豬ECR1-like免疫黏附功能對PAMs捕獲GFP-E. coli的影響

張崢，凌小雅，范闊海，孫娜，孫盼盼，孫耀貴，李宏全，尹偉

豬ECR1-like免疫黏附功能對PAMs捕獲GFP-的影響

1中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，山西太谷 030801

【目的】探討豬紅細(xì)胞類Ⅰ型補(bǔ)體受體（erythrocyte complement receptor type 1-like, ECR1-like）免疫黏附功能是否能夠促進(jìn)豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages, PAMs）捕獲致敏基因工程菌（GFP-, GFP），以期闡釋豬紅細(xì)胞免疫的分子機(jī)理及紅細(xì)胞免疫在機(jī)體先天免疫中的作用?！痉椒ā坷昧魇郊?xì)胞術(shù)、菌落平板計(jì)數(shù)及RT-PCR技術(shù)檢測PAMs捕獲的GFP-的水平，分析豬ECR1-like免疫黏附對PAMs捕獲GFP-的影響；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測豬ECR1-like免疫黏附的致敏GFP-被PAMs移除后，豬紅細(xì)胞免疫黏附功能的變化及豬ECR1-like數(shù)量的變化?！窘Y(jié)果】流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)豬紅細(xì)胞黏附組較空白對照組中的PAMs平均熒光強(qiáng)度顯著提高（＜0.001），且PAMs陽性細(xì)胞率也顯著提高（＜0.05）；菌落涂板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞黏附組較空白對照組PAMs捕獲GFP-情況顯著增強(qiáng)（＜0.05）；RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞黏附組PAMs中GFP-的相對數(shù)量顯著高于空白對照組（＜0.01）；進(jìn)一步阻斷豬紅細(xì)胞表面的CR1-like，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)PAMs平均熒光強(qiáng)度降低至256 301.56±9 208.85（＜0.001），PAMs陽性細(xì)胞率降低至（88.32±0.92）%（＞0.05），菌落平板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)PAMs捕獲GFP-情況減弱為（136 666±8 818）CFU/mL（＜0.05），RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PAMs中GFP-的相對數(shù)量顯著減少（＜0.01）；利用細(xì)胞流動循環(huán)互作技術(shù)發(fā)現(xiàn)：豬紅細(xì)胞免疫黏附致敏GFP-的平均熒光強(qiáng)度由循環(huán)前2 892.18±47.76降至2 407.43±141.78（＜0.05），陽性細(xì)胞率由循環(huán)前（20.58±0.36）%降至（17.39±0.23）%（＜0.001），黏附水平顯著低于循環(huán)前，與此同時(shí)，間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示：試驗(yàn)組循環(huán)后豬ECR1-like平均熒光強(qiáng)度由循環(huán)前344.33±37.92降低至291.56±11.99（＜0.05），陽性細(xì)胞率由（30.20±1.24）%減少至（28.27±0.64）%（＜0.05）?！窘Y(jié)論】豬ECR1-like通過免疫黏附功能促進(jìn)了PAMs對致敏GFP-的捕獲。PAMs移除豬紅細(xì)胞表面黏附的致敏GFP-后，豬紅細(xì)胞的活性CR1-like減少，免疫黏附功能下降。

豬；紅細(xì)胞；豬肺泡巨噬細(xì)胞；類Ⅰ型補(bǔ)體受體；免疫黏附

0 引言

【研究意義】自1981年SIEGEL等首次提出“紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)”概念，并發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞具有多種免疫功能[1]。紅細(xì)胞表面存在I型補(bǔ)體受體（erythrocyte complement receptor type 1, ECR1），且在ECR1的介導(dǎo)下，能夠黏附經(jīng)補(bǔ)體活性成分C3b致敏的病原體或免疫復(fù)合物（immune complex, IC），通過血液循環(huán)至肝臟、脾臟，最終由吞噬細(xì)胞清除[2]。紅細(xì)胞類I型補(bǔ)體受體（erythrocyte complement receptor I-like，ECR1-like）是豬紅細(xì)胞膜表面的天然免疫活性分子，其被證實(shí)是C3b調(diào)理免疫復(fù)合物的免疫黏附受體[3-5]。研究表明，豬紅細(xì)胞能夠通過CR1-like介導(dǎo)的免疫黏附功能，從而結(jié)合經(jīng)血清致敏的大腸桿菌[6-7]。ECR1-like在清除IC的過程中同樣發(fā)揮著重要作用，因此，深入探究ECR1-like介導(dǎo)清除IC的過程及分子機(jī)制對于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫平衡及機(jī)體健康具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】紅細(xì)胞CR1的免疫黏附功能在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。研究表明，紅細(xì)胞免疫黏附功能與細(xì)菌[8-10]、病毒[11-13]、寄生蟲[14]等病原體的清除具有相關(guān)性，且紅細(xì)胞表面的CR1分子在機(jī)體清除內(nèi)源性IC的過程中同樣發(fā)揮著重要作用[15-18]。REINAGEL等[19]將補(bǔ)體致敏雜聚物（heterochain polymer, HP）和噬菌體φX174作為模式IC進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)人紅細(xì)胞結(jié)合IC后與小鼠巨噬細(xì)胞孵育，在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)能檢測到IC的存在，表明紅細(xì)胞結(jié)合的IC可由小鼠巨噬細(xì)胞吞噬內(nèi)化，同時(shí)伴隨有紅細(xì)胞CR1的損失，通過ELISA檢測到CR1出現(xiàn)在巨噬細(xì)胞內(nèi)部，CR1可能同IC一起被巨噬細(xì)胞吞噬內(nèi)化。HEPBURN等[20]建立了單層巨噬細(xì)胞的平行板流動系統(tǒng)用于檢測體內(nèi)血流剪切力條件下IC從紅細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)c受體（Fc receptor, FcR）和補(bǔ)體受體（complement receptor, CR）的阻斷抑制了IC向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其中，F(xiàn)cγRIIa的阻斷影響最大，F(xiàn)cR和CR在巨噬細(xì)胞移除紅細(xì)胞表面IC的過程中發(fā)揮協(xié)同作用，共阻斷抑制作用最明顯。本課題組前期經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)豬紅細(xì)胞上存在CR1-like[3]。且證明其是通過EPB41分子錨合在紅細(xì)胞膜表面[21-22]，在體外條件下，經(jīng)酵母雜交體系，研究證明了豬紅細(xì)胞CR1-like活性片段能夠與C3b相互結(jié)合[5]。PAMs能通過CR1-like競爭性結(jié)合豬紅細(xì)胞表面黏附的GFP-，且豬紅細(xì)胞形態(tài)不受影響。但是，豬ECR1-like水平顯著降低[23-24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)通過模擬血液循環(huán)的自然生理狀態(tài)，構(gòu)建豬紅細(xì)胞與PAMs動態(tài)互作循環(huán)系統(tǒng)，針對PAMs捕獲GFP-的量和循環(huán)前后的平均熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討ECR1-like介導(dǎo)PAMs移除表面GFP-過程中PAMs捕獲效率是否提高？豬紅細(xì)胞免疫黏附水平是否變化？等關(guān)鍵問題，深入探究紅細(xì)胞CR1清除IC的過程及分子機(jī)制，以期為調(diào)控紅細(xì)胞免疫應(yīng)用于動物臨床研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及菌株

