改進(jìn)的QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中的丙烯酰胺

張琳昀，吉文亮，沈 菲，王鑫楠，鐘 誠，朱 峰*

（1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009；2.沃特世科技（上海）有限公司，上海 200120）

丙烯酰胺（分子式為CH2CHCONH2）是一種白色晶體，親電性強，易溶于水、三氯甲烷、乙醇及醚等溶劑中，室溫下穩(wěn)定，對生物體具有生殖毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、遺傳毒性及潛在致癌性，于1994 年被國際癌癥組織（IRAC）列為2A 類致癌物。近期有研究者發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺會影響大腦脂質(zhì)代謝引發(fā)炎癥，導(dǎo)致焦慮和抑郁［1］。2002 年瑞典科學(xué)家首次在高溫加熱的淀粉類食品中發(fā)現(xiàn)了丙烯酰胺，氨基酸、還原糖和蛋白質(zhì)在高溫烹飪過程中會發(fā)生“美拉德反應(yīng)”，產(chǎn)生副產(chǎn)物丙烯酰胺。大量研究表明，經(jīng)高溫加工的食物可能含有丙烯酰胺。我國原衛(wèi)生部2005 年發(fā)布了《關(guān)于減少丙烯酰胺可能導(dǎo)致的健康危害公告》［2］，該公告建議盡可能避免連續(xù)長時間或高溫烹飪淀粉類食品。2017年，歐盟發(fā)布了《減少食品中丙烯酰胺含量的緩解措施和基準(zhǔn)水平》指令（EU 2017/2158），該指令規(guī)定了不同食品中丙烯酰胺的基準(zhǔn)水平（40 ～ 4 000 μg/kg）［3］。2021 年韓國發(fā)布了《食品中丙烯酰胺建議規(guī)格運營計劃》，規(guī)定了各類食品中丙烯酰胺的建議限量（0.3 ～ 1 mg/kg）［4］。

蜂蜜是蜜蜂釀制的天然營養(yǎng)品，深受大眾喜愛。蜂巢或蜂箱內(nèi)的蜂蜜通常含有沙塵顆粒、結(jié)晶顆粒、蜜蜂殘留肢體、蜂蠟、花粉等微粒，可通過控制加熱提高蜂蜜的流動性，采用過濾等手段去除大部分雜質(zhì)。蜂蜜由不同的糖組成，主要是果糖和葡萄糖，以及微量元素、氨基酸、維生素、黃酮類、有機(jī)酸類等物質(zhì)。因此，蜂蜜在熱加工過程中可能會發(fā)生“美拉德反應(yīng)”產(chǎn)生丙烯酰胺。目前，有關(guān)食品中丙烯酰胺的測定研究，樣品基質(zhì)主要包括咖啡、薯片、面包、餅干、食糖、茶葉、嬰幼兒輔食等［5-8］，鮮有測定蜂蜜中丙烯酰胺的報道，因此建立蜂蜜中丙烯酰胺的測定方法具有重要意義。

食品中丙烯酰胺傳統(tǒng)的測定方法有高效液相色譜法［9］、氣相色譜-質(zhì)譜法［10］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［11］，新型的測定方法有阻抑還原光度法［12］、生物傳感法［13］、數(shù)字圖像比色法［14］、毛細(xì)管電泳法［15］。新型的檢測技術(shù)多以薯片基質(zhì)作為檢測對象，雖快速但面臨諸多挑戰(zhàn)，如其他基質(zhì)的適用性、定性定量的準(zhǔn)確性、方法推廣性等。傳統(tǒng)分析方法中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法適用于絕大多數(shù)食品基質(zhì)中丙烯酰胺的測定，靈敏度高、準(zhǔn)確性好，然而該方法多采用固相萃取柱凈化，如《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙烯酰胺的測定》（GB 5009.204-2014）［16］，不僅過程繁瑣且成本較高。近年來，QuEChERS法因操作簡單、快速、安全、成本低，在食品檢測中被廣泛使用。

