5）Tab.4 Effects of wogonin on SOD activity and MDA level in brain tissue of rats （±s，n＝5）

表4 漢黃芩素對大鼠腦組織SOD 活性、MDA 水平的影響（±s，n＝5）Tab.4 Effects of wogonin on SOD activity and MDA level in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別SOD/（U·mg-1） MDA/（nmol·mg-1）對照組67.74±4.052.31±0.22模型組25.58±1.12*8.86±0.42*漢黃芩素低劑量組36.12±2.03＃7.13±0.37＃漢黃芩素高劑量組59.52±2.78＃3.57±0.28＃丁苯酞組59.58±2.84＃3.59±0.25＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組 42.34±3.15△5.83±0.27△

3.6 漢黃芩素對大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率高于對照組（P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖3、表5。

圖3 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞TUNEL 染色（×200）Fig.3 TUNEL staining of nerve cells in rat brain tissue of each group （×200）

表5 漢黃芩素對大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝5）Tab.5 Effect of wogonin on neuronal apoptosis in brain tissue of rats （±s，n＝5）

表5 漢黃芩素對大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝5）Tab.5 Effect of wogonin on neuronal apoptosis in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別細(xì)胞凋亡率/%對照組4.17±0.31模型組39.87±3.06*漢黃芩素低劑量組26.87±2.12＃漢黃芩素高劑量組11.34±1.24＃丁苯酞組11.22±1.08＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組28.84±2.31△

3.7 漢黃芩素對大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、pc-Fos 蛋白表達(dá)的影響 模型組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達(dá)高于對照組（P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖4、表6。

圖4 各組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白條帶Fig.4 Protein bands of p-JNK1，p-c-Jun and p-c-Fos in rat brain tissue of each group

表6 漢黃芩素對大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Tab.6 Effects of wogonin on the protein expressions of p-JNK1，p-c-Jun and p-c-Fos in brain tissue of rats （±s，n＝5）

表6 漢黃芩素對大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Tab.6 Effects of wogonin on the protein expressions of p-JNK1，p-c-Jun and p-c-Fos in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別p-JNK1/JNK1p-c-Jun/c-Junp-c-Fos/c-Fos對照組0.28±0.020.21±0.020.15±0.01模型組0.94±0.05*0.95±0.04*0.89±0.10*漢黃芩素低劑量組0.70±0.07＃0.71±0.06＃0.70±0.06＃漢黃芩素高劑量組0.39±0.03＃0.34±0.03＃0.31±0.03＃丁苯酞組0.38±0.03＃0.32±0.03＃0.30±0.02＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組0.74±0.06△0.71±0.06△0.67±0.06△

4 討論

CIS 被認(rèn)為是世界上發(fā)病率、死亡率和致殘率都很高的主要致命疾病之一［11］。腦卒中是全球人類死亡的主要原因，預(yù)計(jì)到2030 年將增加24.9%［12］。但目前關(guān)于CIS 的治療策略較少，因此，開發(fā)新的藥物來治療CIS 引起的腦損傷具有重要意義。改良的線栓法是常用于構(gòu)建CIS 模型的方法，本研究利用此方法構(gòu)建CIS 大鼠模型，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組神經(jīng)功能評分、腦梗死體積百分比、腦組織含水量、氧化應(yīng)激水平、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理損傷嚴(yán)重，表明CIS 模型大鼠存在神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷。

漢黃芩素是黃芩的主要化學(xué)成分，是含有苯并吡喃酮的黃酮衍生物，具有抗氧化、抗炎、保護(hù)神經(jīng)等作用［13］。據(jù)報(bào)道，漢黃芩素可減輕麻醉大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的有害影響［14］； 也可通過減少細(xì)胞凋亡對創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用［15］。而關(guān)于漢黃芩素對CIS 大鼠神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷的影響鮮有報(bào)道。本研究顯示，漢黃芩素可降低CIS 大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積百分比、腦組織含水量、氧化應(yīng)激水平、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，可使海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理損傷減輕，且漢黃芩素高劑量組與丁苯酞組效果相近，表明漢黃芩素可改善CIS 大鼠神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷。

JNK 和c-Jun 磷酸化是關(guān)鍵的細(xì)胞凋亡驅(qū)動因素，一旦被激活，他們就可以與c-Fos 和c-Jun 家族的成員共同形成AP-1 來調(diào)控細(xì)胞凋亡［16-17］。相關(guān)研究顯示，抑制JNK/AP-1 通路可減少新生兒缺氧缺血性腦損傷后的神經(jīng)元凋亡并改善運(yùn)動行為［18］； 還可降低缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)，進(jìn)而保護(hù)脊髓組織［19］。本研究顯示，與對照組比較，模型組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos蛋白表達(dá)升高； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組和丁苯酞組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos蛋白表達(dá)降低，推測漢黃芩素可能通過抑制JNK/AP-1 通路改善CIS 大鼠神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷。為了驗(yàn)證該猜想，本研究在高劑量漢黃芩素處理的基礎(chǔ)上加以JNK 激活劑Anisomycin 干預(yù)CIS大鼠，結(jié)果顯示Anisomycin 減弱了高劑量漢黃芩素對CIS 大鼠神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷的改善作用，證實(shí)了漢黃芩素可能通過抑制JNK/AP-1 通路改善CIS 大鼠神經(jīng)功能障礙，減輕腦組織損傷的作用。

綜上所述，漢黃芩素可能通過抑制JNK/AP-1通路改善CIS 大鼠神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷。然而，漢黃芩素對CIS 大鼠神經(jīng)功能障礙及腦組織損傷的改善作用可能還涉及其它通路，但本研究還未闡明，這將是本課題組后續(xù)研究的重點(diǎn)。