試驗(yàn)于2020年10月至2022年5月進(jìn)行。試驗(yàn)地點(diǎn)為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)所需健康40日齡長白仔豬，體重（20±2）kg，購自太谷縣冠農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司。表達(dá)綠色熒光蛋白的大腸桿菌（GFP-）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 試驗(yàn)試劑

鼠抗豬CR1-like McAb（IgG1亞型）為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備（專利：ZL201410308534.0）；Mouse IgG1 Isotype Control購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；羊抗小鼠IgG- CoraLite 488購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

RPMI-1640培養(yǎng)基，購自美國Gibico公司；DMSO、青鏈霉素混合液、多聚-L-賴氨酸（15—30萬）、Hank’s緩沖液，均購自索萊寶科技有限公司；胎牛血清，購自以色列Biolnd公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購自上海生工生物工程有限公司；豬外周血紅細(xì)胞分離液試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Trizol、SYBR Premix Ex Taq TM II均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 豬ECR1-like活性影響PAMs捕獲GFP-E.coli的檢測

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測PAMs陽性細(xì)胞率及平均熒光強(qiáng)度 參照文獻(xiàn)[25-27]的方法制備豬紅細(xì)胞懸液、豬血清和致敏GFP-懸液，構(gòu)建豬紅細(xì)胞與PAMs動態(tài)互作體系按文獻(xiàn)[28]方法操作。分4組進(jìn)行檢測，即空白對照組、紅細(xì)胞黏附組、ECR1-like阻斷組和同型對照組，分別記為A、B、C、D組。

A組：取4 mL致敏GFP-懸液與4 mL Hank’s緩沖液直接孵育，結(jié)束后加入8 mL Hank’s緩沖液，將致敏GFP-懸液置于流動相瓶中，按照文獻(xiàn)[27]方法使菌液循環(huán)流動，待充滿整個(gè)小室后開始計(jì)時(shí)，60 min后進(jìn)行后續(xù)檢測；B組：取Hank’s緩沖液80 μL與4 mL豬紅細(xì)胞懸液混勻于37 ℃孵育2 h，孵育結(jié)束后1 500 r/min，5 min離心兩次，后續(xù)方法同上；C組：取豬CR1-like McAb 80 μL與4 mL豬紅細(xì)胞懸液混勻于37 ℃孵育2 h，孵育結(jié)束后1 500 r/min，5 min離心兩次，后續(xù)方法同上；D組：以IgG1同型抗體替代C組的豬CR1-like McAb，其余操作同C組。

取上述各組循環(huán)后的PAMs載玻片，流式細(xì)胞儀檢測各組PAMs陽性細(xì)胞率及平均熒光強(qiáng)度。

1.3.2 菌落平板計(jì)數(shù)法檢測PAMs裂解液中GFP-數(shù)量 取上述4組循環(huán)后的PAMs載玻片，PBS洗滌3次，加1 mL 0.3%的TritonX-100裂解10 min。收集PAMs及裂解產(chǎn)物，稀釋100倍后均勻涂布15 μL于LB固體培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1Amp），37℃倒置培養(yǎng)16 h，計(jì)數(shù)各組GFP-的CFU。按式（1）分別計(jì)算各組PAMs捕獲GFP-的情況。

PAMs吞噬情況（CFU/mL）=

1.3.3 RT-PCR檢測PAMs中GFPmRNA相對表達(dá)量 取上述各組循環(huán)后的PAMs載玻片，PBS洗滌3次，加入1 mL Trizol，提取RNA，經(jīng)TaKaRa SYBR PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物的設(shè)計(jì)參考NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1），以GAPDH作內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測GFP-基因的變化。

