新生兒高膽紅素血癥與UGT1A1基因突變的關系研究

馮芝 王程鋒 賀權(quán) 豆鵬產(chǎn)

新生兒高膽紅素血癥又稱新生兒黃疸，是新生兒期最常見的表現(xiàn)之一［1］。新生兒高膽紅素血癥又可以分為生理性黃疸和病理性黃疸［2］。一般來說，生理性黃疸情況良好，在足月嬰兒出生后2～3 d 出現(xiàn)，4～5 d 達到高峰，5～7 d 消退，最長延遲2周，血清總膽紅素最高不超過12.9 mg/dL，這種情況不需要特殊治療；病理性黃疸發(fā)生在出生后24 h內(nèi)，持續(xù)時間長，足月兒超過2 周，早產(chǎn)兒超過4 周，血清總膽紅素值相對較高，超過12.9 mg/dL，血清共軛膽紅素值超過2 mg/dL［3］。隨著分子生物學的快速發(fā)展，目前對于新生兒高膽紅素血癥研究的重點轉(zhuǎn)移到與膽紅素代謝有關的酶的基因突變方面。有研究顯示，二磷酸尿苷葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT1A1）基因啟動子和編碼區(qū)的突變可導致UGT1A1酶活性降低或消失，從而阻礙游離膽紅素的葡萄糖醛酸化，降低膽紅素代謝，使血清游離膽紅素水平升高，導致新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生［4］。有專家認為，UGT1A1基因的突變與新生兒高膽紅素血癥有關［5］。本研究旨在分析新生兒高膽紅素血癥與UGT1A1基因突變的關系，以期為臨床治療新生兒高膽紅素血癥提供幫助，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年1 月至2022 年1 月古藺縣人民醫(yī)院收治的新生兒高膽紅素血癥患兒100 例為觀察組，其中男80 例，女20 例；孕周為37～42 周，平均孕周為（39.6±2.2）周；出生體重為3 200～3 456 g，平均體重為（3 328.6±122.2）g，病程為1～6 d，平均病程（3.5±1.6）d；選擇同期體檢健康新生兒50 名為對照組，其中男38 名，女12 名；孕周為37～42 周，平均孕周為（39.1±2.2）周；出生體重為3 200～3 457 g，平均體重為（3 327.6±122.1）g。高膽紅素血癥符合《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識》［6］的診斷標準。觀察組納入標準：①均為胎齡≥37 周；②黃疸發(fā)生在出生后2 周內(nèi)；③血清膽紅素升高且以游離膽紅素升高為主。觀察組排除標準：①之前經(jīng)過特殊治療；②低體重、營養(yǎng)不良患兒；③先天性消化道畸形。患兒監(jiān)護人已簽署知情同意書，本研究經(jīng)院醫(yī)學倫理委員會審核、通過。

1.2 方法

觀察組常規(guī)給予雙面藍光箱進行間斷藍光照射，同時給予苯巴比妥鈉（上海信誼藥廠有限公司）5 mg/kg·d 連續(xù)喂服。在必要情況下給予堿化尿液、人血白蛋白和丙種球蛋白靜脈滴注。

1.3 檢測方法

1.3.1 血樣采集和DNA 提取

采集2 mL 靜脈血，用乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝，用Invitrogen-血液DNA 提取試劑盒-賽默飛提取DNA 并保存在-20℃待檢。

1.3.2 基因檢測

聚合酶鏈反應（PCR）引物根據(jù)文獻數(shù)據(jù)設計。引物序列，上游引物：5'-GTC ACG TGACAC AGT CAA AC-3'。下游引物：5'-GTC CCACTC CAA TAC ACA C-3'。擴增片段為啟動子區(qū)域的TATA 盒和整個外顯子1，片段長度為987 bp（引物序列由上海生物工程服務有限公司合成）。反應體系：25 μL 2xEs Taq MasterMix（染料），上游和下游引物各2 μL，模板DNA 200 ng，去離子水50 μL。反應過程如下：在LD-PCR1 熒光PCR 儀器上94℃預變性2 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35 次，72℃再延伸2 min。2%瓊脂糖凝膠電泳用于確定PCR 產(chǎn)物是否為擴增的目的基因片段。以100 bp LadderDNA Marker（康為世紀公司）作為片段大小參照物。每次取5 μL PCR 產(chǎn)物在120 V 下電泳30 min。用紫外凝膠顯像系統(tǒng)對凝膠進行顯像和成像。合格PCR 產(chǎn)物在1～2天內(nèi)被送往華大基因技術有限公司進行基因檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，應用Shapiro-Wilk 進行正態(tài)性檢驗，對符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher 精確概率計算。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

觀察組的血清總膽紅素顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較［n（%），（）］Table 1 Comparison of general information between the two groups［n（%），（）］

表1 兩組一般資料比較［n（%），（）］Table 1 Comparison of general information between the two groups［n（%），（）］