由于蜂蜜的含水量低、粘稠性大，且含有大量的糖類和有機(jī)色素，其提取凈化過程十分復(fù)雜。本研究基于改進(jìn)的QuEChERS 凈化方法，建立了蜂蜜中丙烯酰胺的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該方法簡單、快速、穩(wěn)定，可實現(xiàn)復(fù)雜的蜂蜜基質(zhì)中丙烯酰胺的高效準(zhǔn)確定量，從而為蜂蜜中丙烯酰胺的安全評價提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity Premier 超高效液相色譜儀、Xevo TQ Absolute 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters 公司），ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm，美國Agilent 公司），2-16 KL 冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司），Multi Reax 渦旋振蕩器（德國Heidolph 公司），HSC-24B 氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國Fisher 公司）；氯化鈉、硫酸鈉、無水硫酸鎂、正己烷（分析純，國藥集團(tuán)）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司）；石墨化炭黑（GCB）、十八烷基吸附劑（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、強陽離子交換材料（SCX）（安普科技有限公司）；0.22 μm水相微孔濾膜（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。移取丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL，加甲醇稀釋至10 mL，使丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為10 μg/mL。臨用時用超純水將丙烯酰胺稀釋成2.0～500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其中13C3-丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為50 ng/mL。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提 取準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至1 mg）混合均勻的蜂蜜樣品于15 mL 離心管中，加入10 μg/mL的13C3-丙烯酰胺10 μL，靜置15 min；先加入10 mL超純水，渦旋振蕩提取10 min；再加入10 mL乙腈，渦旋振蕩提取10 min；隨后在離心管中加入5 g 鹽析劑（1 g 氯化鈉和4 g 硫酸鈉），渦旋振蕩2 min 后置于冷凍離心機(jī)，在0 ℃下以10 000 r/min離心5 min。取上清液待凈化。

1.3.2 凈 化取2 mL 上清液于基質(zhì)分散固相萃取凈化管中（含200 mg SCX、20 mg GCB、150 mg C18、150 mg PSA、150 mg無水硫酸鎂），渦旋振蕩5 min 后置于冷凍離心機(jī)，在0 ℃下以10 000 r/min 離心5 min。取1 mL 上清液氮吹至近干，用0.2 mL 超純水溶解提取物，過0.22 μm 水相微孔濾膜，待上機(jī)測定。

1.4 儀器條件

色譜柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：A 相為0.1%甲酸水溶液，B 相為甲醇；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫程序：0～2 min，2%B；2～4 min，2%～10% B；4～6 min，10% B；6～7 min，10%～95% B；7～8.5 min，95% B；8.5～8.6 min，95%～2% B；8.6～10 min，2% B。

檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；電離方式：電噴霧電離源正離子模式（ESI+）；脫溶劑氣溫度：600 ℃；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；去溶劑流速：1 000 L/h；錐孔流速：150 L/h；霧化氣壓力：700 kPa；碰撞氣流速：0.15 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制200 ng/mL的丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺，以5 μL/min的流速通過蠕動泵將丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)溶液直接注入質(zhì)譜儀。在以往的研究中［17］，丙烯酰胺在正離子模式下具有更好的響應(yīng)，因此，本研究采用正離子掃描模式對丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行調(diào)諧優(yōu)化。通過優(yōu)化毛細(xì)管電壓、脫溶劑氣溫度、去溶劑流速、錐孔電壓、碰撞能等參數(shù)，確定了丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的定性、定量離子，具體參數(shù)如表1所示。實驗發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺m/z為27的碎片離子比m/z為44的碎片離子響應(yīng)強，這與文獻(xiàn)報道不一致［5，11，17］，且多數(shù)文獻(xiàn)未提供實際樣本中丙烯酰胺定性離子對（m/z72＞44）的提取離子色譜圖。因此，本實驗同時監(jiān)測了丙烯酰胺的3對離子，以確定定量離子和定性離子。如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)溶液和蜂蜜樣品中丙烯酰胺離子對m/z72＞55的響應(yīng)均最強，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致［8］，但m/z72＞44的基線噪音明顯高于m/z72＞27，且在低含量本底的蜂蜜樣本中m/z72＞44 離子對無法提取到色譜峰。綜上，本研究選用m/z72＞55和m/z72＞27分別作為丙烯酰胺的定量離子對和定性離子對。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）和蜂蜜樣品（B）中丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of acrylamide and 13C3-acrylamide in standard solution（A） and honey sample（B）

