固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飲用水中的氨基酸污染物

趙妮娜

（四川省廣元生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站，四川 廣元 628017）

引言

氨基酸（AAs）是地表水中有機(jī)氮的重要組成部分，占海水中溶解有機(jī)氮（DON）的25%[1]。地表水中的主要氨基酸在不同研究中有所不同，其中一些研究報告指出甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸是濃度相對較高的三種主要氨基酸。地表水中的氨基酸組合是游離氨基的4～5倍[2]。然而，肽鍵中涉及的氮最初不能用于反應(yīng)，氯和蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)可以分為兩個步驟。首先，發(fā)生涉及反應(yīng)性側(cè)基的快速反應(yīng)，產(chǎn)生三鹵甲烷。其次，包括鹵代乙腈在內(nèi)的其他消毒副產(chǎn)物（DBP）主要是通過多肽主鏈的緩慢堿催化降解形成的[3]。然而，在典型的飲用水處理條件下，上述組合AAs的反應(yīng)不太可能發(fā)生，所以在地表水中組合AAs濃度較高的情況，F(xiàn)AAs受到了更多的關(guān)注。大多數(shù)研究都是基于批量實驗，其中FAAs的應(yīng)用濃度可能遠(yuǎn)高于實際飲用水中的濃度。然而，我國每年要生產(chǎn)大量飲用水，到2020年這一數(shù)量將高達(dá)200多億立方米。另外，我國也是一個經(jīng)常出現(xiàn)飲用水氣味問題的國家，而引起氣味的化合物目前仍然未知。因此，從飲用水的安全角度看，充分了解飲用水中FAAs的濃度水平是相當(dāng)重要的，而且相關(guān)研究也較少?；诖耍疚闹饕芯客ㄟ^SPE與UPLC-MS/MS聯(lián)用測定飲用水源水中15種FAAs的痕量方法，并檢測某地區(qū)采集的飲用水源水樣品中15種FAAs的濃度水平。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)品和試劑

本試驗選擇了15種游離氨基酸（FAAs）作為目標(biāo)化合物，包括丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。每種FAA的純度至少為99%。L-蘇氨酸-2、3-d2和亮氨酸-d3作為內(nèi)標(biāo)，購自上海。甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）為HPLC級，購自Fisher Scientific（USA）。氫氧化銨（NH3·H2O，14 mol/L）、甲酸（純度99%）和濃鹽酸（32%，HCl）從Sigma-Aldrich（美國）獲得。超純水用于制備試劑級的化學(xué)品溶液。使用0.1 mol/L鹽酸溶液分別制備15種FAA的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 mM）和L-蘇氨酸-2、3-d2和亮氨酸-d3的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.2 樣品采集和制備

水樣品采集于四川省8個不同地區(qū)的飲用水源水樣本。各水樣的基本水質(zhì)參數(shù)見表1。所有水樣都經(jīng)過pH調(diào)節(jié)至 2～3，用50%鹽酸稀釋，用純水（v/v）稀釋，并用0.45 μm玻璃纖維過濾器在真空下過濾每個水樣。所有水樣均儲存在 溫度為30 ℃的環(huán)境中。

表1 水質(zhì)參數(shù)

本試驗選擇強(qiáng)陽離子交換（SCX）固相萃取柱和反相固定相柱。在pH值分別為2.8、4.5和6.5的條件下進(jìn)行了兩種不同類型固相萃取柱的回收率測試。研究發(fā)現(xiàn)，反相藥筒中FAAs的回收率非常低。另一方面，強(qiáng)陽離子交換柱明顯獲得了更好的回收率，尤其是在pH值為2.8時。所以將每個水樣的pH值調(diào)節(jié)至2.8，然后在真空下以2 mL/min的流速通過固相萃取柱濾筒，用9 mL乙酸溶液（pH=2.8）、4.5 mL甲醇和9 mL純水，流速為2 mL/min，裝水后，用含有4.5%的甲醇（pH=2.8），將固相萃取柱在真空下干燥30 min，再用8 mL含有5%氫氧化銨的MeOH溶液以2 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。在40 ℃的溫和氮氣流下蒸發(fā)提取物，并用1 mL超純水重新配制。最后，將提取的樣品轉(zhuǎn)移到1.5 mL琥珀色小瓶中，準(zhǔn)備進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.3 固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）

利用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析時，使用LC-20ADXR液相色譜儀與配備ESI源的AB Sciex API 4000三重四級質(zhì)譜儀。流動相A是含有0.2%甲酸的水，而流動相B是含有0.2%乙酸的MeOH/ACN（2：8；v/v）的混合溶液。梯度程序從5%B開始，在2.5 min內(nèi)線性升至40%B，然后在3分鐘內(nèi)線性增至70%B，最后在0.5 min內(nèi)升至90%B，同時平衡2 min。在梯度程序的最后階段，流動相B在0.5 min內(nèi)向初始條件的5%返回，并保持2 m i n。整個分離過程約為10.5 min。流動相流速設(shè)定為0.3 mL/min。柱溫保持在35 ℃，進(jìn)樣體積為5.0 μL。

