常綠鉤吻堿微乳處方優(yōu)化及其安全性評價

蔣文文，宋 煜*，許 文，2，郭芷怡，吳水生，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122； 2.福建中醫(yī)藥大學生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122； 3.福建省中藥產(chǎn)業(yè)技術開發(fā)基地，福建 福州 350122）

常綠鉤吻堿是從鉤吻中提取分離得到的一種育亨賓型生物堿，因其抗腫瘤活性而引起廣泛關注。近年來研究表明，常綠鉤吻堿在治療神經(jīng)膠質瘤方面具有很好的效果［1］，但該成分存在水溶性差［2］、血腦屏障的問題，會影響其發(fā)揮藥效。

前期報道，鼻腔給藥后藥物分子可通過嗅區(qū)沿著包繞在嗅球神經(jīng)束周圍的連接組織或嗅神經(jīng)元的軸突到達腦脊液或腦室，從而繞過血腦屏障進入腦部而發(fā)揮藥效［3］。微乳是由油相、乳化劑、助乳化劑、水相按照一定比例自發(fā)形成的粒徑在100 nm 以下的熱力學穩(wěn)定分散體系［3］，能增加難溶性藥物溶解度［4］及其黏膜滲透性［5］。本實驗選擇微乳作為載體，將常綠鉤吻堿制成鼻用制劑，并優(yōu)化其處方，再進行質量評價，以期為后續(xù)相關開發(fā)提供基礎。

1 材料

1.1 儀器 ME204E 電子天平［萬分之一，梅特勒-托利多儀器 （上海） 有限公司］； NICOMP 380ZLS 納米粒度及電位分析儀（美國PSS 粒度儀公司）； Waters ACQUITY UPLC System 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； H2050R 高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）； ZLCL-2A磁力攪拌器（鞏義市英峪博研儀器設備廠）。

1.2 試劑與藥物 常綠鉤吻堿對照品（武漢天植生物技術有限公司，批號CFS201902）； 常綠鉤吻堿原料藥（實驗室自制）。吐溫-80 （Tween-80，批號C11408815）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40，批號C12462376）、Labrasol （批號C11372212）、1，2-丙二醇 （批號C11905857）、蓖麻油 （批號C10798619）、中碳鏈三甘油酯（批號Y13A10C95047 ）、油酸乙酯（EO，批 號C10889647） （上海麥克林生化科技有限公司）； 聚氧乙35 蓖麻油（EL-35，上海源葉生物科技有限公司，批號H27D10A106957）； Solutol HS 35 （美國MedChemExpress 公司，批號62908）； 1，3-丁二醇（上海易恩化學技術有限公司，批號R005156）； 無水乙醇 （國藥集團化學試劑有限公司，批號20190910）； 聚乙二醇400 （PEG400，北京索萊寶科技有限公司，批號722Y014）； Labrafil M 1944 CS （嘉法獅上海貿(mào)易有限公司，批號3063BA2）。

1.3 動物 普通級中華大蟾蜍，雌雄兼具，體質量40～50 g，購于市場。SPF 級雄性SD 大鼠，體質量180～200 g，購于杭州醫(yī)學院，動物生產(chǎn)許可證號 SCXK （浙） 2019-02，合格證編號20211229Aazz0100000407。

2 方法與結果

2.1 常綠鉤吻堿含量測定

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC ? BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）； 流動相0.1%甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%B； 0.5 ～2.0 min，10% ～80% B； 2.0 ～2.5 min，80% B； 2.5 ～2.8 min，80% ～10% B； 2.8 ～5.0 min，10% B）； 體積流量0.25 mL/min； 柱溫45 ℃； 檢測波長242 nm； 進樣量2 μL。

2.1.2 線性關系考察 取常綠鉤吻堿對照品適量，甲醇制成系列質量濃度，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝30 048X-62 693 （r＝0.999 9），在2.5 ～30 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 方法學考察 日內、日間精密度RSD 均小于2%； 高、中、低質量濃度平均加樣回收率分別為99.47%，99.76%、100.37%，RSD 分別為0.85%、1.02%、1.44%，均符合相關要求。

