氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定綠茶中35種農(nóng)藥殘留

高堯華，劉夢(mèng)琳，李林杰，孫 立，張曉文，閻 炳，張鴻偉*

（1.日照海關(guān)，山東 日照 276826；2.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東 青島 266114）

綠茶因含有多種氨基酸和豐富的礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，多年來(lái)占據(jù)我國(guó)傳統(tǒng)飲品的重要位置，同時(shí)也是我國(guó)主要出口經(jīng)濟(jì)作物之一，廣受?chē)?guó)內(nèi)外市場(chǎng)好評(píng)。近年來(lái)茶葉的需求量增大，種植面積及生產(chǎn)規(guī)模相應(yīng)擴(kuò)大，但部分茶農(nóng)的食品安全意識(shí)淡薄，在茶樹(shù)種植采摘期間用藥種類及劑量不科學(xué)，導(dǎo)致部分茶葉中農(nóng)藥殘留污染問(wèn)題，不但影響廣大消費(fèi)者對(duì)茶類產(chǎn)品的認(rèn)可度，更引起對(duì)茶類食品安全的關(guān)注。我國(guó)最新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2763-2021 和GB 2763.1-2022）規(guī)定了茶葉中71 種農(nóng)藥的最大殘留限量［1-2］，歐盟規(guī)定了茶葉中502種農(nóng)藥、日本相關(guān)法規(guī)規(guī)定了230種農(nóng)藥的最大殘留限量［3］，且規(guī)定茶葉中多種農(nóng)藥的最大殘留限量最小值為0.01 mg/kg［4］。因此，茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的性能指標(biāo)事關(guān)農(nóng)藥殘留控制，影響我國(guó)茶葉產(chǎn)業(yè)對(duì)外貿(mào)易發(fā)展。

目前，茶葉類產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的分析方法主要以色譜和質(zhì)譜測(cè)定為主［5-10］。茶葉基質(zhì)復(fù)雜，增加了農(nóng)藥殘留分析難度，因此降低茶葉基質(zhì)影響，提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和靈敏度成為茶葉分析的關(guān)鍵技術(shù)。QuEChERS 法因具有通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留前處理中已被廣泛應(yīng)用。茶葉作為復(fù)雜基質(zhì)植物源性產(chǎn)品，在前處理過(guò)程中主要使用QuEChERS 法［11-13］和固相萃取法［14-16］。本研究根據(jù)GB 2763-2021 及GB 2763.1-2022 的檢測(cè)要求，通過(guò)優(yōu)化QuEChERS 前處理方法，建立了同時(shí)測(cè)定綠茶中35種常用農(nóng)藥的氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法。該方法檢測(cè)靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)茶葉中35種常用農(nóng)藥的準(zhǔn)確測(cè)定，可為茶葉類產(chǎn)品的質(zhì)量安全把控提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890A-7000B 氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；IKA KS260 振蕩器（德國(guó)IKA 公司）；Buchi 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；IKA MS3 basic 渦旋混勻器（德國(guó)IKA公司）。

乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；丙酮、正己烷（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；氯化鈉（分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司）；十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）購(gòu)于天津博納艾杰爾股份有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

35種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，純度均大于99%，質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL）：具體名稱見(jiàn)表1，用丙酮-正己烷（3∶7，體積比）混合溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃冰箱避光、密封保存，保存期為6個(gè)月。

表1 35種化合物的儀器分析參數(shù)Table 1 Parameters for instrumental analysis of 35 compounds

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：準(zhǔn)確移取適量混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，用經(jīng)確證不含目標(biāo)農(nóng)藥的綠茶空白基質(zhì)提取液稀釋成10、20、50、100、200、500、1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確至0.01 g）茶葉試樣，置于50 mL 離心管中，加入15 mL 85 ℃熱水充分浸泡30 min，放涼后，加入20 mL 乙腈振蕩提取30 min，加入5 g 氯化鈉渦旋1 min，以5 000 r/min 離心5 min。移取10 mL 上清液至盛有200 mg PSA、200 mg C18、50 mg GCB 的凈化管中，渦旋30 s，過(guò)濾至雞心瓶中，濾液經(jīng)45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1.0 mL 丙酮-正己烷（3∶7）混合溶液定容后，過(guò)0.22 μm濾膜，供上機(jī)分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣：高純氦氣（99.999%）；碰撞氣：高純氮?dú)猓?9.999%）；流速：1.1 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；升溫程序：50 ℃保持2 min，以25 ℃/min 程序升溫至150 ℃保持6 min，再以3 ℃/min 程序升溫至200 ℃，最后以8 ℃/min程序升溫至280 ℃保持7 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：1.0 μL；溶劑延遲：5 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；輔助加熱溫度：280 ℃；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。35種化合物的儀器分析參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化綠茶的沖泡建議溫度為85 ℃，為準(zhǔn)確測(cè)得人體攝入茶湯中農(nóng)藥殘留含量，本實(shí)驗(yàn)采用85 ℃熱水沖泡。在100 μg/L 的35 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加入85 ℃熱水沖泡后，采用乙腈提取并濃縮定量，測(cè)得定量后溶液與等濃度未加入熱水的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度差小于10%。綜合回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明35種農(nóng)藥在加入85 ℃熱水后無(wú)降解。