串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）在ESI陽性模式下使用定時多反應(yīng)監(jiān)測器（MRM）進(jìn)行。通過注入單一標(biāo)準(zhǔn)溶液和所有目標(biāo)化合物的混合物來獲得最佳的MS/MS條件。離子源溫度為150.0 ℃，離子噴射電壓為2 500 V，入口電勢為10 V。氮氣用作碰撞和去溶劑氣體。碰撞壓力、離子源1和離子源2氣體的壓力分別為6 psi、50 psi和50 psi。

1.4 研究方法

本研究對所提出方法的日間和日內(nèi)精密度、穩(wěn)定性、回收率進(jìn)行評價。基于中等濃度的純標(biāo)準(zhǔn)溶液，在連續(xù)三天的三個時間點評估日間和日內(nèi)精度。通過制備的樣品濃度變化來測量各種FAA的穩(wěn)定性。分別在0、6、12和24 h測試在室溫下放置的相同濃度為100 nmol/L的五個水樣。每種分析物的穩(wěn)定性計算為不同時間點測得的濃度與0 h初始濃度的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化

首先，本試驗研究了用兩種不同類型的柱分離濃度為1 μmol/L的純標(biāo)準(zhǔn)品（圖1），即ACQUITY UPLC BEH HILIC柱和ACQUITY UPLC BEH C18柱。結(jié)果表明，前一列出現(xiàn)峰值模式干擾，各FAA的響應(yīng)值受到抑制。15個FAA的峰分離效果較差。相反，后一個柱在短時間內(nèi)顯示出相鄰峰之間更好的分離，并且峰模式是平滑的，每個FAA的響應(yīng)值更好，所以選擇ACQUITY UPLC BEH C18柱作為分離柱。與陰性模式相比，陽性模式下的多重反應(yīng)監(jiān)測可以獲得更高的靈敏度和更好的再現(xiàn)性。目標(biāo)掃描時間設(shè)置為1 s。表2中總結(jié)了通過將標(biāo)準(zhǔn)純?nèi)芤褐苯幼⑷胭|(zhì)譜儀獲得的優(yōu)化去簇電位、碰撞能量和碰撞退出電位，其中還包括15種FAA的前體和子離子[4]。

表2 UPLC-MS/MS條件和等電點

2.2 精度和穩(wěn)定性

本研究總結(jié)了天然水樣中15種FAA的日內(nèi)和日間精度以及制備后的穩(wěn)定性，詳見表3，日內(nèi)和日間精密度分別為3.52 %～ 6.71%和3.34%～ 7.23%。15種FAAs在飲用水源水中的穩(wěn)定性在92 %～ 110%范圍內(nèi)，表明本研究所建立的方法在室溫下可以穩(wěn)定6、12和24 h，而且具有良好的靈敏度和重復(fù)性。

表3 精度和穩(wěn)定性

本研究表明，當(dāng)水樣pH 值低于3 時只能使痕量污染物在水樣中穩(wěn)定48 h，所以所開發(fā)的方法顯示出良好的線性（R2＞0.991），而且檢測限低（LODs，0.01～0.27 nmol/L）。

2.3 樣品提取的優(yōu)化

水樣的pH值是影響固相萃取效果的一個重要因素，所以本實驗研究了水樣pH值分別為2.8、4.5和6.5時對回收性能的影響。如表4所示，當(dāng)水樣的pH值較低時，15種FAAs在超純水中的回收率可以顯著提高，而降低水樣的pH值可以在不離解羧酸基團(tuán)的情況下使氨基質(zhì)子化，從而產(chǎn)生FAA的正電荷，進(jìn)一步促進(jìn)帶負(fù)電荷的交換樹脂和帶正電荷的FAAs之間發(fā)生相互作用，可以進(jìn)一步提高FAAs的回收率。

表4 水樣回收率試驗的準(zhǔn)確性）

盡管降低水樣的pH值可以顯著提高FAAs的回收率，但當(dāng)水樣的pH值進(jìn)一步降低到2.8時，水中的一些基質(zhì)也會被共吸附在SPE柱上，然后從柱上共洗脫，從而導(dǎo)致回收率降低。同時，當(dāng)水樣的pH值增加到中性時，許多FAA的損失可能達(dá)到80%。因此，提取前水樣的最佳pH值應(yīng)為2.8。

本研究結(jié)果表明，優(yōu)化的洗脫液是含有4.5%甲醇的4.5 mL的乙酸溶液，其pH值為2.8，在飲用水源水中的回收率為69.8%～117.9%。

3 結(jié)論

本研究建立了SPE結(jié)合UPLC-MS/MS測定15種FAA的痕量分析方法，并對其進(jìn)行了優(yōu)化和驗證，結(jié)果表明：SPE不僅可以富集FAA，還可以消除基質(zhì)干擾。該方法具有較好的效果，在RSDs低的飲用水中獲得了69.8%～117.9%的良好回收效率。