微弧氧化TiO2 涂層微結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞黏附性能的影響

翦奉林， 金凡亞， 馮 軍， 李必文， 但 敏， 楊 涵， 黃 熠， 唐國慶

(1.南華大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院， 湖南 衡陽421001； 2.核工業(yè)西南物理研究院， 四川 成都 610041)

0 前 言

鈦合金由于比強(qiáng)度高、彈性模量低、抗疲勞性能優(yōu)異，表現(xiàn)出良好的生物力學(xué)相容性[1]，被廣泛用作醫(yī)學(xué)植入體來替換骨、牙等硬組織。 目前在骨頭、牙齒等醫(yī)用硬植入體領(lǐng)域內(nèi)使用最多的鈦合金為Ti6Al4V，但鋁元素和釩元素的釋放會(huì)導(dǎo)致人類神經(jīng)發(fā)生病變以及罹患阿爾茨海默癥[2]。 采用TA2 純鈦?zhàn)鳛橹苽溽t(yī)學(xué)植入體的基材可以避免鋁元素和釩元素的釋放對(duì)人體的危害，但純鈦表面是光滑無孔的，研究表明，細(xì)胞無法在光滑材料的表面增值分化[3]。 鈦及鈦合金存在生物活性不足及耐磨性較差的問題，需要對(duì)鈦及鈦合金進(jìn)行表面改性使其具有良好的生物活性及耐磨性，在作為植入體進(jìn)入人體之后，能夠形成強(qiáng)有力的骨性結(jié)合。在鈦及鈦合金材料表面構(gòu)建微納二級(jí)結(jié)構(gòu)就是一種較好的表面改性辦法。 任冰等[4]研究發(fā)現(xiàn)，微納二極結(jié)構(gòu)能夠提高材料表面的親水性，促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和礦化等。 Wang 等[5]采用復(fù)合噴砂、酸蝕、堿熱處理表面改性方法，在Ti6Al4V 表面成功構(gòu)建了微納二級(jí)結(jié)構(gòu)，生物檢測試驗(yàn)表明該改性后的表面具有較好的生物相容性。 門博等[6]對(duì)激光加工中電流和Q 頻率(激光器輸出的脈沖信號(hào)的重復(fù)頻率)等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，在鈦合金表面成功制備出規(guī)則的微凹坑陣列。 以上研究都是通過微加工和激光工藝在材料表面構(gòu)建微納結(jié)構(gòu)，但這些方法的工藝都較為復(fù)雜，采用的高精設(shè)備增加了制造成本。 微弧氧化法工藝簡單，成本較低，所制備的膜層較為均勻，近年來被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料的制備[7，8]。 微弧氧化所制備的涂層本身就存在孔洞較多的特點(diǎn)，可以對(duì)這一特性加以利用，通過調(diào)節(jié)電參數(shù)以及電解液配方在材料表面構(gòu)建微納結(jié)構(gòu)。

目前采用微弧氧化法制備醫(yī)學(xué)植入體時(shí)通常都是將微弧氧化工藝和堿熱、水熱、酸蝕[9，10]處理結(jié)合起來制備膜層。 研究者們大多采用磷酸鹽系電解液，研究表明可以通過控制鈣磷比來促進(jìn)羥基磷灰石(HA)膜層的生成，HA 是人體骨骼無機(jī)質(zhì)的重要組成部分[11，12]，多項(xiàng)研究顯示經(jīng)堿熱處理后的材料生物相容性有明顯提高，而NaOH 可以更好地誘導(dǎo)出HA，進(jìn)而更好地提高材料的生物相容性[13]。 本工作采用磷酸鹽系電解液和NaOH 系電解液，設(shè)置不同電參數(shù)和電解液濃度在TA2 純鈦表面制備不同的微結(jié)構(gòu)，通過細(xì)胞黏附試驗(yàn)對(duì)比細(xì)胞在改性表面的黏附能力。

1 試 驗(yàn)

1.1 基材前處理

基材選用TA2 純鈦金屬樣品(φ15 mm×3 mm)，其化學(xué)成分見表1。

表1 TA2 純鈦化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of TA2 pure titanium