表1 引物序列

1.4 PAMs移除致敏GFP-E.coli后豬紅細(xì)胞免疫黏附功能的檢測

1.4.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測豬紅細(xì)胞免疫黏附GFP-水平 分3組進(jìn)行檢測，即空白對照組、試驗(yàn)組、陰性對照組，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3組。

（Ⅰ）空白對照組：取未復(fù)蘇PAMs的空白潔凈載玻片，蓋上平行板流動小室，以黏附有致敏GFP-的豬紅細(xì)胞懸液16 mL為流動相，建立循環(huán)流動體系。啟動蠕動泵，待流動相充滿整個(gè)平行板流動小室后開始計(jì)時(shí)，60 min進(jìn)行后續(xù)檢測；（Ⅱ）試驗(yàn)組：取復(fù)蘇有PAMs的載玻片，蓋上平行板流動小室，以黏附有致敏GFP-的豬紅細(xì)胞懸液16 mL為流動相，其余操作同（Ⅰ）組；（Ⅲ）陰性對照組：取復(fù)蘇有PAMs的載玻片，蓋上平行板流動小室，以豬紅細(xì)胞懸液16 mL為流動相，其余操作同（Ⅰ）組。

取各組0 min時(shí)的流動相紅細(xì)胞懸液300 μL，取各組60 min時(shí)的流動相紅細(xì)胞，按照1.3的方法再次黏附致敏GFP-，用流式細(xì)胞儀檢測豬紅細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率，兩次樣的數(shù)值分別代表PAMs移除致敏GFP-前后豬紅細(xì)胞的免疫黏附功能。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測豬ECR1-like數(shù)量 試驗(yàn)分為6組，分別記為a、b、c、d、e、f組。

a組：取循環(huán)前的豬紅細(xì)胞懸液200 μL，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入0.5% BSA 200 μL重懸，于37℃孵育30 min，1 500 r/min、5 min離心洗滌2次，以200 μL Hank’s重懸。按1﹕50比例加入豬CR1-like McAb，37℃孵育1 h后，用Hank’s緩沖液1 500 r/min、5 min離心洗滌2次，以200 μL Hank’s重懸。再向其中加入2 μL羊抗小鼠IgG-CoraLite 488，37 ℃避光孵育1 h，間歇振蕩。孵育完畢，用Hank’s緩沖液1 500 r/min、5 min離心洗滌2次，重懸后用流式細(xì)胞儀檢測其平均熒光強(qiáng)度。

b組：取1.4.1中I組60 min后的豬紅細(xì)胞懸液200 μL，其余操作同a組。

c組：取1.4.1中Ⅱ組60 min后的豬紅細(xì)胞懸液200 μL，其余操作同a組。

d組：取1.4.1中III組60 min后的豬紅細(xì)胞懸液200 μL，其余操作同a組。

e組：取循環(huán)前的豬紅細(xì)胞懸液200 μL，以小鼠同型抗體IgG1代替CR1-like McAb進(jìn)行處理，其余操作同a組。

f組：取循環(huán)前的豬紅細(xì)胞懸液200 μL，Hank’s緩沖液代替抗體進(jìn)行處理，其余操作同a組。

2 結(jié)果

2.1 豬ECR1-like增強(qiáng)PAMs捕獲GFP-E.coli后的平均熒光強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率。

收集各組循環(huán)后的PAMs，用流式細(xì)胞儀分析PAMs陽性細(xì)胞率及平均熒光強(qiáng)度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖1，表2）。

各組平均熒光強(qiáng)度經(jīng)單因素方差分析可見：與A組相比，B組PAMs平均熒光強(qiáng)度極顯著增高（＜0.001），C組PAMs平均熒光強(qiáng)度較B組極顯著降低（＜0.001），D組PAMs平均熒光強(qiáng)度與B組相比無顯著差異（＞0.05）；各組陽性細(xì)胞率經(jīng)單因素方差分析可見：與A組相比，B組PAMs陽性細(xì)胞率顯著增高（＜0.05），C、D組PAMs陽性細(xì)胞率與B組相比均無顯著差異（＞0.05，圖2）。

2.2 豬ECR1-like增強(qiáng)PAMs捕獲GFP-E. coli的數(shù)量

收集各組循環(huán)后的PAMs載玻片，收集PAMs并裂解，涂布于LB固體培養(yǎng)基（含Amp），根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果計(jì)算得出各組PAMs捕獲致敏GFP-的情況（圖3，表3）。將計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析可見：與A組相比，B組PAMs在1 h內(nèi)對GFP-的捕獲數(shù)量顯著增多（＜0.05），C組PAMs捕獲GFP-較B組顯著減少（＜0.05），D組PAMs捕獲GFP-數(shù)與B組相比無顯著差異（＞0.05，圖4）。

表2 阻斷豬ECR1-like活性對PAMs陽性細(xì)胞率及平均熒光強(qiáng)度的影響

A為空白對照組；B為紅細(xì)胞黏附組；C為ECR1-like阻斷組；D為同型對照組。圖2—5同

圖2 PAMs陽性細(xì)胞率及平均熒光強(qiáng)度單因素方差分析

圖3 阻斷豬ECR1-like活性后PAMs捕獲GFP-E. coli的平板涂布情況

表3 阻斷豬ECR1-like活性對PAMs捕獲GFP-E. coli菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的影響

