QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定禽蛋中90種禁用藥物殘留

陳 容，劉育形，王澤林，李澍才，張 晶*，邵 兵

（1.北京市疾病預防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100013；2.四川省食品檢驗研究院，四川 成都 611731）

獸藥是畜禽養(yǎng)殖過程中的關(guān)鍵投入品，在保障動物健康和確保食品產(chǎn)量方面發(fā)揮著重要作用。由于獸藥的不規(guī)范使用、濫用或違禁使用，造成殘留超標或違禁藥物檢出，可能會導致急性中毒、過敏反應、細菌耐藥性等不良后果，不僅給消費者帶來明顯或潛在的健康威脅，而且會損害我國相關(guān)食品在國際貿(mào)易中的聲譽，造成經(jīng)濟損失。因此，獸藥殘留一直是動物性食品安全的重點關(guān)注領域。GB 31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》［1］等標準和法規(guī)規(guī)定了肉、蛋、奶等多種動物性食品的獸藥殘留限量，其中蛋類涉及的禁用藥物種類最多，包括甲硝唑、氯丙嗪等不得檢出的9種以及磺胺類、青霉素類、四環(huán)素類等產(chǎn)蛋期禁用的34 種；在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250 號公告［2］中，禁用藥物包括β-激動劑、萬古霉素類及部分農(nóng)藥等33類。為保障消費者的健康，確保禽蛋產(chǎn)品質(zhì)量安全，建立快捷、高通量、準確可靠的禁用藥物同時分析方法十分必要。

目前關(guān)于動物性食品中藥物殘留的分析方法主要有酶聯(lián)免疫法［3］、氣相色譜法［4］、高效液相色譜法［5］以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［6-8］。LC-MS/MS 法具有高選擇性、高靈敏度、低檢出限的特點，是動物性食品藥物殘留分析的首選方法［9-10］。動物性食品藥物殘留分析應用較為廣泛的前處理方法主要包括固相萃取法［11-13］和QuEChERS法［14-15］。前者需經(jīng)過富集、分離、凈化等步驟，耗時較長；固相萃取柱多是基于極性分離和離子交換分離原理，因此不適用于化合物數(shù)量多、性質(zhì)差異大的分析場景；且固相萃取柱成本較高。QuEChERS 法具有快速、低成本、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于動物性食品的藥物殘留分析中，可實現(xiàn)多種性質(zhì)差異較大的化合物的高通量分析。關(guān)于藥物殘留分析的標準與研究主要針對一類藥物或幾類性質(zhì)相似的藥物，針對禽蛋中違禁藥物的檢測方法鮮有報道［16-18］。本文建立了禽蛋中包括磺胺類、β-激動劑類、四環(huán)素類、萬古霉素類等90種違禁藥物的QuEChERS/超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜高通量分析方法，實現(xiàn)禽蛋中多種違禁藥物的同時分析，為禽蛋產(chǎn)品的質(zhì)量安全保障提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

實驗樣品購于當?shù)爻校?0 種標準品和29 種內(nèi)標（純度＞90%）購自加拿大TRC 公司。十八烷基鍵合硅膠吸附材料（C18）、QuEChERS Z-sep/C18（120 mg Z-Sep+，300 mg Discovery DSC-18）凈化管、N-丙基乙二胺鍵合固相吸附材料（PSA）購自美國Supelco 公司；多壁碳納米管（MWNTs，8～15 nm）購自南京先豐納米材料科技有限公司；QuEChERS dSPE EMR-lipid凈化填料購自美國安捷倫公司。

除特殊說明外，所用試劑均為分析純。甲醇（LC-MS 級）、乙腈和超純水均購自迪馬科技有限公司；甲酸（純度＞99%）購自美國Acros 公司；乙二胺四乙酸二鈉鹽（Na2EDTA）購于國藥集團化學試劑有限公司；氟化銨（NH4F，純度＞99.99%）購自上海阿拉丁試劑有限公司；實驗用水由Milli-Q 超純水凈化處理系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設備

