HPLC 法同時測定十五味骨傷丸中11 種成分

韓吳琦，呂 晉，方慧祥，牛英穎，劉威峰

（1.開封市食品藥品檢驗所，河南 開封 475000； 2.曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000；3.云南省食品藥品審核查驗中心，云南 昆明 650106）

十五味骨傷丸是開封市中醫(yī)院臨床常用經(jīng)驗方［批準文號豫藥制字Z20120842 （汴）］，由地龍、土鱉蟲、人參、丹參、赤芍、制何首烏、紅花、煅自然銅、兒茶、大黃、陳皮、菟絲子、女貞子、砂仁、三七組成，功效祛瘀活血、消腫止痛、續(xù)筋接骨，已有三十多年應(yīng)用歷史，臨床效果良好，受到廣大患者認可。但目前該制劑執(zhí)行標準由醫(yī)院自行制定，只對方中丹參進行了TLC 定性鑒別，未涉及其他成分，無法全面反映其質(zhì)量，并且尚無關(guān)于其定性、定量研究的文獻。因此，本實驗建立HPLC 法同時測定十五味骨傷丸中兒茶素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷［1-4］、橙皮苷、丹酚酸B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、隱丹參酮、大黃酚、大黃素甲醚、丹參酮ⅡA的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AD 高效液相色譜儀（配置二極管陣列檢測器）、UV-2550 紫外可見分光光度計（日本島津公司）； MS205DU 電子分析天平（萬分之一，梅特勒-托利多國際股份有限公司）； KQ-100VDB 三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蘆薈大黃素 （批號110795-202011，純度98.3%）、大黃酚 （批號110796-201922，純度99.2%）、大黃酸 （批號110757-201607，純度100%）、大黃素 （批號110756-201913，純度100%）、大黃素甲醚（批號110758-201817，純度99.0%）、橙皮苷 （批號110721-202019，純度96.2%）、兒茶素 （批號110877-202005，純度99.2%）、丹酚酸B （批號111562-201917，純度94.1%）、隱丹參酮（批號110852-201807，純度98.7%）、丹參酮ⅡA（批號110766-202022，純度99.5%）、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號110844-201915，純度90.7%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。十五味骨傷丸由開封市中醫(yī)院生產(chǎn)，每瓶60 g，批號20210104、20210315、20210501、20210702、20210928。乙腈為色譜純； 甲醇、磷酸為分析純；水為超純化去離子水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依利特C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～20 min，13%A； 20～24 min，13% ～31%A； 24 ～50 min，31% ～58% A； 50 ～65 min，58% ～88%A； 65 ～75 min，88% ～13%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長283 nm（0～25 min，兒茶素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B）、254 nm （25 ～75 min，大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、丹參酮ⅡA、隱丹參酮）；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇制成貯備液（含兒茶素1 134.848 0 μg/mL、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷1 021.282 0 μg/mL、橙皮苷989.898 0 μg/mL、丹酚酸B 1 012.516 0 μg/mL、蘆薈大黃素124.447 8 μg/mL、大黃酸 128.500 0 μg/mL、大黃素115.100 0 μg/mL、隱丹參酮1 074.843 0 μg/mL、大黃酚104.259 2 μg/mL、大黃素甲醚70.587 0 μg/mL、丹參酮ⅡA1 129.325 0 μg/mL），分別精密吸取適量，甲醇制成分別含兒茶素308.678 6 μg/mL、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷51.064 1 μg/mL、橙皮苷77.212 0 μg/mL、丹酚酸B 141.752 2 μg/mL、蘆薈大黃素6.471 3 μg/mL、大黃酸7.710 0 μg/mL、大黃素19.567 0 μg/mL、隱丹參酮 5.374 2 μg/mL、大黃酚23.304 3 μg/mL、大黃素甲醚12.648 0 μg/mL、丹參酮ⅡA11.293 2 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品50 丸，研細，精密稱取2 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，冷卻，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按本品處方工藝和比例，分別制成缺丹參、缺何首烏、缺兒茶、缺大黃和何首烏、缺陳皮的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離完全，對稱性理想，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，甲醇稀釋成7 個質(zhì)量濃度，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得兒茶素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、隱丹參酮、大黃酚、大黃素甲醚、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為0.39%、0.44%、0.35%、0.30%、0.46%、0.36%、0.41%、0.47%、0.40%、0.43%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液（批號20210928），于0、2、4、8、12、16、24、48 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得兒茶素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、隱丹參酮、大黃酚、大黃素甲醚、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為0.58%、0.84%、0.42%、0.55%、1.08%、0.92%、1.05%、0.88%、0.46%、0.74%、0.67%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批本品6 份（批號20210928），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得兒茶素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、隱丹參酮、大黃酚、大黃素甲醚、丹參酮ⅡA含量RSD 分別為0.51%、0.62%、0.44%、0.48%、0.88%、0.36%、0.41%、0.60%、0.56%、0.71%、0.59%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的本品（批號20210928） 6 份，每份約1.0 g，精密加入 “2.2.1” 項下對照品溶液適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，兒茶素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、隱丹參酮、大黃酚、大黃素甲醚、丹參酮ⅡA平均加樣回收率分別為98.80%、98.98%、98.90%、99.11%、98.16%、98.95%、98.61%、99.59%、99.06%、99.10%、98.62%，RSD 分別為 0.67%、1.00%、0.41%、0.67%、0.84%、0.38%、0.34%、0.46%、0.78%、0.88%、0.46%。