表1 丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of acrylamide and 13C3-acrylamide

2.2 色譜條件的優(yōu)化

通常酸能增強ESI+模式下目標(biāo)物的響應(yīng)強度，因此本實驗采用0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。丙烯酰胺辛醇/水分配系數(shù)的對數(shù)值（logKow）為-0.67，表現(xiàn)為強極性。因此，丙烯酰胺在常規(guī)C18填料色譜柱上的保留較弱，其保留時間大多小于3 min［8，11］。由于丙烯酰胺屬于小分子極性化合物，受質(zhì)譜低質(zhì)量端噪音的干擾大，且蜂蜜樣品基質(zhì)復(fù)雜，一些小分子化合物不能完全被去除。實驗表明，丙烯酰胺的提取離子色譜圖上存在干擾峰，影響定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此考察了Atlantis dC18（2.1 mm×150 mm，5 μm）、ACQUITY HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）3 種色譜柱對丙烯酰胺的保留效果，發(fā)現(xiàn)前兩種色譜柱對丙烯酰胺的保留效果較差（均小于3 min），干擾峰與目標(biāo)峰不能完全基線分離；而丙烯酰胺在ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18上的保留時間在6 min左右，因此選擇該色譜柱進(jìn)行分離。

柱溫會影響目標(biāo)物在色譜柱上的吸附/解吸附過程，進(jìn)而影響分離度，因此比較了不同柱溫（20、25、30、40 ℃）下丙烯酰胺的色譜保留情況。實驗發(fā)現(xiàn)溫度對丙烯酰胺的色譜峰峰形無顯著影響，上述溫度下丙烯酰胺的保留時間分別為6.43、6.24、6.03、5.67 min。柱溫為40 ℃時，丙烯酰胺目標(biāo)峰與干擾峰未完全分離，當(dāng)溫度≤30 ℃時，干擾峰與目標(biāo)峰完全基線分離，因此選擇柱溫為30 ℃。

2.3 提取方法的選擇

丙烯酰胺的極性強，易溶于水和乙腈。采用體積比為1∶1 的水和乙腈溶液稀釋丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，加入鹽析劑，結(jié)果表明97%的丙烯酰胺進(jìn)入了乙腈層，表明丙烯酰胺可以采用QuEChERS 法提取，即采用鹽析法將目標(biāo)分析物從水相層轉(zhuǎn)入乙腈層，提取液供進(jìn)一步凈化處理。由于蜂蜜含水量較低、黏性大，無法直接采用有機(jī)溶劑提取，本研究首先加入水將蜂蜜溶解分散，再加入乙腈沉淀蛋白，并與水形成混合提取溶劑提取丙烯酰胺；加入鹽析劑使水和乙腈分層，采用冷凍離心的方式，使蛋白沉淀不易進(jìn)入乙腈層，部分水溶性雜質(zhì)可留在水層，丙烯酰胺則進(jìn)入乙腈層，起到初步分離凈化的目的，上層乙腈提取液供QuEChERS凈化處理。