ACQUITYTM超高效液相色譜儀-Xevo?TQ-XS 串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；Allegra X-30R Centrifuge 冷凍離心機（美國Beckman 公司）；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）。

1.3 標準溶液配制

分別稱取適量標準品及其內(nèi)標于10 mL 容量瓶中，用含0.1%甲酸的甲醇溶液配制成1 000 mg/L 的混合標準儲備液，-20 ℃保存；用甲醇將90種標準儲備液配制成1 mg/L 的混合標準中間液，將29種內(nèi)標儲備液配制成1 mg/L的混合內(nèi)標中間液，再用10%甲醇水稀釋至所需濃度。

1.4 樣品前處理

準確稱取雞蛋樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL 聚丙烯離心管中，分別加入50 μL 100 μg/L 的混合標準溶液和混合內(nèi)標溶液，加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1，體積比）作為提取溶劑，渦旋30 s后加入25 mg乙二胺四乙酸二鈉鹽，渦旋15 s，超聲提取30 min，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min。準確稱取50 mg（精確至0.0001 g）QuEChERS dSPE EMR-lipid 凈化填料于2 mL 聚丙烯離心管中，加入1 mL上述上清液，渦旋1 min，4 ℃下14 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)至進樣瓶中待測。

1.5 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.35 mL/min。正離子模式流動相：A 相為0.1%甲酸水，B 相為甲醇；梯度洗脫程序：0～1 min，3%～10% B；1～2.5 min，10%～15% B；2.5～5 min，15% B；5～7 min，15%～30% B；7～10.5 min，30%～50% B；10.5～12.5 min，50%～100% B；12.5～13.5 min，100% B；13.5～14 min，100%～3% B；14～14.5 min，3% B。負離子模式流動相：A 相為水，B 相為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，10%～15% B；1～2.5 min，15%～50% B；2.5～6 min，50%～65% B；6～7.5 min，65%～95% B；7.5～8 min，95%～100% B；8～8.5 min，100% B；8.5～8.6 min，100%～10% B。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；毛細管電壓：2.5 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣（N2）流速：800 L/h；碰撞室壓力：15.9 Pa。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

將500 μg/L的單個標準品依次進行質(zhì)譜條件優(yōu)化。分別在正、負離子模式下進行一級質(zhì)譜全掃描，在最優(yōu)碰撞電壓條件下，確定目標物母離子的m/z 值；然后進行二級質(zhì)譜全掃描，通過優(yōu)化碰撞能，選擇響應最高的碎片離子作為目標物的定量離子，響應次高的碎片離子作為定性離子，質(zhì)譜參數(shù)如表1。

表1 90種目標物及29種內(nèi)標物的質(zhì)譜參數(shù)、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters，linear ranges and correlation coefficients of 90 target drugs and 29 internal standards

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于本實驗的化合物數(shù)量較多，且各化合物的理化性質(zhì)差異較大，為達到更好的響應值和分離度，比較了ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、SHIMADZU C18-AQ（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Epic Biphenyl（2.1 mm×100 mm，1.8μm）不同類型反相色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，使用HSS T3 色譜柱時所有物質(zhì)均可得到較好的峰形，且分離度和響應值優(yōu)于其他3 種色譜柱，推測是因為T3 柱的鍵合疏水相比例較低，除常規(guī)的反相機制外，還可對極性物質(zhì)達到較好的保留效果。因此實驗選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，進一步對流動相進行了優(yōu)化。