圖4 PAMs捕獲GFP-E. coli情況單因素方差分析

2.3 豬ECR1-like增強(qiáng)PAMs中GFP-E coliβ-D- galactosidase mRNA相對表達(dá)量

RT-PCR檢測大腸桿菌中mRNA相對表達(dá)量，從而反映GFP-的相對數(shù)量，進(jìn)行單因素方差分析。與A組相比，B組PAMs中GFP-的相對數(shù)量極顯著升高（＜0.01），與B組相比，C組PAMs中GFP-的相對數(shù)量極顯著降低（＜0.01），D組中GFP-的相對數(shù)量無顯著變化（＞0.05，圖5）。

圖5 PAMs捕獲GFP-E coli相對數(shù)量單因素方差分析

2.4 PAMs移除致敏GFP-E. coli后豬紅細(xì)胞免疫黏附功能下降

流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組循環(huán)前后豬紅細(xì)胞的免疫黏附GFP-的功能（圖6），以豬紅細(xì)胞循環(huán)前免疫黏附及循環(huán)后重新黏附GFP-的陽性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度作為評判（表4）。

將平均熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，Ⅱ組PAMs移除豬紅細(xì)胞表面致敏GFP-后免疫黏附平均熒光強(qiáng)度較循環(huán)前免疫黏附平均熒光值顯著降低（＜0.05）；Ⅰ、Ⅲ組循環(huán)前、后豬紅細(xì)胞免疫黏附平均熒光值無顯著變化（＞0.05，圖7）。

將陽性細(xì)胞率數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，Ⅱ組PAMs移除豬紅細(xì)胞表面致敏GFP-后豬紅細(xì)胞免疫黏附陽性細(xì)胞率較循環(huán)前豬紅細(xì)胞的免疫黏附陽性細(xì)胞率極顯著降低（＜0.001）；Ⅰ、Ⅲ組循環(huán)前、后豬紅細(xì)胞免疫黏附陽性細(xì)胞率無顯著變化（＞0.05，圖8）。

表4 PAMs移除致敏GFP-E. coli前后豬紅細(xì)胞免疫黏附陽性細(xì)胞率及平均熒光強(qiáng)度檢測

Ⅰ為空白對照組，Ⅱ?yàn)樵囼?yàn)組，Ⅲ為陰性對照組。圖7和8同

2.5 PAMs移除致敏GFP-E. coli后導(dǎo)致豬ECR1-like數(shù)量減少

細(xì)胞免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組處理后的豬ECR1-like的數(shù)量變化進(jìn)行檢測（圖9），以豬紅細(xì)胞陽性細(xì)胞率及平均熒光強(qiáng)度作為評判（表5），進(jìn)行單因素方差分析（圖10）。

b組與a組平均熒光強(qiáng)度相比無顯著差異（＞0.05），c組較a組平均熒光強(qiáng)度相比顯著降低（＜0.05），d組與a組相比無顯著差異（＞0.05）；e組極顯著低于a、b、c、d組的平均熒光強(qiáng)度（＜0.01），f組極顯著低于a、b、c、d、e組的平均熒光強(qiáng)度（＜0.01）。

b組與a組陽性細(xì)胞率相比無顯著差異（＞0.05），c組較a組陽性細(xì)胞率相比顯著降低（＜0.05），d組與a組陽性細(xì)胞率相比無顯著差異（＞0.05）；e組極顯著低于a、b、c、d組的陽性細(xì)胞率（＜0.01），f組為空白對照，無陽性細(xì)胞。