2.4 凈化方法的優(yōu)化

QuEChERS 法常用的凈化填料為GCB、C18、PSA，并加入少量無水硫酸鎂除水。其中，GCB 可去除色素等非極性干擾物；C18可去除脂、固醇等非極性干擾物；PSA 可去除糖類、有機(jī)酸、色素等極性干擾物。本研究對QuEChERS法作了改進(jìn)，增加一種強陽離子交換材料，以去除堿性化合物。比較了4種凈化填料（SCX、GCB、C18、PSA）用量對蜂蜜樣品中丙烯酰胺的凈化效果。

2.4.1 SCX 用量的優(yōu)化保持凈化填料GCB（20 mg）、C18（150 mg）、PSA（150 mg）、無水MgSO4（150 mg）用量不變，考察了SCX不同用量（50、100、150、200 mg）對基質(zhì)干擾去除的影響。如圖2所示，當(dāng)SCX 用量為50 mg 時，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的色譜峰無法被觀察到。隨著SCX 的用量增加，丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的色譜峰能夠被觀察到。SCX 的用量為100 mg 和150 mg 時，13C3-丙烯酰胺提取離子色譜圖中的雜質(zhì)峰較多且強度高，丙烯酰胺的兩對提取離子色譜峰（m/z72＞55和72＞27）受雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重，峰形較差。SCX 的用量為200 mg 時，丙烯酰胺同位素提取離子色譜圖中的雜質(zhì)峰降低明顯，峰形以及相對峰高得到了明顯提高，丙烯酰胺的兩對提取離子峰的峰形明顯改善。綜上所述，加入SCX填料能有效去除蜂蜜樣品中雜質(zhì)對目標(biāo)峰的干擾，其最佳用量為200 mg。

圖2 SCX用量對丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺提取離子色譜圖的影響Fig.2 Influences of different SCX amounts on the extracted ion chromatograms of acrylamide and 13C3-acrylamide SCX amount（A～D）：50，100，150，200 mg

2.4.2 GCB 用量的優(yōu)化保持凈化填料SCX（200 mg）、C18（150 mg）、PSA（150 mg）、無水MgSO4（150 mg）用量不變，考察了GCB 用量（10、20、50、100 mg）對基質(zhì)干擾去除的影響。結(jié)果表明，GCB 的用量增加不影響丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的峰形，考慮到不同蜂蜜樣本的色素含量有差異，本研究選擇GCB用量為20 mg。

2.4.3 C18與PSA 用量的優(yōu)化保持凈化填料SCX（200 mg）、GCB（20 mg）、無水MgSO4（150 mg）用量不變，考察了C18和PSA 用量（C18和PSA 各50、100、150、200 mg）對基質(zhì)干擾去除的影響。結(jié)果顯示，C18和PSA用量均為50 mg或100 mg時，雖然雜質(zhì)對13C3-丙烯酰胺的干擾影響最小，當(dāng)用量為150 mg時，丙烯酰胺的兩對提取離子（m/z72＞55和72＞27）色譜峰形及干擾峰得到明顯改善，當(dāng)PSA 和C18用量均增至200 mg 時，丙烯酰胺的兩對提取離子色譜峰的峰形變差。綜合考慮，選擇PSA 和C18的用量均為150 mg，各提取離子的色譜峰峰形最佳、雜質(zhì)干擾影響小。

綜上所述，最終選用SCX（200 mg）、GCB（20 mg）、C18（150 mg）、PSA（150 mg）、無水MgSO4（150 mg）作為凈化填料。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由于待分析樣品溶液中的雜質(zhì)在離子電離時與目標(biāo)分析物產(chǎn)生競爭或改變噴霧液滴的表面張力和粘度，從而影響目標(biāo)化合物的電離程度，通常表現(xiàn)為基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強效應(yīng)。由于丙烯酰胺在蜂蜜樣品中普遍存在，因此本實驗采用13C3-丙烯酰胺考察基質(zhì)效應(yīng)。按照“1.3”對樣品進(jìn)行前處理（不加入同位素內(nèi)標(biāo)），獲得蜂蜜基質(zhì)溶液，分別用該基質(zhì)溶液和純水將13C3-丙烯酰胺逐級稀釋成2.0 ～ 100 ng/mL 的同位素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別將基質(zhì)溶液和純水配制的兩組13C3-丙烯酰胺同位素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照濃度從低到高依次進(jìn)樣，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)效應(yīng)（ME）計算公式如下：ME（%）=k1/k2×100，其中k1和k2分別為13C3-丙烯酰胺的基質(zhì)曲線和純?nèi)軇┣€的斜率。當(dāng)ME 為100%時，表明無基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME為＜100%或＞100%時，分別表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)或基質(zhì)增強效應(yīng)。本實驗的ME為77.4%，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。由于前處理過程中丙烯酰胺存在絕對損失，實驗采用13C3-丙烯酰胺消除前處理過程中目標(biāo)分析物的絕對損失以及基質(zhì)抑制效應(yīng)的影響。