正離子模式下，以甲醇為有機相，考察了0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸-0.5 mmol/L NH4F 水溶液2 種水相對目標物分離效果的影響。發(fā)現(xiàn)在0.1%甲酸-0.5 mmol/L NH4F 水溶液條件下，福莫特羅、達氟沙星、硝呋烯腙等目標物的峰形較寬，存在拖尾；而在0.1%甲酸水溶液條件下，目標物的響應值更高，且峰形較尖銳對稱。以0.1%甲酸水溶液為水相，比較了甲醇和乙腈2 種有機相的分離效果，如圖1 所示，在乙腈體系下，硝呋烯腙、毒殺芬、丙酸睪酮等目標物的峰形展寬，而在甲醇體系下目標化合物的峰形、響應值和分離度均較好，可滿足分析要求。因此，正離子模式下選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相。負離子模式下分別比較了乙腈、甲醇兩種有機相，研究表明水相中加入NH4F 可改變雌二醇等目標物的響應值［19］，因此實驗比較了水、1 mmol/L NH4F 兩種水相的分離效果。結(jié)果顯示，乙腈-水體系下目標物的響應值更高、峰形更好，因此負離子模式下選擇水-乙腈作為流動相。

圖1 正離子模式不同有機相條件下目標物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of targets under different organic phase conditions in positive ion mode A：methanol；B：acetonitrile

2.3 樣品前處理優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇乙腈是動物性食品獸藥殘留提取常用的有機溶劑，在乙腈中加入一定比例的水和酸可以提高提取效率，減少共沉淀造成的目標物損失。研究表明，隨著甲酸含量的增加，磺胺類等堿性物質(zhì)的回收率降低，當甲酸含量為0.2%時，提取效果較好［20-21］。因此本文選擇0.2%甲酸-乙腈為提取溶劑并進行了優(yōu)化。稱取2 g禽蛋樣品，分別加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈水溶液（1∶1）、0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1）和0.2%甲酸-乙腈溶液，加入50 μL 混合標準溶液（100 μg/L），超聲離心。從表觀看，0.2%甲酸-乙腈水溶液（1∶1）產(chǎn)生的上清液較混濁，另兩種溶液的提取液均很澄清；取上清液進行分析，結(jié)果表明以0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1）提取時大部分目標物的峰面積大于其他兩種提取溶劑，以0.2%甲酸-乙腈提取時目標物的峰面積最小，這可能是由于高比例的乙腈使得樣品發(fā)生團聚，目標物被包裹在樣品基質(zhì)中。綜上，本實驗選用0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1）作為提取溶劑。

2.3.2 Na2EDTA 對目標物回收率的影響由于四環(huán)素、喹諾酮等藥物易與基質(zhì)中的金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合，導致提取率偏低。研究表明，提取溶液中加入EDTA 可使金屬離子與之發(fā)生螯合，從而使目標物解離［22-23］。因此考察了Na2EDTA 對目標化合物提取率的影響。向2 g 雞蛋中加入25 mg Na2EDTA，用10 mL 0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1）超聲提取30 min，離心后取上清液進行分析。結(jié)果顯示，加入Na2EDTA 后有48 種目標物的回收率增加，其中多西環(huán)素的平均回收率提高了24%，喹諾酮類藥物的平均回收率增加了16.4%～21.4%。

2.3.3 樣品凈化復雜的樣品基質(zhì)會對目標物的回收率和色譜行為造成不良影響，為提升分析效果，延長色譜柱壽命，通常需對樣品提取液進行凈化以去除干擾成分。目前QuEChERS 法因高效、快捷和操作方便常用于動植物食品殘留檢測的前處理［24-25］。本研究比較了C18、PSA、增強型除脂材料（EMRlipid）、MWNTs、Z-Sep/C18凈化管 5 種凈化材料的處理效果。分別稱取50 mg C18、20 mg PSA、50 mg EMR-lipid、50 mg Z-Sep/C18、10 mg MWNTs 填料，考察雞蛋基質(zhì)的加標回收率和基質(zhì)效應（圖2）。由圖2 可知，采用MWNTs 填料凈化時回收效果最差，有27 種物質(zhì)的回收率在60%以下，其中恩諾沙星、二氟沙星等7 種目標物的回收率低于10%，這可能是MWNTs 對目標物產(chǎn)生不可逆吸附所致；采用EMR-lipid 填料凈化時，目標化合物的回收率為53.2%～134%，其中85 種藥物的回收率為60%～120%，從基質(zhì)效應來看，使用EMR-lipid 填料時，僅氟苯尼考有基質(zhì)增強效應，其他化合物無顯著影響或有輕微抑制效應。這可能是由于EMRlipid 凈化填料能夠選擇性去除雞蛋提取液中的脂質(zhì)等干擾成分，且不會對分析物造成顯著影響。因此選擇EMR-lipid 填料作為凈化材料。