圖7 PAMs移除致敏GFP-E. coli前后豬紅細(xì)胞免疫黏附水平（平均熒光強(qiáng)度）的比較

圖8 PAMs移除致敏GFP-E. coli前后豬紅細(xì)胞免疫黏附水平（陽性細(xì)胞率）的比較

表5 PAMs移除致敏GFP-E. coli前后豬ECR1-like陽性細(xì)胞率及平均熒光強(qiáng)度檢測

3 討論

3.1 豬ECR1-like促進(jìn)PAMs捕獲GFP-E. coli

本試驗(yàn)以致敏GFP-作為模式IC觀察豬ECR1-like免疫黏附在PAMs清除IC過程中的作用，發(fā)現(xiàn)豬ECR1-like免疫黏附能夠促進(jìn)PAMs對致敏GFP-的捕獲。試驗(yàn)運(yùn)用3種不同技術(shù)對PAMs捕獲GFP-的量進(jìn)行了檢測，首先，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了PAMs的平均熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率，平均熒光強(qiáng)度越高，表明PAMs捕獲的GFP-越多，結(jié)果顯示，在紅細(xì)胞介入的試驗(yàn)組中PAMs平均熒光強(qiáng)度顯著高于沒有紅細(xì)胞介入的等量的單純的GFP-空白對照組，表明紅細(xì)胞在該體系中能夠促進(jìn)PAMs對GFP-的捕獲，進(jìn)而預(yù)先以CR1-like單抗阻斷紅細(xì)胞表面的CR1-like位點(diǎn)，再將處理過的紅細(xì)胞以上述方法操作試驗(yàn)，豬紅細(xì)胞對PAMs捕獲GFP-的促進(jìn)作用減弱，與試驗(yàn)組相比PAMs平均熒光強(qiáng)度顯著降低，這表明豬紅細(xì)胞能夠促進(jìn)PAMs對GFP-的清除，發(fā)揮功能的分子基礎(chǔ)與CR1-like相關(guān)。收集各組試驗(yàn)后的PAMs裂解后進(jìn)行菌落涂板計(jì)數(shù)能夠直觀地評估PAMs捕獲GFP-的情況，將計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)組比空白對照組細(xì)菌數(shù)顯著增多，ECR1-like阻斷組比試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)顯著減少，與空白對照組細(xì)菌數(shù)無差異，這樣的趨勢與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果一致，并展現(xiàn)了ECR1-like在PAMs清除GFP-過程中的關(guān)鍵作用。之后，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對PAMs捕獲GFP-的情況進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)分析得到了和前兩種技術(shù)結(jié)果相同的趨勢。而且，ECR1-like的阻斷組除了阻斷對照作用，還能夠作為無免疫黏附功能的粒子介入的陰性對照，即使豬紅細(xì)胞喪失了免疫黏附功能，又能保持和豬紅細(xì)胞相同的細(xì)胞特性，試驗(yàn)對照更加完善，更加提高了試驗(yàn)結(jié)果的客觀性與準(zhǔn)確性。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，CR1-like是豬紅細(xì)胞免疫黏附重要的分子基礎(chǔ)，CR1-like單抗對豬紅細(xì)胞免疫黏附具有阻斷作用[29]。結(jié)合本試驗(yàn)3種技術(shù)得到的結(jié)果分析得出：豬紅細(xì)胞免疫黏附能夠促進(jìn)PAMs對致敏GFP-的吞噬清除，CR1-like是發(fā)揮促進(jìn)功能的分子基礎(chǔ)。也就是說，豬ECR1-like免疫黏附在吞噬細(xì)胞清除IC的過程中起到了正面的、積極的促進(jìn)作用。

a組為正常對照組，b組為Ⅰ處理組，c組為Ⅱ處理組，d組為Ⅲ處理組，e組為同型對照組，f組為空白細(xì)胞組，圖10同

圖10 PAMs移除致敏GFP-E. coli后豬ECR1-like數(shù)量的比較

這與LI等的研究結(jié)果一致，LI等[9, 29]以CR1＋轉(zhuǎn)基因小鼠紅細(xì)胞和野生型小鼠紅細(xì)胞為研究對象對小鼠清除肺炎鏈球菌的效率進(jìn)行研究，將等量的FITC標(biāo)記的肺炎鏈球菌與紅細(xì)胞孵育，并加入小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1中以評估肺炎鏈球菌向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 min后，與野生型小鼠紅細(xì)胞相比，從表達(dá)CR1的小鼠紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞的肺炎鏈球菌顯著增多。然而2019年BREKKE等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞CR1表達(dá)量越高，結(jié)合大腸桿菌數(shù)越多，人全血中白細(xì)胞（包括粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）的吞噬能力下降；在將CR1阻斷后，血漿游離菌的數(shù)量增多，白細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)，推測其原因可能是因?yàn)榇竽c桿菌的游離增加了白細(xì)胞對其的可得到性。本試驗(yàn)結(jié)果與此結(jié)果的差異可能因不同病原體而異，也可能是由于在吞噬系統(tǒng)中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等不同吞噬細(xì)胞的角色和職能有所差異。

由于1 h的時(shí)間限制，觀測到的豬紅細(xì)胞能夠促進(jìn)PAMs對紅細(xì)胞表面致敏的GFP-的捕獲結(jié)果可以解釋為兩種情況，一種是豬紅細(xì)胞的介入能夠加快肺泡巨噬細(xì)胞對GFP-的獲取，在單位時(shí)間內(nèi)PAMs對IC的捕獲增多；經(jīng)過對PAMs陽性細(xì)胞率的統(tǒng)計(jì)比較，也可能是紅細(xì)胞的介入增加了活性PAMs的數(shù)量，使得之前不能及時(shí)捕獲IC的PAMs能夠快速結(jié)合IC。另外，從顯微鏡記錄的過程來看，PAMs在1 h內(nèi)便可將部分GFP-吞噬清除，因此，試驗(yàn)條件需進(jìn)一步優(yōu)化以得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。豬紅細(xì)胞表面CR1-like被阻斷后，對PAMs捕獲IC的促進(jìn)功能未完全消失，可能在PAMs清除豬紅細(xì)胞表面IC的過程中除了CR1-like還有其他分子發(fā)揮作用。前期實(shí)驗(yàn)室的研究也證明了PAMs上存在有CR1-like，且PAMs表面CR1-like相對數(shù)量是豬紅細(xì)胞的4—5倍甚至更多[26]，IC從紅細(xì)胞到巨噬細(xì)胞上的轉(zhuǎn)移是PAMs上FcR和CR1-like共同作用的結(jié)果，兩個(gè)受體可產(chǎn)生協(xié)同作用[24]。從本試驗(yàn)的結(jié)果中也不難看出，PAMs對GFP-的黏附及吞噬功能強(qiáng)于豬紅細(xì)胞，CR1-like相對數(shù)量越多，免疫黏附功能越強(qiáng)，IC的轉(zhuǎn)移是CR1-like多的細(xì)胞從CR1-like少的細(xì)胞的競爭性結(jié)合，無論是阻斷PAMs表面的CR1-like或是阻斷豬紅細(xì)胞表面的CR1-like，PAMs移除GFP-的量都會減少，這表明CR1-like在其中起到了重要的承接作用，而且，CR1-like與CR1-like獨(dú)特承接介導(dǎo)的IC轉(zhuǎn)移可能更快。