2.2 乳化劑、助乳化劑篩選 采用溶解度法，取過量常綠鉤吻堿粉末，分別與Tween-80、RH40、EL-35、Labrasol、Solutol HS 35、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、無水乙醇、PEG 400、丙三醇、Transcutol P 各1.0 g 混合，超聲處理30 min，置于振蕩器中振蕩48 h，15 000 r/min 離心10 min，取上清，甲醇適當稀釋，按“2.1.1” 項下方法測定溶解度，重復3 次，取平均值［6］，結果見表1。由此可知，常綠鉤吻堿在Tween-80 中的溶解度最大，其次是在RH40 中，并且在助乳化劑1，2-丙二醇中的溶解度最大，考慮材料安全性、藥物溶解度，確定乳化劑為Tween-80、RH40，助乳化劑為1，2-丙二醇。

表1 常綠鉤吻堿溶解度測定結果（n＝3）Tab.1 Results of solubility determination of sempervirine（n＝3）

2.3 處方篩選 表1 顯示，常綠鉤吻堿在各油相中的溶解度均較低，并且僅在Labrafil M 1944 CS、蓖麻油、中碳鏈三甘油酯、油酸乙酯中能檢測到，故在進行油相篩選時主要以油相與混合乳化劑（乳化劑與助乳化劑混合） 所形成的微乳區(qū)域面積來決定其種類。查閱文獻［7-12］ 發(fā)現(xiàn)，微乳處方質量比Km值大多為2，故采用偽三元相圖確定油相［13-14］。

將1，2-丙二醇分別與2 種乳化劑（Tween-80、RH40） 按Km2 ∶1 制成混合乳化劑，再分別與Labrafil M 1944 CS、蓖麻油、中碳鏈三甘油酯、油酸乙酯按Km1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2、9 ∶1 在恒溫磁力攪拌器上混合均勻，向混合物中滴加水，通過目測法判斷由澄清變渾濁或由渾濁變澄清的滴定終點，記錄微乳形成時各組分量，采用Origin 2018 歸一化處理繪制偽三元相圖，結果見圖1 ～2。由此可知，以Labrafil M 1944 CS 為油相，RH40 為乳化劑，1，2-丙二醇為助乳化劑時微乳區(qū)域面積最大，故選擇其作為處方。

圖1 空白微乳偽三元相圖（乳化劑RH40）Fig.1 Pseudo ternary phase diagrams of blank microemulsions （emulsifier was RH40）

圖2 空白微乳偽三元相圖（乳化劑吐溫-80）Fig.2 Pseudo ternary phase diagrams of blank microemulsions （emulsifier was Tween-80）

2.4 處方優(yōu)化 采用Box-Behnken 響應面法［15-17］。

根據(jù)圖1 ～2，確定油相用量為5% ～10%，乳化劑用量為15% ～30%，助乳化劑用量為10% ～20%。以油相（A）、乳化劑（B）、助乳化劑（C）用量為影響因素，粒徑（Y1）、載藥量（以常綠鉤吻堿含量計，Y2） 為評價指標，結果見表2。

表2 試驗設計與結果（n＝3）Tab.2 Design and results of tests （n＝3）

按照表2 方案稱取相應用量的乳化劑、助乳化劑，混合后加入相應用量的油相，加水補足剩余量，再加入過量常綠鉤吻堿，恒溫（37 ℃） 振蕩48 h，取出，15 000 r/min 離心10 min，上清液用甲醇適當稀釋，測定常綠鉤吻堿載藥量，再將微乳加水稀釋1 倍，采用激光粒度儀測定粒徑，Design-Expert 8.0.6 軟件進行方差分析，結果見表3 ～4、響應面分析見圖3～4。