根據(jù)茶葉中常用農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)，在其他條件相同的情況下，考察了甲醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、乙腈、0.2%及0.5%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈作為提取溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，丙酮可提取多種色素，提取液呈深綠色近似黑色；甲醇提取液呈墨綠色；乙腈提取液呈綠色；對(duì)于甲酸-乙腈提取液，甲酸的加入對(duì)色素類化合物無(wú)影響，其提取液顏色較乙腈提取液無(wú)明顯變化；正己烷提取液中色素類化合物較少，呈淺綠色；乙酸乙酯提取液顏色介于乙腈和正己烷提取液顏色之間。各提取液顏色排序：丙酮＞甲醇＞乙腈及甲酸-乙腈＞乙酸乙酯＞正己烷。此外，通過(guò)添加100 μg/kg的35種農(nóng)藥對(duì)上述提取溶劑的回收率進(jìn)行考察（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明，乙腈及甲酸-乙腈的回收率明顯優(yōu)于其他提取溶劑，與乙腈相比，甲酸-乙腈在提取過(guò)程中對(duì)目標(biāo)物回收率的改善不明顯，僅有5 種目標(biāo)物采用甲酸-乙腈提取的回收率略高，其他30種目標(biāo)物與采用乙腈提取的回收率相當(dāng)或略低。因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為提取溶劑。

表2 提取溶劑對(duì)35種農(nóng)藥回收率的影響Table 2 Effect of extraction solvents on the recoveries of 35 pesticides

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化茶葉中含有多種色素及堿性組分等復(fù)雜基質(zhì)，樣品經(jīng)乙腈提取后提取液中含大量色素及部分脂類共提取物。實(shí)驗(yàn)選取QuEChERS 方法的常用凈化劑（PSA、C18、GCB）對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。

根據(jù)3 種吸附劑的性質(zhì)［17］，選取同一茶葉空白樣品，按照相同實(shí)驗(yàn)過(guò)程，選取不同配比的PSA、C18和GCB 為凈化材料，以未添加凈化劑的空白組為對(duì)照，考察對(duì)同一樣品中添加相同濃度（50 μg/kg）35種農(nóng)藥的回收率差異。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠茶基質(zhì)中吸附劑種類和用量均可影響35種農(nóng)藥的回收率。GCB可有效去除綠茶中色素類化合物；C18能夠吸附綠茶樣液中脂類化合物；提取液經(jīng)濃縮后，未添加C18的樣品均含可流動(dòng)油狀物，未加入3 種凈化劑的樣液濃縮后呈深綠色粘稠狀，復(fù)溶后樣液出現(xiàn)分層，導(dǎo)致目標(biāo)物的回收率較低，且污染離子源和色譜柱。經(jīng)綜合考察，選擇PSA+C18+GCB 作為凈化劑，提高了目標(biāo)分析物的回收率，減少了綠茶中脂類和色素類共提取物。為更直觀體現(xiàn)凈化后回收率的改善效果，以35種化合物經(jīng)不同凈化劑凈化后的回收率與其所測(cè)最高回收率的比值為縱坐標(biāo)作圖，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖1。鑒于六六六、滴滴涕同分異構(gòu)體之間凈化效果的差異小于5%，其凈化效果在圖1中合并表示。

圖1 不同凈化劑對(duì)35種化合物含量的影響Fig.1 Effect of different purifying agents on the contents of 35 compounds

選取PSA、C18用量為50～400 mg，GCB 用量為25～200 mg，對(duì)凈化劑用量組合進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，增加凈化劑的用量可提高目標(biāo)物的凈化效果，但當(dāng)PSA、C18的用量＞300 mg，GCB用量＞50 mg時(shí)甲胺磷、乙酰甲胺磷、硫丹、百菌清、氰戊菊酯、苯醚甲環(huán)唑、溴氰菊酯等化合物的回收率降低。綜合考慮，確定凈化材料用量為200 mg PSA、200 mg C18、50 mg GCB。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)歐盟96/23/EC 要求，質(zhì)譜方法定性至少達(dá)到4個(gè)識(shí)別點(diǎn)的要求［18］。三重四極桿質(zhì)譜在MRM 模式下，1 個(gè)母離子加上2 個(gè)及以上子離子的識(shí)別點(diǎn)≥4。將質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的35 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜全掃描模式采集，確定每種化合物的保留時(shí)間，并選擇豐度高、m/z大的特征離子，在MRM 模式下優(yōu)化碰撞能量，選擇1對(duì)豐度較高且基質(zhì)影響較小的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，另1對(duì)作為定性離子對(duì)，優(yōu)化后的參數(shù)見(jiàn)表1。35種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖見(jiàn)圖2。