采用水砂紙打磨樣品表面以去除原始氧化膜層，再用金相砂紙打磨出金屬光澤，使用拋光機(jī)拋光至鏡面，使用丙酮超聲清理15 min 去除樣品表面的油污，采用無水乙醇超聲清洗15 min 去除殘留的丙酮，用去離子水反復(fù)沖洗去除殘留的丙酮和乙醇，吹風(fēng)干燥備用。

1.2 氧化鈦涂層的制備

采用核工業(yè)西南物理研究院自制的微弧氧化設(shè)備，設(shè)備包括電源、不銹鋼電解槽、水冷機(jī)和壓縮機(jī)。以樣品為陽極，不銹鋼電解槽為陰極，電解液采用去離子水配置，設(shè)置不同電解液濃度、電參數(shù)以及不同時(shí)間制備了4 組具有典型微觀形貌的樣品，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣品，各參數(shù)如表2 所示。

表2 微弧氧化參數(shù)Table 2 Parameters of micro-arc oxidation

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇

對(duì)MC3T3-E1(小鼠成骨細(xì)胞)按照細(xì)胞培養(yǎng)操作流程進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并提供細(xì)胞用于后續(xù)檢測。 將ddH2O 預(yù)熱至37 ℃后，戴上手套、口罩和帽子，從液氮罐中取出裝有目的細(xì)胞的凍存管(內(nèi)有1 mL 細(xì)胞混合液)，立即投入37 ℃ddH2O 中，輕搖凍存管使之在1 min 內(nèi)快速溶解。 完全溶解后，使用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進(jìn)超凈臺(tái)，在超凈臺(tái)中，在15 mL 滅菌離心管中預(yù)先加入10 mL 新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細(xì)胞懸液加入該離心管中，常溫1 000 r/min 離心3 min，吸除上層的培養(yǎng)液。1 mL 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至5 mL，置于37 ℃、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 48 h 后換液，細(xì)胞融合接近80%時(shí)即可傳代。 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。 傳代2次后，用胰酶消化，配制細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度。 主要使用儀器如表3 所示，主要試劑如表4 所示。

表3 主要使用儀器Table 3 Main used instruments

表4 主要試劑Table 4 Main reagents

1.4 細(xì)胞接種及培養(yǎng)

將制備的12 個(gè)樣品和1 個(gè)空白對(duì)照樣進(jìn)行消毒，取13 個(gè)樣本，在蒸餾水中超聲波清洗，干燥。 放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外照射消毒30 min。 置于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒3 次，無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS 緩沖液)沖洗3 次，再用無血清培養(yǎng)基沖洗2 次。 將細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度調(diào)整為3×104個(gè)/cm2，使用6 孔板作為培養(yǎng)板，每孔滴入1 mL 細(xì)胞懸液與試驗(yàn)樣品共培養(yǎng)，使細(xì)胞懸液與試樣充分接觸，以促進(jìn)成骨細(xì)胞爬附在材料表面，共13 個(gè)樣本，培養(yǎng)72 h 后取出；取出后，采用BL911A 電鏡專用固定液固定，放置于4 ℃冰箱中保存。

1.5 樣品的表征

使用Rigaku Smartlab 型X 射線衍射分析儀(Cu靶，2θ＝10° ～80°)對(duì)樣品進(jìn)行物相檢測。 用ZEISS GeminiSEM 300 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察膜層表面的微觀形貌。 使用AlphaStep-30 臺(tái)階儀對(duì)樣品進(jìn)行粗糙度測試。 采用OneAttension 接觸角測量儀對(duì)樣品進(jìn)行接觸角測試。 用SEM 觀察細(xì)胞的生長狀況，測試結(jié)果采用STDEVA 函數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

具有合理結(jié)構(gòu)和尺寸的微納多級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于骨整合具有更好的促進(jìn)作用。 有文獻(xiàn)報(bào)道，微米結(jié)構(gòu)上的納米結(jié)構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、蛋白質(zhì)合成、堿性磷酸酶合成、膠原蛋白的分泌及胞外基質(zhì)礦化等產(chǎn)生協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)[14]。