2.3.7 樣品含量測定 取5 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（μg/g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （μg/g，n＝3）

3 討論

3.1 指標成分選擇 十五位骨傷丸中地龍、土鱉蟲為動物藥，含有大分子蛋白質(zhì)，在二極管陣列檢測器中無法檢出； 煅自然銅為礦物藥，主要成分為二硫化鐵，上述儀器也無法檢出。因此，本實驗選擇丹參、制何首烏、兒茶、大黃、陳皮所含主要成分［5-7］進行含量測定。

3.2 制備方法選擇 參考文獻［8-14］ 報道。

3.2.1 提取溶劑 本實驗考察了50%甲醇、75%甲醇、甲醇、水、50%乙醇、95%乙醇，發(fā)現(xiàn)甲醇提取時各成分總含量較高，效果良好。

3.2.2 提取方法 本實驗考察了超聲提取、冷浸提取、回流提取，發(fā)現(xiàn)超聲提取時操作簡單，各成分總含量較高。

3.2.3 提取時間 本實驗考察了提取時間15、30、45、60 min，發(fā)現(xiàn)提取30 min 時各成分總含量較高。

3.3 色譜條件選擇

3.3.1 色譜柱 本實驗考察了Waters、依利特、Inerstil 等不同品牌色譜柱，發(fā)現(xiàn)依利特色譜柱分離效果理想，重復(fù)性良好。

3.3.2 流動相 本實驗考察了甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.5% 醋酸、乙腈-0.1% 甲酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1% 磷酸洗脫時各成分總含量較高。

3.3.3 檢測波長 本實驗將對照品溶液在190 ～400 nm 波長范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)兒茶素在280、210 nm，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在289、300 nm，橙皮苷在283、328 nm，丹酚酸B 在227、273、313 nm，蘆薈大黃素在286、254 nm，大黃酸在229、257 nm，大黃素在252、265、288 nm，隱丹參酮在262、358 nm，大黃酚在256、277、286 nm，大黃素甲醚在266、287 nm，丹參酮ⅡA 在268、352 nm 附近均有最大吸收，為了確保各成分均可在最大吸收波長處進行檢測，提高靈敏度，減少干擾，參考文獻［15-23］報道采用254、283 nm 的波長切換方式。

4 結(jié)論

本實驗采用HPLC 法同時測定十五味骨傷丸中兒茶素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、隱丹參酮、大黃酚、大黃素甲醚、丹參酮ⅡA的含量，發(fā)現(xiàn)個別批次樣品中一些成分含量偏低，可能與藥材質(zhì)量差異有關(guān)，應(yīng)加以關(guān)注。同時，該方法簡便、快速、準確，重復(fù)性良好，可為十五味骨傷丸質(zhì)量標準研究提供參考。