圖3 各因素響應面圖（粒徑）Fig.3 Response surface plots for various factors （particle size）

圖4 各因素響應面圖（載藥量）Fig.4 Response surface plots for various factors （drug loading）

表3 粒徑方差分析Tab.3 Analysis of variance for particle size

表4 載藥量方差分析Tab.4 Analysis of variance for drug loading

由于微乳粒徑越小，越有利于藥物吸收； 載藥量越高，臨床用量越小，故以平均粒徑最小值、載藥量最大值為指標，得到最優(yōu)處方為油相（Labrafil M 1944 CS）、乳化劑（RH40）、助乳化劑（1，2-丙二醇）、水用量5%、19.53%、19.25%、56.22%，粒徑為 32.21 nm，載藥量為 2.205 mg/mL。再對數(shù)據(jù)進行擬合，得到方程分別為Y1＝-354.273 61＋59.160 00A＋ 25.992 87B＋4.427 50C-4.489 33AB-0.145 33BC-0.468 47B2＋0.088 889AB2、Y2＝- 2.002 62 - 0.104 05A＋0.426 88B- 0.048 962C＋8.813 33 × 10-3AB-9.080 00×10-3AC-5.153 33×10-3BC-9.898 71×10-3B2＋8.257 89 × 10-3C2（r1＝0.963 6，r2＝0.969 6），可知模型P值均小于0.01； 粒徑、載藥量失擬項P值分別為0.054 7、0.081 3，均大于0.05，表明模型擬合理想，可用于預測分析。

按上述優(yōu)化處方制備3 批樣品，測定其粒徑、載藥量，結果見表5。由此可知，模型預測性良好，可用于處方優(yōu)化，并且其載藥量比在水溶液中提高了7.08 倍。

表5 驗證試驗結果（n＝3）Tab.5 Results of verification tests （n＝3）

2.5 微乳制備及質量評價

2.5.1 制備工藝 按“2.4” 項下優(yōu)化處方精密稱取各輔料適量，先將RH40 與1，2-丙二醇混勻，再加入油相混勻，得到非水相，邊攪拌邊緩慢加入處方量蒸餾水，即得空白微乳； 加入常綠鉤吻堿后攪拌混勻，再加入處方量水相混勻，即得載藥微乳。

2.5.2 評價指標

2.5.2.1 外觀 按“2.4” 項下優(yōu)化處方制備空白微乳、載藥微乳各3 批，發(fā)現(xiàn)后者為黃綠色透明溶液，底部未見分層或沉淀。

2.5.2.2 粒徑 取“2.5.1” 項下微乳適量，采用粒徑儀測得空白微乳、載藥微乳粒徑分別為28.7、32.6 nm，粒徑分布系數(shù)分別為0.123、0.165，見圖5。

圖5 各樣品粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of various samples

2.5.2.3 形態(tài) 以少量2%磷鎢酸負染載藥微乳后滴加到200 目銅網(wǎng)上，自然揮干，在透射電鏡下觀察其形態(tài)［4］，結果見圖6，可知該制劑呈球形或類球形。

圖6 常綠鉤吻堿微乳透射電鏡圖Fig.6 Transmission electron microscopy image of sempervirine microemulsions

2.6 鼻纖毛毒性研究

2.6.1 纖毛毒性實驗 25 只蟾蜍隨機分為5 組，每組5 只，探針破壞脊髓、腦部，向上顎黏膜滴加0.5 mL 生理鹽水，當黏膜完全被溶液覆蓋時充分接觸20 min，手術剪小心剝離上顎黏膜（面積約3 mm×3 mm），立即用生理鹽水洗凈血絲與雜物，纖毛面向上平鋪于載玻片上，滴加少量生理鹽水后從一側緩慢蓋上蓋玻片，在生物顯微鏡（放大400倍） 下觀察纖毛擺動情況，再立即將載玻片置于含有少量蒸餾水的層析缸中，在25 ℃下密閉保存，每隔25 min 取樣觀察，在蓋玻片邊緣先滴加適量生理鹽水，觀察纖毛擺動情況，直至纖毛停止運動［18］。另取呋麻滴鼻液（含1%鹽酸麻黃堿）、1%脫氧膽酸鈉、空白微乳、載藥微乳適量，同法處理，觀察纖毛擺動情況。