2.1 物相組成分析

為了研究膜層的性能及各組樣品的物相組成，對(duì)各組樣品進(jìn)行XRD 測試，測試結(jié)果如圖1 所示。 由圖1 可知，大孔組的物相組成只有Ti，未見其他物相，分析可能氧化物以非晶的形式存在，且Ti 峰強(qiáng)度明顯弱于細(xì)孔組，其原因可能是因?yàn)槟邮杷蓪舆^厚從而導(dǎo)致Ti 峰衍射強(qiáng)度減弱。 在細(xì)孔組中，隨著NaOH 濃度的提高，9 g/L NaOH 情況下的細(xì)孔組的物相比6 g/L NaOH 情況下的多出TiO2(銳鈦礦)相，其余物相無明顯變化，物相組成都為Ti 和TiO2(金紅石)相。 9 g/L NaOH 情況下的細(xì)孔組的金紅石衍射峰比6 g/L NaOH高，說明9 g/L NaOH 情況下的細(xì)孔組含有更多的金紅石。 金紅石為銳鈦礦經(jīng)高溫反復(fù)重熔形成的一種具有穩(wěn)定性質(zhì)的物質(zhì)，有研究表明膜層中的金紅石可以提升膜層的耐磨性和顯微硬度[15]，植入體在服役期間，會(huì)與人骨存在相對(duì)運(yùn)動(dòng)，因此對(duì)于植入體的耐磨性也有一定的要求。 植入體在服役期間，若是耐磨性較差則會(huì)在接觸處產(chǎn)生磨屑，磨屑過多會(huì)產(chǎn)生炎癥，甚至導(dǎo)致植入手術(shù)的失敗，加重患者的痛苦和負(fù)擔(dān)[16]。 根據(jù)圖1 分析，大孔組中峰形為“饅頭峰”說明氧化物結(jié)晶度較差，膜層中未見TiO2(金紅石)相，膜層整體質(zhì)量較差。 李寧波[17]研究發(fā)現(xiàn)，由于銳鈦礦和金紅石相TiO2的晶格常數(shù)與HA 非常相近，所以鈦的氧化層更易于誘導(dǎo)HA 的沉積，提高體外生物活性。

圖1 不同參數(shù)條件下制備的樣品的XRD 譜Fig.1 XRD spectra of samples prepared under different parameters

2.2 表面微觀形貌分析

使用SEM 觀察各組經(jīng)微弧氧化后樣品的表面形貌，其結(jié)果如圖2 所示。 大孔平整組孔洞的大小和分布都較均勻，孔洞大小在5～6 μm。 大孔粗糙組出現(xiàn)了很多氣泡狀的凸起物，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是微弧氧化時(shí)放電通道生成了大量氣體，隨著電流密度和占空比的增大，微弧氧化強(qiáng)度上升，因此形成了這類表面形貌。 大孔粗糙組表面孔洞大小和分布較均勻，孔洞大小在4 ～5 μm，大孔組由于電解液成分中主鹽較多，導(dǎo)致電解液的電導(dǎo)率較高，進(jìn)一步加強(qiáng)了微弧氧化強(qiáng)度。細(xì)孔平整組表面分布了許多細(xì)小微孔，表面存在少許顆粒狀凸起，微孔大小在300～500 nm 范圍內(nèi)，細(xì)孔粗糙組表面分布了許多細(xì)小微孔，表面存在大量顆粒狀凸起，顆粒與顆粒之間會(huì)形成1～2 μm 的溝壑，微孔大小在300～700 nm 范圍內(nèi)，形成原因是細(xì)孔粗糙組對(duì)比細(xì)孔平整組電解液濃度上升，電解液電導(dǎo)率提升，電流密度增大，兩方面原因協(xié)同提升了微弧氧化的強(qiáng)度，放電通道附近會(huì)形成高溫氧化物堆積，對(duì)比大孔組由于電解液中無主鹽成分，降低了起弧電壓，也降低了微弧氧化反應(yīng)時(shí)的溫度，導(dǎo)致表面形貌對(duì)比大孔組要致密和平整，觀察圖2d發(fā)現(xiàn)細(xì)孔粗糙組顯然具有微納二極結(jié)構(gòu)的特性。

圖2 不同參數(shù)條件下制備的樣品的表面形貌Fig.2 Surface morphology of samples prepared under different parameters

