超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜篩查確證尿液中磺胺、喹諾酮與四環(huán)素抗生素

張 楠，唐增煦，王莉莉，孫開奇，趙 榕*，范 賽*

（1.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013；2.中國疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050）

四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類廣譜抗生素是常見的既可治療人類疾病，又可作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)［1］，因此在醫(yī)藥衛(wèi)生及動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)得到了廣泛使用。然而，過度使用抗生素不僅會(huì)誘使病原體產(chǎn)生抗藥性，還會(huì)對(duì)人體多方面產(chǎn)生有害影響［2-3］。我國是世界主要的抗生素生產(chǎn)和使用國家之一，已在境內(nèi)不同的環(huán)境基質(zhì)中檢出多種抗生素殘留［4］，這些抗生素導(dǎo)致的環(huán)境污染、細(xì)菌耐藥以及生態(tài)毒理效應(yīng)等環(huán)境問題，已成為目前我國亟需解決的環(huán)境問題之一［5］。四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素的半衰期雖然較短，但由于其應(yīng)用廣泛并已進(jìn)入各類環(huán)境基質(zhì)和動(dòng)物性食品中，導(dǎo)致了環(huán)境中抗生素的“假持續(xù)”現(xiàn)象［6］，成為威脅公眾安全及生態(tài)系統(tǒng)的一大隱患。近年來，對(duì)抗生素的研究多集中于其在環(huán)境與動(dòng)物性食品中的殘留以及使用現(xiàn)狀［7-9］，對(duì)人體的抗生素暴露劑量及抗生素對(duì)人群健康影響的研究則十分匱乏，這可能是由于人體生物基質(zhì)中抗生素的檢測(cè)方法開發(fā)存在困難。因此，為監(jiān)測(cè)人體內(nèi)抗生素的暴露水平以及評(píng)估其對(duì)人群可能產(chǎn)生的健康影響，亟需建立人體生物樣本中抗生素的檢測(cè)技術(shù)。

進(jìn)入人體體內(nèi)的抗生素僅有部分會(huì)被消化吸收，約30%～90%的抗生素在進(jìn)入人體后8～24 h內(nèi)通過尿液和糞便排出［10］，同時(shí)，尿液的采集具有無創(chuàng)性和易得性，因此尿液是代替血液對(duì)體內(nèi)抗生素水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)的良好生物基質(zhì)。前期研究顯示，學(xué)齡兒童抗生素水平的高暴露與兒童肥胖直接相關(guān)［11-12］，為了開展學(xué)齡兒童的抗生素暴露譜研究，開發(fā)尿液中抗生素的檢測(cè)方法非常必要。然而，現(xiàn)有研究大多數(shù)僅針對(duì)單個(gè)抗生素，或單一類別的抗生素，很少涉及多類別抗生素［13-15］研究。因此，本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對(duì)人尿液中的16種磺胺類、20種喹諾酮類和9種四環(huán)素類共45種抗生素進(jìn)行了同時(shí)檢測(cè)，并應(yīng)用建立的方法對(duì)北京市280例6～17歲學(xué)齡兒童尿液樣本中的抗生素進(jìn)行了篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ThermoScientificTMSQAltisTM三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Themo Scientific 公司）；Milli-Q 超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；Anavo HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL，北京納鷗科技有限公司）。甲醇、乙腈（色譜級(jí)，北京納鷗科技有限公司），EDTA-2Na（優(yōu)級(jí)純，北京分析試劑廠）。除特殊說明外，所有實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)品：16 種磺胺類藥物（磺胺乙酰胺、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲唑、磺胺異唑、磺胺苯吡唑）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為10 μg/mL，20 種喹諾酮類藥物（脫乙烯基環(huán)丙沙星、馬波沙星、依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、奧比沙星、沙拉沙星、司帕沙星、二氟沙星、西諾沙星、哌啶酸、喹酸、萘啶酸、氟甲喹）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為10 μg/mL，9種四環(huán)素類藥物（二甲胺四環(huán)素、4-差相土霉素、土霉素、甲基土霉素、四環(huán)素、去甲基金霉素、金霉素、多西環(huán)素、4-差相四環(huán)素）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為100 μg/mL?；鞓?biāo)均購自北京Dikma公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確吸取16種磺胺類藥物混標(biāo)溶液1.00 mL、20種喹諾酮類藥物混標(biāo)溶液1.00 mL、9種四環(huán)素類藥物混標(biāo)溶液0.10 mL于同一個(gè)10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，制備成3類抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL），儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。精確吸取3 類抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，制備成3類抗生素的混合中間液（質(zhì)量濃度均為100.0 ng/mL）。