2.6.2 指標檢測

2.6.2.1 纖毛持續(xù)擺動時間 記錄給藥開始到纖毛停止擺動時間，即為纖毛持續(xù)擺動時間，再分別以生理鹽水組、呋麻滴鼻液組為100%，計算其他各組纖毛擺動時間與其比例，即為相對運動占比，其數(shù)值越大，對鼻纖毛毒性越?。?9］，結果見表6。

表6 纖毛持續(xù)擺動時間測定結果（n＝6）Tab.6 Results of cilium continuous swing time determination （n＝6）

2.6.2.2 纖毛形態(tài) 在生物顯微鏡下觀察各組蟾蜍上顎纖毛形態(tài)，結果見圖7。由此可知，1% 脫氧膽酸鈉組蟾蜍纖毛基本脫落，即對其運動有顯著抑制作用； 生理鹽水組、呋麻滴鼻液組、常綠鉤吻堿微乳組蟾蜍纖毛排列整齊，擺動狀態(tài)活躍，表明常綠鉤吻堿、輔料、微乳對鼻纖毛運動的影響較小，毒性較低，應用鼻腔給藥安全性較高。

圖7 各組蟾蜍上顎纖毛形態(tài)Fig.7 Ciliary morphologies of Bufo bufo gargarizans Cantor upper jaw in various groups

2.7 鼻黏膜刺激性實驗 30 只大鼠隨機分為5組，分別為生理鹽水組、呋麻滴鼻液組、1%脫氧膽酸鈉溶液組、空白微乳組、常綠鉤吻堿微乳組，平頭微量注射器進行鼻腔給藥，劑量為單側50 μL，給藥后從外側輕壓鼻翼以防止藥液流失，每天1 次，連續(xù)7 d，第7 天給藥后24 h 處死大鼠，取鼻中隔黏膜，固定于4%多聚甲醛中，進行石蠟包埋切片、HE 染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)［18］，結果見圖8。由此可知，生理鹽水組、呋麻滴鼻液組、空白微乳組、常綠鉤吻堿微乳組大鼠鼻黏膜完整，結構清晰，黏膜上纖毛整齊，表明對鼻黏膜無刺激性； 1%脫氧膽酸鈉溶液組大鼠黏膜纖毛脫落，結構不完整，表明具有明顯的鼻黏膜刺激性。

圖8 各組大鼠鼻黏膜纖毛形態(tài)Fig.8 Ciliary morphologies of rat nasal mucosa in various groups

3 討論與結論

常綠鉤吻堿在水中的溶解度很小，而鼻腔內藥液容納量有限［20］，限制了其每次用藥量。本實驗將該成分制成微乳以提高其載藥量，需重視輔料載藥能力，故先采用水滴定法繪制偽三元相圖，再以星點效應-響應面法優(yōu)化處方。根據(jù)相關研究及2020 年版《中國藥典》，可知本實驗所得最優(yōu)處方中的藥用輔料用量在安全合理范圍內，可應用于鼻腔。

前期預實驗發(fā)現(xiàn)，油相對藥物的溶解度很小，雖然其占比低于5%時微乳粒徑變化不大，但在一定程度上有利于藥物與腦部毛細血管內皮細胞的親和性［21］，故其取值范圍僅占5% ～10%?？紤]到微乳黏度過大時不利于臨床應用、藥物分散，故水相比例不宜少于40%，同時乳化劑與助乳化劑比例過大時會有潛在毒性，故結合三元相圖設定乳化劑用量范圍為15% ～30%，助乳化劑用量范圍為10% ～20%。

本實驗采用鼻腔給藥方式進行安全性評價，目的是通過鼻—腦通路使藥物靶向腦部，故鼻腔纖毛毒性是重要研究內容。首先，采用在體蟾蜍上顎模型來考察空白制劑、常綠鉤吻堿微乳對鼻纖毛的影響。再觀察給藥后大鼠鼻黏膜組織結構、表面纖毛形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)該制劑鼻黏膜毒性較小，可應用于鼻腔。

綜上所述，本實驗將常綠鉤吻堿制成微乳以解決該成分溶解度差的問題，并考察其鼻腔給藥安全性，可為臨床治療腦膠質瘤提供依據(jù)。