3.2 PAMs移除致敏GFP-E. coli后豬紅細(xì)胞免疫黏附功能下降

本試驗(yàn)利用流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)初步探究了PAMs清除豬紅細(xì)胞表面IC后豬紅細(xì)胞免疫黏附功能的變化，將流動小室循環(huán)后的豬紅細(xì)胞再次進(jìn)行免疫黏附致敏GFP-，用流式細(xì)胞儀檢測其熒光強(qiáng)度，與循環(huán)前豬紅細(xì)胞免疫黏附致敏GFP-的熒光強(qiáng)度進(jìn)行T檢驗(yàn)得出，PAMs清除豬紅細(xì)胞表面GFP-后，豬紅細(xì)胞免疫黏附水平下降，而CR1-like是豬紅細(xì)胞發(fā)揮免疫黏附功能重要的分子基礎(chǔ)，其數(shù)量也呈下降趨勢。試驗(yàn)設(shè)置了兩個(gè)對照組，空白對照組為無PAMs組，循環(huán)體系中只有免疫黏附致敏GFP-的豬紅細(xì)胞，該組的設(shè)立避免了平行板流動小室物理循環(huán)體系對試驗(yàn)結(jié)果的干擾；陰性對照組為PAMs與豬紅細(xì)胞循環(huán)組，其中的紅細(xì)胞沒有黏附致敏GFP-，結(jié)果證明自然情況下正常豬紅細(xì)胞不會與PAMs互作而導(dǎo)致豬紅細(xì)胞免疫黏附水平及CR1-like的變化。結(jié)合以上分析說明，PAMs移除豬紅細(xì)胞表面GFP-這一生物學(xué)過程導(dǎo)致了豬紅細(xì)胞免疫黏附水平的下降和ECR1-like的減少。這與前人研究結(jié)果一致[30-32]。但是由于本試驗(yàn)CR1-like McAb的限制，并不能完全下結(jié)論為豬紅細(xì)胞表面CR1-like在此過程中丟失，也可能由于IC清除過程中對CR1-like位點(diǎn)的占用或CR1-like變構(gòu)所致，其具體機(jī)制還待進(jìn)一步試驗(yàn)探究。

4 結(jié)論

在體外流動狀態(tài)下，豬紅細(xì)胞類Ⅰ型補(bǔ)體受體通過其免疫黏附功能能夠促進(jìn)豬肺泡巨噬細(xì)胞對致敏GFP-的捕獲。豬肺泡巨噬細(xì)胞移除豬紅細(xì)胞表面黏附的致敏GFP-后，豬紅細(xì)胞的活性CR1-like減少，免疫黏附功能下降。

[1] SIEGEL I, TIAN L L, GLEICHER N. The red-cell immune system. The Lancet, 1981, 318(8246): 556-559.

[2] JAVA A, LISZEWSKI M K, HOURCADE D E, ZHANG F, ATKINSON J P. Role of complement receptor 1 (CR1; CD35) on epithelial cells: a model for understanding complement-mediated damage in the kidney. Molecular Immunology, 2015, 67(2 Pt B): 584-595.

[3] YIN W, CUI J Y, JIANG J B, ZHAO J X, FAN K H, SUN N, WANG Z W, SUN Y G, MA H L, LI H Q. The immune adherence receptor CR1-like existed on porcine erythrocytes membrane. Scientific Reports, 2015, 5: 13290.

[4] HOU Z, YIN W, HAO Z L, FAN K H, SUN N, SUN P P, LI H Q. Molecular simulation study on the interaction between porcine CR1-like and C3b. Molecules, 2023, 28(5): 2183.

[5] 孫雨晨, 賈瑞璞, 范闊海, 孫娜, 孫耀貴, 孫盼盼, 李宏全, 尹偉. 豬Ⅰ型補(bǔ)體受體與C3b活性片段相互結(jié)合的體外檢測. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 54(19): 4243-4254.

SUN Y C, JIA R P, FAN K H, SUN N, SUN Y G, SUN P P, LI H Q, YIN W. Detection of interaction between porcine type Ⅰ complement receptor and C3b active fragment. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(19): 4243-4254. (in Chinese)

[6] SUN Y G, YIN W, FAN X F, FAN K H, JIANG J B, LI H Q. The cytological observation of immune adherence of porcine erythrocyte. Cell Communication & Adhesion, 2012, 19(5/6): 79-84.

[7] YIN W, WANG C, FAN K H, SUN N, SUN Y G, LI H Q.observation: The GFP-.adhering to porcine erythrocytes can be removed by porcine alveolar macrophages. PeerJ, 2019, 7: e6439.

[8] BREKKE O L, CHRISTIANSEN D, KISSERLI A, FURE H, DAHL J A, DONVITO B, REVEIL B, LUDVIKSEN J K, TABARY T, MOLLNES T E, COHEN J H M. Key role of the number of complement receptor 1 on erythrocytes for binding ofto erythrocytes and for leukocyte phagocytosis and oxidative burst in human whole blood. Molecular Immunology, 2019, 114: 139-148.

[9] LI J, WANG J P, GHIRAN I, CERNY A, SZALAI A J, BRILES D E, FINBERG R W. Complement receptor 1 expression on mouse erythrocytes mediates clearance ofby immune adherence. Infection and Immunity, 2010, 78(7): 3129-3135.

[10] LI J, GLOVER D T, SZALAI A J, HOLLINGSHEAD S K, BRILES D E. PspA and PspC minimize immune adherence and transfer of pneumococci from erythrocytes to macrophages through their effects on complement activation. Infection and Immunity, 2007, 75(12): 5877-5885.