圖2 采用不同凈化材料時雞蛋基質(zhì)中目標物回收率的分布情況Fig.2 Distribution of target recovery in egg matrix with different purifying agents

2.4 方法確證

本研究通過基質(zhì)標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值考察了各目標物的基質(zhì)效應。如表2 所示，目標物的基質(zhì)效應為55.7%～138%，因此采用內(nèi)標校正曲線或基質(zhì)空白提取液配制標準曲線以消除基質(zhì)效應的影響。采用基質(zhì)空白提取液配制標準曲線溶液，在優(yōu)化條件下進行分析。硝呋烯腙、呋喃苯烯酸鈉、水楊酸、毒殺芬、呋喃丹等12種物質(zhì)因未獲得同位素內(nèi)標，故采用基質(zhì)外標曲線法校正，其余物質(zhì)使用內(nèi)標曲線法校正。以目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg/L），相應峰面積與內(nèi)標峰面積比為縱坐標（y）進行線性回歸。結(jié)果顯示，90 種目標物在對應質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）不小于0.99（表1）。對空白基質(zhì)進行加標分析，以信噪比（S/N）≥3 為檢出限（LOD），S/N≥10 為定量下限（LOQ），得到本方法的檢出限為0.05～1 μg/kg，定量下限為0.1～3 μg/kg（表2）。

表2 雞蛋中90種目標物的定量下限、平均加標回收率、RSD及基質(zhì)效應（n=6）Table 2 Limits of quantitation（LOQs），average recoveries，RSDs and matrix effects of 90 targets in eggs（n=6）

對雞蛋空白基質(zhì)進行LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ 3個水平的加標實驗，每個濃度設6個平行，在優(yōu)化條件下進行分析，計算目標物的平均回收率及相對標準偏差（RSD）。如表2 所示，雞蛋中90 種目標物的平均回收率為60.8%～111%，RSD 為1.6%～18%。同時還考察了鴨蛋和松花蛋的加標回收率，90 種目標物在二者中的平均回收率分別為58.6%～118%、61.4%～120%，RSD 分別為0.90%～13%、1.2%～17%，符合藥物多殘留分析的要求。

2.5 方法應用

應用此方法對超市采集的106 件禽蛋樣品（包括80 件雞蛋、18 件咸鴨蛋、7 件皮蛋、1 件鵪鶉蛋）進行了檢測，結(jié)果如表3所示。共有12件樣品檢出7種禁用藥物，檢出量為0.49～22.30 μg/kg；咸鴨蛋中檢出甲硝唑、沙丁胺醇、恩諾沙星、磺胺喹啉4 種禁用藥物，檢出量為0.49～19.07 μg/kg。GB 31650-2019［1］規(guī)定甲硝唑允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出；磺胺類藥物（含甲氧芐啶）、喹諾酮類、多西環(huán)素等在產(chǎn)蛋期禁用，GB 31650.1-2022［26］規(guī)定這幾類藥物在禽蛋中的最大殘留限量為10 μg/kg，因此7件樣品存在藥物殘留超標現(xiàn)象。

表3 106件禽蛋樣品中違禁藥物的檢出情況Table 3 Detection of prohibited drugs in 106 poultry egg samples

3 結(jié) 論

本文建立了禽蛋中90 種違禁藥物的QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法。通過對前處理過程的優(yōu)化，有效降低了基質(zhì)中干擾物的影響。與現(xiàn)有方法相比，本方法實現(xiàn)了禽蛋中禁用藥物的高通量檢測，降低了檢測成本，并應用于實際樣品檢測中。該方法可用于日常禽蛋產(chǎn)品中違禁藥物的監(jiān)測，為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量安全保障提供技術(shù)支持。