1.3 樣品前處理

取尿液樣品5.0 mL 置于15 mL 離心管中，加入 0.1 mol/L 的EDTA-2Na 緩沖溶液5.0 mL，渦旋混勻30 s 后過HLB 固相萃取柱。HLB 固相萃取柱依次用6 mL 甲醇和6 mL 水活化，然后將尿液混合液全部上樣至該萃取柱，隨后用6 mL 水對(duì)萃取柱進(jìn)行淋洗以除去雜質(zhì)，真空泵下抽干萃取柱中的殘留水分。隨后使用6 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液以氮?dú)饬鞔蹈?。?.5 mL 甲醇-水（1∶1，體積比）復(fù)溶，裝入1.5 mL塑料離心管，10 000 r/min離心10 min，上清液供儀器測(cè)定。

1.4 UPLC-MS/MS條件

1.4.1 液相色譜條件色譜柱：ThermoAccucore RP-MS 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流速：0.35 μL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.02%甲酸溶液，梯度洗脫，洗脫程序：0～15 min，5%～95% A；15～17 min，95% A；17～17.1 min，95%～100% A，17.1～19 min，100% A；19～19.1 min，100%～5% A；19.1～22 min，5% A。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子傳輸管溫度：350 ℃；輔助氣加熱溫度：325 ℃；鞘氣：5.58 L/min（50 Arb）；輔助氣：7.97 L/min（10 Arb）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式；各待測(cè)物的質(zhì)譜信息及保留時(shí)間等參數(shù)詳見表1。

表1 各化合物的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectrometry parameters of each compound

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化為確定質(zhì)譜參數(shù)，通常采用流動(dòng)注射的方式進(jìn)行參數(shù)確認(rèn)，在正離子（ESI+）掃描模式下，磺胺、喹諾酮、四環(huán)素類抗生素化合物及其代謝產(chǎn)物多為正離子，在液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)中一般會(huì)產(chǎn)生［M+H］+的分子離子峰。質(zhì)譜檢測(cè)過程中，高分辨質(zhì)譜多用來定性篩查，再通過三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行定量檢測(cè)。本研究嘗試采用三重四極桿質(zhì)譜完成定性篩查，并進(jìn)行定量檢測(cè)。定性檢測(cè)中，離子對(duì)的選取多參考?xì)W盟2002/657/EC規(guī)范，當(dāng)兩個(gè)離子對(duì)滿足IP 4分法時(shí)，即可進(jìn)行質(zhì)譜定性。但實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，定性離子受到干擾時(shí)，不能滿足定性要求，將造成假陰性誤判。在三重四極桿質(zhì)譜儀缺少飛行時(shí)間質(zhì)譜儀定性的情況下，采用多離子對(duì)結(jié)合豐度比的定性方式，可以滿足定性的要求，避免基質(zhì)干擾帶來的誤判。本研究絕大部分化合物采用3 對(duì)或以上的定性定量離子對(duì)，避免了檢測(cè)結(jié)果的不確定性，可以獲得更準(zhǔn)確的定性結(jié)果，同時(shí)以三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行定量分析，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)篩查確證與定量，詳細(xì)質(zhì)譜信息見表1，各化合物的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖見圖1～3。

圖1 16種磺胺類抗生素的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（10.0 μg/L）Fig.1 Chromatograms of 16 sulfonamide antibiotics matrix standards solutions（10.0 μg/L）

圖2 20種喹諾酮類抗生素的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（10.0 μg/L）Fig.2 Chromatograms of 20 quinolone antibiotics matrix standards solutions（10.0 μg/L）

圖3 9種四環(huán)素類抗生素的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（10.0 μg/L）Fig.3 Chromatograms of 9 tetracycline antibiotics matrix standards solutions（10.0 μg/L）