[11] SALAM K A, WANG R Y, GRANDINETTI T, DE GIORGI V, ALTER H J, ALLISON R D. Binding of free and immune complex-associated hepatitis C virus to erythrocytes is mediated by the complement system. Hepatology, 2018, 68(6): 2118-2129.

[12] WANG F S, CHU F L, JIN L, LI Y G, ZHANG Z, XU D, SHI M, WU H, MOULDS J M. Acquired but reversible loss of erythrocyte complement receptor 1 (CR1, CD35) and its longitudinal alteration in patients with severe acute respiratory syndrome. Clinical and Experimental Immunology, 2005, 139(1): 112-119.

[13] PEIRIS J S M, LAI S T, POON L L M, GUAN Y, YAM L Y C, LIM W, NICHOLLS J, YEE W K S, YAN W W, CHEUNG M T, CHENG V C C, CHAN K H, TSANG D N C, YUNG R W H, NG T K, YUEN K Y. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet, 2003, 361(9366): 1319-1325.

[14] DE OLIVEIRA R B, WANG J P, RAM S, GAZZINELLI R T, FINBERG R W, GOLENBOCK D T. Increased survival in B-cell- deficient mice during experimental cerebral malaria suggests a role for circulating immune complexes. mBio, 2014, 5(2): e00949-e00914.

[15] 陳紫晗, 孫琳琳, 張藝璇, 閆軍浩. β-淀粉樣蛋白清除障礙在阿爾茲海默癥發(fā)病中的作用. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2019, 50(2): 149-152.

CHEN Z H, SUN L L, ZHANG Y X, YAN J H. The roles of amyloid β-protein clearance impairment in the Alzheimer’s disease. Progress in Physiological Sciences, 2019, 50(2): 149-152. (in Chinese)

[16] SAWADA T, FUJIMORI D, YAMAMOTO Y. Systemic lupus erythematosus and immunodeficiency. Immunological Medicine, 2019, 42(1): 1-9.

[17] BRUBAKER W D, CRANE A, JOHANSSON J U, YEN K, GARFINKEL K, MASTROENI D, ASOK P, BRADT B, SABBAGH M, WALLACE T L, GLAVIS-BLOOM C, TENNER A J, ROGERS J. Peripheral complement interactions with amyloid β peptide: Erythrocyte clearance mechanisms. Alzheimer’s & Dementia, 2017, 13(12): 1397-1409.

[18] 谷新利, 李宏全, 王俊東, 蔣建軍, 陳韓英, 李炳奇, 張建海, 劉振中, 劉紅, 羅燕, 邵永斌. 從中藥方劑中提取的復(fù)合多糖對雛雞免疫功能的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38(4): 813-820.

GU X L, LI H Q, WANG J D, JIANG J J, CHEN H Y, LI B Q, ZHANG J H, LIU Z Z, LIU H, LUO Y, SHAO Y B. Effects of compound polysaccharide extracted from traditional Chinese medical herbs on the immunity function in chickens. Scientia Agricultura Sinica, 2005, 38(4): 813-820. (in Chinese)

[19] REINAGEL M L, TAYLOR R P. Transfer of immune complexes from erythrocyte CR1 to mouse macrophages. Journal of Immunology, 2000, 164(4): 1977-1985.

[20] HEPBURN A L, MASON J C, WANG S, SHEPHERD C J, FLOREY O, HASKARD D O, DAVIES K A. Both Fcgamma and complement receptors mediate transfer of immune complexes from erythrocytes to human macrophages under physiological flow conditions. Clinical and Experimental Immunology, 2006, 146(1): 133-145.

[21] 張琪琪, 凌小雅, 孫雨晨, 尹偉, 范闊海, 孫娜, 孫耀貴, 李宏全. 豬紅細(xì)胞類補(bǔ)體受體Ⅰ型膜結(jié)合蛋白的篩選. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2020, 50(1): 42-48.

ZHANG Q Q, LING X Y, SUN Y C, YIN W, FAN K H, SUN N, SUN Y G, LI H Q. Screening of membrane-binding proteins of complement receptor 1-like on porcine erythrocytes. Chinese Veterinary Science, 2020, 50(1): 42-48. (in Chinese)

[22] 張琪琪. 豬紅細(xì)胞CR1-like膜結(jié)合蛋白的檢測及鑒定[D]. 太谷: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020.

ZHANG Q Q. Detection and identification of membrane-binding proteins of complement receptor 1-like on porcine erythrocytes[D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2020. (in Chinese)

[23] 王春, 尹偉, 范闊海, 孫娜, 孫耀貴, 李宏全. 豬肺泡巨噬細(xì)胞膜表面類補(bǔ)體受體分子的鑒定. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2019(7): 13-17.

WANG C, YIN W, FAN K H, SUN N, SUN Y G, LI H Q. Identification of surface complement receptor molecules in porcine alveolar macrophages. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2019(7): 13-17. (in Chinese)

[24] 王春. 豬肺泡巨噬細(xì)胞移除紅細(xì)胞免疫粘附致敏GFP-.的研究[D]. 太谷: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019.

WANG C. Study on porcine alveolar macrophages removing opsonized GFP-.from erythrocytes[D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2019. (in Chinese)

[25] 凌小雅, 朱樂樂, 孫加樂, 王緣, 張睿玉, 薛曉姝, 尹偉. PAMs移除豬紅細(xì)胞表面GFP-的體外觀察. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 49(9): 1132-1136.