2.2 UGT1A1 基因檢測結(jié)果

在UGT1A1基因啟動子區(qū)共發(fā)現(xiàn)TATA 錯義突變47 例，觀察組35 例，對照組12 例，觀察組的TATA（TA）6/7 錯義突變基因分布、基因頻率均高于對照組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。在UGT1A1基因第1 外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)P229Q 錯義突變8 例，其中觀察組7 例，對照組1 例，觀察組的P229Q（TA）6/7 錯義突變基因分布、基因頻率均高于對照組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。在UGT1A1基因1 外顯子區(qū)共發(fā)現(xiàn)G71R 錯義突變33 例，其中觀察組18 例，對照組15 例，觀察組的G71R（TA）6/7 錯義突變基因分布、基因頻率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表2 兩組UGT1A1 TATA 基因型分布以及等位基因頻率比較［n（%）］Table 2 Comparison of UGT1A1 TATA box genotype distribution and allele frequency between the two groups［n（%）］

表3 兩組UGT1A1 P229Q 基因型分布以及等位基因頻率比較［n（%）］Table 3 Comparison of UGT1A1 P229Q genotype distribution and allele frequency between the two groups［n（%）］

表4 兩組UGT1A1 G71R 基因型分布以及等位基因頻率比較［n（%）］Table 4 Comparison of UGT1A1 G71R genotype distribution and allele frequency between the two groups［n（%）］

2.3 影響新生兒高膽紅素血癥的多因素分析

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，G71R 錯義突變是新生兒高膽紅素血癥的獨立危險因素（OR=5.376，P＜0.05）。見表5、6。

表5 影響新生兒高膽紅素血癥的變量賦值Table 5 Assignment of variables affecting neonatal hyperbilirubinemia

表6 影響新生兒高膽紅素血癥的多因素Logistic 回歸分析Table 6 Logistic regression analysis of multiple factors affecting neonatal hyperbilirubinemia

3 討論

高膽紅素血癥是指膽紅素代謝和排泄的正常途徑發(fā)生改變，導致血清膽紅素值超過正常范圍，并導致皮膚、鞏膜或其他器官呈黃色的病癥，常見于早產(chǎn)兒［7］。由于新生兒的膽管尚未發(fā)育完全，無法及時排出游離膽紅素，導致膽紅素在體內(nèi)過度積聚，進而引起黃疸。體外研究表明，膽紅素是UGT1A1酶的結(jié)合底物，而UGT1A1酶是肝臟中參與膽紅素代謝的唯一酶［8］。因此臨床懷疑除了已知的黃疸原因外，不明原因的新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生與UGT1A1基因的突變有關［9］。

全世界范圍內(nèi)距今已發(fā)現(xiàn)300 多種UGT1A1的突變類型，而膽紅素病癥的突變方式主要包括插入突變、錯義突變、缺失突變?nèi)N［10］。本研究結(jié)果顯示，觀察組的G71R（TA）6/7 錯義突變基因分布、基因頻率均高于對照組，提示G71R（TA）6/7 突變基因和新生兒高膽紅素血癥有關。分析其原因在于，有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽（OATPs）是一組在G71R 生物膜上發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)運蛋白，對生物體內(nèi)各種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的攝取和清除非常重要［11］。而新生兒高膽紅素血癥的嚴重程度取決于G71R基因的不同突變對蛋白質(zhì)功能的影響。突變的G71R基因的翻譯產(chǎn)物因為其氨基酸序列與正常G71R 不同，從而失去了正常G71R 的功能，導致原有基因不能折疊產(chǎn)生正常G71R 的三維結(jié)構(gòu)。而G71R（TA）6/7 錯義突變引起了單氨基酸替換，導致原有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，從而影響蛋白質(zhì)或酶的生物功能。本研究結(jié)果與Shibazaki等［12］的研究結(jié)果一致。

本研究進一步多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，G71R 錯義突變是新生兒高膽紅素血癥的獨立危險因素。分析其原因在于，由于大腦的特殊結(jié)構(gòu)，血腦屏障在很大程度上決定了大腦中的內(nèi)源性物質(zhì)的濃度［13］。G71R 是血腦屏障的一個重要轉(zhuǎn)運體，影響著膽紅素進入大腦的程度，G71R在原代腦微血管內(nèi)皮細胞上的表達證實G71R 是一種重要的轉(zhuǎn)運體，其作為一種轉(zhuǎn)運體存在于肝臟中，參與膽紅素的代謝［14］。肝細胞的基底膜含有許多轉(zhuǎn)運體，促進膽鹽、一些可溶性有機脂質(zhì)底物的吸收，包括膽紅素等內(nèi)源性底物、藥物和外源性物質(zhì)。而人體的吸收主要靠Na+依賴性和非Na+依賴性轉(zhuǎn)運體，G71R基因是一種非Na 依賴性轉(zhuǎn)運體，對底物的親和力很廣，負責吸收未結(jié)合的膽鹽、膽紅素化合物、甲狀腺激素、中性粒細胞、大量的藥物和外源性物質(zhì)，對體內(nèi)膽紅素的代謝有重大影響。本研究結(jié)果符合Walker-Pizarro等［15］的研究。

綜上所述，新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生和G71R 錯義突變有關，UGT1A1G71R 錯義突變可能是該病發(fā)生的危險因素，UGT1A1G71R 錯義突變可能會提高新生兒高膽紅素血癥的發(fā)病幾率，該項研究可為臨床發(fā)生不明原因新生兒高膽紅素血癥提供檢測依據(jù)。