2.1.2 液相色譜條件的優(yōu)化正離子模式下，一般在流動(dòng)相中添加甲酸可提高響應(yīng)值，增加靈敏度，但使用Thermo Accucore RP-MS 色譜柱檢測(cè)時(shí)，部分抗生素在甲酸體系下的峰形會(huì)出現(xiàn)展寬，導(dǎo)致靈敏度下降。因此，本研究分別考察了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.05%甲酸水溶液-乙腈、0.02%甲酸水溶液-乙腈、純水-乙腈為流動(dòng)相時(shí)對(duì)目標(biāo)化合物色譜行為與質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，以Thermo Accucore RP-MS 色譜柱為分離柱時(shí)，選用0.02%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，45 種化合物峰形良好，靈敏度最高。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

磺胺、喹諾酮、四環(huán)素類抗生素是目前最為常見的幾類獸藥，國家針對(duì)這3 類抗生素制定了一系列動(dòng)物性食品檢測(cè)方法，GB 31658.17-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定》［17］中同時(shí)規(guī)定了基于HLB 固相凈化小柱的此3 類抗生素的混合前處理方法。同時(shí)，基于該固相小柱檢測(cè)多種抗生素殘留的方法已經(jīng)有大量報(bào)道［16］，國標(biāo)方法與文獻(xiàn)方法中均對(duì)HLB小柱的優(yōu)化條件進(jìn)行了介紹，此處不再贅述。

抗生素在動(dòng)物性食品中的低殘留導(dǎo)致人體尿液樣本中的殘留量極低，不宜采用QuEChERS 方法進(jìn)行凈化。而固相萃取柱具有較強(qiáng)的濃縮富集性，可將大體積尿液樣本通過過柱的方法進(jìn)行濃縮。本文通過固相萃取柱將5 mL 尿液中的3 類抗生素吸附到柱上并將體積濃縮至0.5 mL，提高了檢測(cè)靈敏度。另外，由于四環(huán)素類藥物極易與金屬螯合導(dǎo)致回收率下降，故加入0.1 mol/L EDTA-2Na溶液以避免四環(huán)素類藥物的螯合，提高其回收率；同時(shí)，磺胺類化合物在酸性條件下易發(fā)生降解，應(yīng)避免在前處理過程中引入甲酸等酸性溶劑，防止磺胺類化合物回收率下降。

2.3 檢出限及定量下限

為減少基質(zhì)抑制效應(yīng)對(duì)3 類抗生素檢測(cè)結(jié)果的影響，采用陰性尿液制備空白基質(zhì)溶液，并配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色譜峰面積對(duì)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，在0.5～20.0 μg/L 范圍內(nèi)，各物質(zhì)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999。以信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法檢出限（LOD），信噪比為10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量下限（LOQ），磺胺、喹諾酮、四環(huán)素3類目標(biāo)物的LOD為0.1～0.5 μg/L，LOQ為0.3～1 μg/L，結(jié)果見表2。

表2 方法的檢出限、定量下限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD， n=6）Table 2 LODs，LOQs，recoveries and RSDs of the method（n=6）

（續(xù)表2）

2.4 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

以陰性尿液樣品為基質(zhì)，進(jìn)行2.0、5.0、10.0 μg/L 3個(gè)水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6），結(jié)果見表2。由表可見，本方法的回收率為78.6%～114%，RSD為0.60%～18%。方法準(zhǔn)確度及精密度良好，可用于尿液中磺胺、喹諾酮、四環(huán)素3類抗生素殘留的篩查與定量檢測(cè)。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)采集的280 份北京市健康兒童、青少年的尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出相關(guān)抗生素殘留。檢測(cè)對(duì)象為健康人群的尿液樣本，故抗生素暴露來源于膳食攝入，該檢測(cè)結(jié)果與北京市近年來食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的獸藥殘留監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)相一致。在實(shí)際樣本檢測(cè)過程中，以每70 份樣本加做6 個(gè)平行回收進(jìn)行質(zhì)量控制，在5.0 μg/L的加標(biāo)水平下，方法回收率在80%～100%之間，RSD值小于10%。

3 結(jié) 論

本文基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法成功測(cè)定了尿液中的3 類共45 種抗生素，建立的方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，為人體生物基質(zhì)中抗生素的檢測(cè)提供了新思路。