LING X Y, ZHU L L, SUN J L, WANG Y, ZHANG R Y, XUE X S, YIN W.observation of GFP-removed from porcine erythrocytes by porcine alveolar macrophages(PAMs). Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2021, 49(9): 1132-1136. (in Chinese)

[26] RUSSELL B L, GILDENHUYS S. Solubilisation and purification of recombinant bluetongue virus VP7 expressed in a bacterial system. Protein Expression and Purification, 2018, 147: 85-93.

[27] BANEYX F, MUJACIC M. Recombinant protein folding and misfolding in. Nature Biotechnology, 2004, 22(11): 1399-1408.

[28] 崔姣艷.豬紅細(xì)胞免疫黏附受體的鑒定與檢測[D]. 太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

CUI J Y. Identification and detection of porcine erythrocyte immune adhesion receptors[D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[29] LI J, SZALAI A J, HOLLINGSHEAD S K, NAHM M H, BRILES D E. Antibody to the type 3 capsule facilitates immune adherence of pneumococci to erythrocytes and augments their transfer to macrophages. Infection and Immunity, 2009, 77(1): 464-471.

[30] KAVAI M. Immune complex clearance by complement receptor type 1 in SLE. Autoimmunity Reviews, 2008, 8(2): 160-164.

[31] ROCHOWIAK A, NIEMIR Z I. The role of CR1 complement receptor in pathology. Polski Merkuriusz Lekarski: Organ Polskiego Towarzystwa Lekarskiego, 2010, 28(163): 84-88.

[32] ARORA V, VERMA J, DUTTA R, MARWAH V, KUMAR A, DAS N. Reduced complement receptor 1 (CR1, CD35) transcription in systemic lupus erythematosus. Molecular Immunology, 2004, 41(4): 449-456.

Effect of Porcine ECR1-Like Immune Adhesion on PAMs Capturing GFP-

ZHANG Zheng1, LING XiaoYa1, FAN KuoHai2, SUN Na1, SUN PanPan1, SUN YaoGui1, LI HongQuan1, YIN Wei

1Shanxi Key Laboratory for Modernization of TCVM/College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Shanxi Key Laboratory for Modernization of TCVM/Animal Experimental Center, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【Objective】The aim of this study was to investigate whether the immune adherence function of porcine erythrocyte complement receptor type 1-like (ECR1-like) could promote porcine alveolar macrophages (PAMs) to capture sensitized genetic engineering bacteria GFP-, in order to explain the molecular mechanism of porcine erythrocyte immunity and its role in innate immunity. 【Method】The level of GFP-captured by PAMs was detected by flow cytometry, colony plate counting and RT-PCR, and the effect of porcine ECR1-like immune adherence on the capture of GFP-by PAMs was analyzed. Flow cytometry and cellular immunofluorescence technique were used to detect the changes of immune adherence function of porcine erythrocytes, and the number of porcine ECR1-like after the sensitized GFP-with ECR1-like immune adherence was removed by PAMs. 【Result】Flow cytometry showed that the average fluorescence intensity of PAMs in porcine erythrocyte adhesion group was significantly higher than that in blank control group (＜0.001), while the positive rate of PAMs cells in porcine erythrocyte adhesion group was significantly higher than that in blank control group (＜0.05). Colony smear count showed that the capture of GFP-by PAMs in erythrocyte adhesion group was significantly higher than that in blank control group (＜0.05). RT-PCR showed that the relative quantity of GFP-in PAMs of erythrocyte adhesion group was significantly higher than that of blank control group (＜0.01). Further blocking CR1-like on the surface of porcine erythrocyte, flow cytometry showed that the average fluorescence intensity of PAMs decreased to 256 301.56±9 208.85 (＜0.001), and the positive cell rate of PAMs decreased to (88.32±0.92)% (＞0.05). Colony count showed that the capture of GFP-in PAMs decreased to (136 666±8 818) CFU/ml (＜0.05), and RT-PCR showed that the relative quantity of GFP-in PAMs decreased significantly (＜0.01). Using cell flow and circulation interaction technique, it was found that the average fluorescence intensity of GFP-sensitized by porcine erythrocyte immune adherence decreased from 2 892.18±47.76 before circulation to 2 407.43±141.78 (＜0.05), and the positive cell rate decreased from (20.58±0.36)% before circulation to (17.39±0.23)% (＜0.05). The adhesion level was significantly lower than that before circulation. Meanwhile, the results of indirect immunofluorescence test showed that the average fluorescence intensity of porcine ECR1-like decreased from 344.33±37.92 before to 291.56±11.99 (＜0.05), and the positive cell rate decreased from (30.20±1.24)% before to (28.27±0.64)% (＜0.05). 【Conclusion】Porcine ECR1-like promoted the capture of sensitized GFP-by PAMs through its immune adhesion function. After PAMs removed sensitized GFP-adhered to the surface of porcine erythrocyte, the activity of CR1-like of porcine erythrocyte decreased, and the immune adhesion function decreased too.

porcine; erythrocyte; PAMs; CR1-like; immune adherence

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.19.016

2022-11-26；

2023-08-04

山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20210302123407）、山西省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)（202204051001021）、山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2019L0364）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動項(xiàng)目（2021BQ77）、中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（202104010910015）

張崢，E-mail：zhangzhengjiayou@163.com。通信作者尹偉，E-mail：dkyyinwei@126.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）