一測多評(píng)法同時(shí)測定小兒香橘丸中8 種成分

王麗瓊，魏長勇

（樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川省中藥質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 樂山 614000）

小兒香橘丸是由蒼術(shù)、厚樸、陳皮、枳實(shí)、甘草等19 味中藥制成的大蜜丸，用于治療脾虛食滯所致的嘔吐便瀉、脾胃不和、身熱腹脹、面黃肌瘦、不思飲食［1-2］，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2020 年版《中國藥典》 一部，但僅以橙皮苷為指標(biāo)成分，不能全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)其質(zhì)量［3］。中藥質(zhì)量控制提倡全面性［4-7］，故多指標(biāo)成分測定為直接有效的方法［8-11］。

小兒香橘丸中蒼術(shù)、甘草為主藥，陳皮為輔藥，加上枳實(shí)、厚樸等藥味，全方合用效果顯著，符合中醫(yī)藥整體理念。一測多評(píng)法以性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)廉易得的對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)測定其他多種成分的含量，解決了中藥對(duì)照品昂貴、稀缺、管理困難等問題，在中藥材、中藥成方制劑質(zhì)量控制中應(yīng)用廣泛［12-18］。因此，本實(shí)驗(yàn)建立一測多評(píng)法同時(shí)測定小兒香橘丸中蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷的含量，以期為整體全面地控制該制劑質(zhì)量提供科學(xué)可靠的依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器（美國Agilent 公司）； XSE205 DualRange 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； CQ-100B 超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）； 16K 離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其中SVEATMA585V3 C18Opal 有3 個(gè)批號(hào)，分別為18333165、19303361、2111939。

蒼術(shù)素（批號(hào)111924-201806，純度99.5%）、厚樸酚（批號(hào)110729-202015，純度99.0%）、和厚樸酚（批號(hào)110730-201915，純度99.8%）、新橙皮苷（批號(hào)111857-201804，純度99.4%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201818，純度96.2%）、柚皮苷（批號(hào)110722-201714，純度93.4%）、甘草苷（批號(hào)111610-201607，純度93.1%） 對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 蕓香柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)G22080134，純度98.8%） 購自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。小兒香橘丸（市售，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào) 16015845、18015421、15015420、19010678，每丸3 g）。乙腈為色譜純（北京百靈威科技有限公司）；N-N二甲基甲酰胺為分析純 （成都市科隆化學(xué)品有限公司）； 磷酸為分析純［重慶川東化工（集團(tuán)） 有限公司］； 水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷對(duì)照品適量，N-N二甲基甲酰胺制成質(zhì)量濃度分別為0.22、1.14、0.48、4.25、2.74、2.86、0.34 mg/mL 貯備液； 精密稱取橙皮苷對(duì)照品14.43 mg，置于25 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺溶解，制成貯備液，分別精密量取上述7 種貯備液1 mL，定容至刻度，即得（蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷質(zhì)量濃度分別為8.90、45.59、19.16、170.17、555.27、109.46、114.29、13.64 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取本品10 粒，研細(xì)，取約6 g，精密稱定，加入適量硅藻土研磨均勻，置于具塞錐形瓶中，精密加入N-N二甲基甲酰胺50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷至室溫，N-N二甲基甲酰胺補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按本品處方工藝和比例，分別制成缺蒼術(shù)、缺厚樸、缺陳皮和枳實(shí)、缺甘草的陰性樣品（其中山藥、蓮子、薏苡仁、砂仁、白扁豆、六神曲經(jīng)樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心專家鑒定為正品，其他13 味藥材均購自中國食品藥品檢定研究院），按 “2.1.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 SVEATMA585V3 C18Opal 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫，程序見表1； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長286 nm （厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷）、338 nm （蒼術(shù)素）； 進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution manners

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取“2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均符合要求，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取橙皮苷對(duì)照品29.28 mg，置于25 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺溶解，精密加入“2.1.1” 項(xiàng)下其他7 種成分貯備液各2 mL，定容至刻度，搖勻，分別精密量取4、3、2、1、0.5 mL，置于5 mL 量瓶中，N-N二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，并以S/N ＝10 為定量限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷峰面積RSD 分別為 1.01%、0.86%、0.74%、0.87%、1.24%、1.31%、1.01%、1.33%，表明儀器精密度較好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷含量RSD 分別為1.82%、1.06%、0.89%、1.36%、1.01%、1.74%、1.85%、1.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫（25 ℃） 下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷峰面積RSD 分別為0.57%、0.85%、0.74%、0.69%、1.25%、0.78%、0.81%、1.02%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的同一批樣品約3 g，加入一定量硅藻土，研磨均勻，置于具塞錐形瓶中，精密加入橙皮苷對(duì)照品約12 mg 及“2.1.1” 項(xiàng)下下蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷貯備液各0.6、0.5、0.6、0.5、0.9、0.5、0.7 mL，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷平均加樣回收率 （RSD） 分別為101.44% （1.36%）、99.50% （0.93%）、99.26% （1.67%）、101.23%（1.76%）、99.81% （1.91%）、101.71% （1.37%）、100.78% （1.28%）、99.77% （1.66%）。