2.3 粗糙度分析

材料的粗糙度是影響材料生物相容性的重要指標(biāo)，材料表面形貌對(duì)細(xì)胞的影響機(jī)理比較復(fù)雜，普遍認(rèn)為多孔的、粗糙的、有紋理的表面形貌能夠更好地刺激細(xì)胞的黏附和生長[17]。

用臺(tái)階儀對(duì)各試驗(yàn)組平行樣品測試3 次粗糙度，取平均值為各組測試結(jié)果，測試結(jié)果如圖3 所示。 大孔平整組的粗糙度為3.458 3 μm，大孔粗糙組的粗糙度為4.918 8 μm，細(xì)孔平整組的粗糙度為0.570 8 μm，細(xì)孔粗糙組的粗糙度為1.140 1 μm。 由于大孔組的電解液的成分與細(xì)孔組存在差異，大孔組的起弧電壓高，微弧氧化程度劇烈，反應(yīng)時(shí)溫度較高，產(chǎn)生了較多的熔融物，從而導(dǎo)致膜層孔洞較大、較多，表面存在大量堆積物，裂紋也更加明顯。 而細(xì)孔組由于是單NaOH 電解液體系，其起弧電壓較低，致使細(xì)孔組的表面形貌較為平整、致密，細(xì)孔粗糙組由于提升了NaOH 電解液的濃度，導(dǎo)致電解液的電導(dǎo)率提升，從而加劇了微弧氧化反應(yīng)。 可以看出微納二級(jí)結(jié)構(gòu)及納米結(jié)構(gòu)對(duì)比微米級(jí)結(jié)構(gòu)具有更低的粗糙度，結(jié)合圖2 也可以發(fā)現(xiàn)大孔組對(duì)比細(xì)孔組表面更為粗糙，與粗糙度測量結(jié)果一致。

圖3 不同參數(shù)條件下制備的樣品的粗糙度Fig.3 Roughness of samples prepared under different parameters

2.4 接觸角分析

親水性是決定細(xì)胞能否在材料表面進(jìn)行附著的重要因素，從細(xì)胞的黏附機(jī)理上來說，細(xì)胞黏附是細(xì)胞和生物材料接觸的最初階段，會(huì)影響細(xì)胞后續(xù)的增值、分化、遷移、凋亡。 通常來說細(xì)胞與基體的黏附不是直接進(jìn)行的，而是生物材料先吸收一層水分子，在材料表面形成水層，然后在表面水層之上形成吸附蛋白，最后細(xì)胞與吸附蛋白結(jié)合，黏附在材料表面，因此表面水層會(huì)影響吸附蛋白的性質(zhì)。

對(duì)各試驗(yàn)組平行樣品進(jìn)行5 次接觸角測試，取平均值為各組測試結(jié)果，測試結(jié)果如圖4 所示。 大孔組接觸角為12°～21°，觀察圖2 發(fā)現(xiàn)，大孔組中所存在的孔洞都為微米級(jí)，并且表面孔洞分布密集，大而密的孔洞表面結(jié)構(gòu)促使大孔組具有很好的親水性。 細(xì)孔組接觸角為56°～65°，由于孔洞由微米級(jí)轉(zhuǎn)換成微納米級(jí)，細(xì)孔組表面形貌變得致密，導(dǎo)致接觸角上升，親水性降低，但仍然小于基體的接觸角73°且小于90°，仍具有親水性。 親水性并不是影響材料生物相容性的唯一因素，親水性主要影響細(xì)胞在材料表面的初期黏附，因此只要判定材料親水，能夠完成細(xì)胞的初期黏附即可。

圖4 不同參數(shù)條件下制備的樣品的接觸角測試結(jié)果Fig.4 Test results of contact angles of samples prepared under different parameters

2.5 細(xì)胞黏附結(jié)果分析

進(jìn)行生物細(xì)胞試驗(yàn)后，將所有經(jīng)電鏡固定液固定后的樣品噴金，通過SEM 觀察細(xì)胞生長結(jié)果，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同參數(shù)條件下制備的樣品表面的細(xì)胞生長情況Fig.5 Cell growth conditions on the surface of samples prepared under different parameters