圖2 35種化合物在MRM模式下的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of 35 compounds in MRM mode the number denoted was the same as those in Table 1

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

根據(jù)文獻(xiàn)［19-22］，基質(zhì)效應(yīng)（ME）計(jì)算方法為：ME=（基質(zhì)中目標(biāo)分析物的定量離子峰面積/溶劑中目標(biāo)分析物的定量離子峰面積-1）×100%。當(dāng)｜ME｜≤20%，通常認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較小，可不考慮基質(zhì)效應(yīng)影響；20%＜｜ME｜≤50%，表明存在中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)｜ME｜＞50%，表明存在較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物定量不準(zhǔn)確［23-26］。

對(duì)比了200 μg/L 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，平行測(cè)定6 次。結(jié)果表明，35 種化合物中，大于70%的化合物表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 線性關(guān)系與檢出限

配制10、20、50、100、200、500、1 000 μg/L 系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以35種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以定量離子所對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得到各目標(biāo)物的線性方程。結(jié)果顯示，35種化合物在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.99。分別以3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到35種化合物的LOD為1～5 μg/kg，LOQ為5～15 μg/kg（見(jiàn)表3）。

表3 35種化合物的檢出限、定量下限、平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 LODs，LOQs，average recoveries and relative standard deviations（n = 6） of 35 compounds

（續(xù)表3）

2.5 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

選取經(jīng)檢測(cè)無(wú)目標(biāo)農(nóng)藥殘留的市售綠茶為空白基質(zhì)，分別添加低、中、高3 個(gè)不同水平（20、40、200 μg/kg）的35種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行空白加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，加標(biāo)樣品中35 種農(nóng)藥的平均回收率為70.3%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.6%～12%，該方法的精密度和準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

根據(jù)日照產(chǎn)茶區(qū)分布特點(diǎn)，選取奎山、巨峰、三莊3 個(gè)主產(chǎn)地作為研究對(duì)象，對(duì)同一種植區(qū)春、夏、秋3 季茶葉中的農(nóng)藥殘留概況進(jìn)行分析。采用本方法對(duì)上述產(chǎn)區(qū)市售30 份日照綠茶樣品（春茶12份，夏茶9份，秋茶9份）進(jìn)行檢測(cè)。由表4可見(jiàn)，12份春茶中巨峰、奎山兩地各有1份樣品檢出，9份夏茶中僅巨峰有1份樣品檢出，9份秋茶中僅巨峰有1份樣品檢出。

表4 日照綠茶樣品中農(nóng)藥殘留檢出概況（μg/kg）Table 4 Overview of pesticide residues in Rizhao green tea samples（μg/kg）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，日照綠茶中春茶和秋茶的農(nóng)藥殘留種類主要為毒死蜱、溴蟲(chóng)腈、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯；夏茶的農(nóng)藥殘留種類主要為毒死蜱、溴蟲(chóng)腈、聯(lián)苯菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯，以上檢出農(nóng)藥的殘留量均未超過(guò)國(guó)家要求的最大殘留限量。

采用本方法對(duì)5份日照紅茶、1份金駿眉、1份南京綠茶、2份西湖龍井和1份鐵觀音進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（100 μg/kg），35 種農(nóng)藥的回收率為77.0%～115%，回收率符合要求，表明本方法不受上述樣品種類限制。

2.7 本法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

目前我國(guó)已發(fā)布的茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法主要有GB 23200.13-2016［27］、GB 23200.113-2018［28］和GB/T 23204-2008［29］。GB 23200.13-2016和GB/T 23204-2008在前處理過(guò)程中均采用固相萃取柱凈化，且樣品用量大；本方法采用QuEChERS前處理方法，操作簡(jiǎn)單快速，樣品用量少、試劑消耗少，污染小。GB 23200.113-2018 雖采用QuEChERS 前處理方法，但本實(shí)驗(yàn)針對(duì)35 種綠茶種植常用農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)，對(duì)QuEChERS 方法中3 種凈化劑的配比進(jìn)行優(yōu)化，提高了方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。同時(shí)，前處理采用85 ℃熱水沖泡，能更準(zhǔn)確反映實(shí)際攝入的農(nóng)藥殘留量。綜上，本方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可作為標(biāo)準(zhǔn)方法的有效補(bǔ)充。

3 結(jié) 論

本文建立了綠茶中35種常用農(nóng)藥的QuEChERS/氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定方法，樣品用85 ℃熱水沖泡放涼后，采用乙腈提取，經(jīng)優(yōu)化的QuEChERS 前處理方法凈化后，采用MRM 模式進(jìn)行檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)效率高，成本較低，適用于綠茶中農(nóng)藥殘留的準(zhǔn)確定性和定量分析，為綠茶中農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持。