2.4 相對(duì)校正因子計(jì)算 采用多點(diǎn)校正法，以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7 種成分的相對(duì)校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） / （CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見表3。

表3 各成分對(duì)校正因子Tab.3 Relative correction factors for various constituents

2.5 耐用性試驗(yàn) 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別考察SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm） 及同一品牌 ［SVEATMA585V3 C18Opal （250 mm×4.6 mm，5 μm）］ 不同批號(hào)（18333165、19303361、2111939） 色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜2%）。

表4 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different columns on relative correction factors

2.6 色譜峰定位

2.6.1 相對(duì)保留時(shí)間法 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以橙皮苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他7 種成分的相對(duì)保留時(shí)間，按“2.5” 項(xiàng)下方法進(jìn)行定位，結(jié)果見表5，可知該方法穩(wěn)定性良好（RSD＜4%），能初步定位色譜峰。

表5 各成分相對(duì)保留時(shí)間Tab.5 Relative retention time of various constituents

2.6.2 紫外光譜輔助法 在相對(duì)保留時(shí)間一致的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)從紫外光譜形狀、特征吸收波長及其吸光度比值出發(fā)進(jìn)行分析。對(duì)照品、供試品溶液色譜圖中各成分二極管陣列檢測器采集的峰頂點(diǎn)紫外光譜圖見圖2，可知兩者一致。

圖2 各成分紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrograms of various constituents

各成分紫外光譜特征波長及其吸光度比值見表6，可知供試品溶液色譜圖中各成分紫外光譜特征波長均與對(duì)照品溶液一致，特征波長吸光度比值亦然。結(jié)合圖2 發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷均屬于黃酮類成分，其紫外光譜圖形狀、特征波長極其相似，不易分辨，但四者特征波長（286、248 nm） 吸光度比值有明顯區(qū)別，表明該參數(shù)可將結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)成分的紫外光譜進(jìn)行區(qū)分，可采用峰/峰、峰/谷、谷/峰、谷/谷等形式。綜上所述，紫外光譜形狀、特征吸收波長、特征波長吸光度比值層層遞進(jìn)，進(jìn)一步提高了定性準(zhǔn)確度，并且紫外光譜可準(zhǔn)確輔助定位色譜峰。

表6 各成分紫外光譜特征Tab.6 Ultraviolet spectral characteristics of various constituents

2.7 樣品含量測定 取4 批樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批3 份，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、一測多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見表7，可知2 種方法所得結(jié)果接近［相對(duì)平均偏差（RAD） ＜4%］。

表7 各成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.7 Results of content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇 紫外光譜圖顯示，5 種黃酮類成分及厚樸酚、和厚樸酚在286 nm 波長處吸收較強(qiáng)，而含量較低的蒼術(shù)素適合338 nm 吸收峰，故選擇286、338 nm 作為檢測波長。再比較了SVEATMA585V3 C18Opal、GL Sciences Intersustain AQ-C18、Welch Ultimate LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 的分離效果，發(fā)現(xiàn) SVEATMA585V3 C18Opal 色譜柱最優(yōu)，適用于小兒香橘丸中多成分含量同時(shí)測定。

3.2 內(nèi)標(biāo)選擇 由于橙皮苷對(duì)照品性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)廉易得，含量較高，色譜峰出峰時(shí)間適中，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

3.3 色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)保留時(shí)間法進(jìn)行色譜峰定位，并且保留時(shí)間有偏移或有干擾時(shí)紫外光譜常作為輔助方法［19-20］。另外，新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷均屬于黃酮類化合物，紫外光譜圖極其相似，從形狀、特征吸收波長上無法區(qū)分，而本實(shí)驗(yàn)采用特征波長吸光度比值法，可達(dá)到滿意的定位效果，從而提高紫外光譜定性色譜峰的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測多評(píng)法同時(shí)測定小兒香橘丸中蒼術(shù)素、厚樸酚、和厚樸酚、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、甘草苷的含量，該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可為整體全面地控制該制劑質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，并且首次采用特征波長吸光度比值法來定位色譜峰，可為區(qū)分其他同類物質(zhì)的紫外光譜提供思路。