2.6 方法學(xué)數(shù)據(jù)的考察

用超純水將丙烯酰胺稀釋成2.0 ～ 500 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其中13C3-丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為50 ng/mL，采用本方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，丙烯酰胺在2.0 ～ 500 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 7。將低本底蜂蜜樣品按本方法進(jìn)行樣品前處理和測定，獲得丙烯酰胺的本底值以及信噪比（S/N）值，按照S/N分別為3 和10 計算并獲得丙烯酰胺的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）分別為0.42 μg/kg和1.38 μg/kg。

對低本底蜂蜜樣品（2.5 μg/kg），按照低、中、高（2、10、100 μg/kg）3個水平進(jìn)行加標(biāo)實驗，每個濃度水平平行測定6 次。由表2 可知，丙烯酰胺在3 個加標(biāo)水平下的平均回收率為89.2% ～ 96.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.2% ～ 4.2%。

表2 丙烯酰胺的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of acrylamide（n=6）

2.7 實際樣品檢測

在江蘇省13 個地市的超市、零售店以及網(wǎng)店購買30 份蜂蜜，從產(chǎn)地上看，其中29 份樣品產(chǎn)自我國浙江、江蘇、廣西、上海、河北、遼寧、福建、安徽，1份樣品產(chǎn)自新西蘭；根據(jù)蜜源植物可分為：洋槐蜂蜜、棗花蜂蜜、紫云英蜂蜜、白玉枇杷蜂蜜和油菜花蜂蜜。采用本方法對30 份蜂蜜進(jìn)行測定，丙烯酰胺的檢出率為100%，含量為2.5～40.4 μg/kg，實際樣品的色譜圖見圖1B。由于原料蜜除雜過程一般需加熱，導(dǎo)致30 份蜂蜜樣品均檢出丙烯酰胺，但該熱加工工藝的溫度一般較低（40～65 ℃），所以蜂蜜中丙烯酰胺的含量整體較低，最高僅40.4 μg/kg。歐盟EU 2017/2158 指令規(guī)定嬰幼兒食品中丙烯酰胺的基準(zhǔn)值為40 μg/kg［3］，本研究的測定結(jié)果顯示，蜂蜜樣品中丙烯酰胺含量處于較低水平，但仍需給予關(guān)注。

3 結(jié) 論

本研究在傳統(tǒng)QuEChERS 法基礎(chǔ)上增加一種強陽離子交換材料作為凈化材料，基于改進(jìn)的QuEChERS 法，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了蜂蜜樣品中丙烯酰胺的測定方法。該方法簡單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好。經(jīng)過優(yōu)化后的凈化材料能顯著降低蜂蜜中雜質(zhì)的干擾，同時選用分離效果更為高效的色譜柱，進(jìn)一步減少了雜質(zhì)對目標(biāo)峰的干擾，確保定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該方法的建立可彌補蜂蜜中丙烯酰胺相關(guān)檢測方法的缺失，可為蜂蜜中丙烯酰胺的暴露評估提供技術(shù)支撐，從而保障廣大消費者“舌尖上的安全”。