如圖5a 所示，在空白對(duì)照組表面未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增值痕跡，表明在光滑的純鈦表面，細(xì)胞的黏附能力較弱；觀察圖5b，大孔平整組形成了絲狀偽足，但細(xì)胞在材料表面的鋪展不夠充分，黏附面積較小，表面可見少量細(xì)胞分泌物和細(xì)胞絨毛，說明大孔平整組具有一定的細(xì)胞活性；觀察圖5c，大孔粗糙組表面形成的絲狀偽足明顯減少，在表面可見微量的細(xì)胞分泌物和細(xì)胞絨毛，對(duì)比大孔平整組細(xì)胞的黏附性顯著降低；結(jié)合大孔平整組和大孔粗糙組的細(xì)胞生長狀態(tài)，分析發(fā)現(xiàn)所有的偽足都是向著同一方向生長的，說明較為粗糙的表面形貌在一定程度上能夠引導(dǎo)細(xì)胞的遷移；觀察圖5d，細(xì)孔平整組表面黏附了大量的細(xì)胞，板狀偽足鋪滿了整個(gè)材料表面，但是偽足方向雜亂無章沒有規(guī)律可循；觀察圖5e，細(xì)孔粗糙組表面同樣黏附了大量的細(xì)胞，材料表面可見豐富的絲狀偽足，在高倍掃描電鏡下清晰可見細(xì)胞絨毛和細(xì)胞分泌物，同時(shí)還可以觀察到偽足的生長方向基本一致，這一現(xiàn)象與大孔組中的偽足的生長方向相同。

結(jié)合所有材料的細(xì)胞黏附情況，分析發(fā)現(xiàn)表面形貌這一物理特性對(duì)細(xì)胞的黏附性能存在較大的影響，觀察圖5b、5c、5e 中絲狀偽足的生長方向基本為同一方向，這一現(xiàn)象說明當(dāng)表面粗糙度較大時(shí)，對(duì)細(xì)胞的遷移方向具有引導(dǎo)作用，觀察圖5d、5e 表面細(xì)胞的黏附數(shù)量顯著增加，這一現(xiàn)象說明當(dāng)表面粗糙度較小時(shí)，材料的細(xì)胞黏附能力可以得到增強(qiáng)。

研究結(jié)果顯示，通過微弧氧化構(gòu)建的微納二級(jí)結(jié)構(gòu)同樣具有提升細(xì)胞黏附能力的作用，趙昕[18]研究發(fā)現(xiàn)粗糙度在0.5 ～1.0 μm 范圍內(nèi)的鈦片具有較好的生物相容性，與本工作中樣品表面粗糙度為0.571 μm 和1.14 μm 時(shí)細(xì)胞的黏附面積最大的結(jié)果具有一致性。粗糙度是影響細(xì)胞黏附性能的主要因素，較小的粗糙度是由納米結(jié)構(gòu)增多而引起的，粗糙度為1.14 μm 時(shí)細(xì)胞的黏附面積最大，更進(jìn)一步說明此微結(jié)構(gòu)為微納二級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

(1)采用微弧氧化技術(shù)通過不同的電解液和電參數(shù)，以純鈦為基材制備出了4 種具有不同微結(jié)構(gòu)的氧化鈦涂層。 其中采用磷酸鹽體系電解液所制備的氧化鈦涂層在較小的電流密度和較大的電流密度下表面孔洞都較大，表面形貌粗糙；采用NaOH 體系電解液所制備的氧化鈦涂層在較高電流密度下涂層表面依舊較為平整，表面粗糙度較低，涂層中含有較高含量的金紅石相。

(2)細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，4 種樣品表面的不同微結(jié)構(gòu)使其呈現(xiàn)不同的性能，其中大孔平整組表面的絲狀偽足和細(xì)胞分泌物較多，顯示出較好的生物活性；大孔粗糙組表面的絲狀偽足和細(xì)胞分泌物減少，生物活性降低；細(xì)孔平整組表面和細(xì)孔粗糙組表面細(xì)胞的黏附面積明顯增大，呈現(xiàn)出更好的生物活性，具有微納二級(jí)結(jié)構(gòu)的樣品同時(shí)兼具這2 種優(yōu)勢。

(3)使用微弧氧化所制備的微納二級(jí)結(jié)構(gòu)與微加工所制備的微納二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一致性，對(duì)純鈦的生物相容性有較為明顯的提升，在未來骨替品行業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。