基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜對(duì)西藏不同產(chǎn)地甘青青蘭的差異性成分分析

段婷引，達(dá)娃卓瑪，蘭 鈞，李雪敏，張夢(mèng)姣，周 燕，鄧 放*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137；2.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院 中藥（藏藥）質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000；3.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041）

藏藥材甘青青蘭（Dracocephalum tanguticum Herba）又名“唐古特青蘭”“隴塞青蘭”，藏語(yǔ)名為“則羊古”［1］，為唇形科（Labiatae）青蘭屬（Dracocephalum）植物甘青青蘭（Dracocephalum tanguticumMaxim.）的干燥地上部分［2］，生長(zhǎng)于海拔1 900～4 000 米的干燥河谷河岸、田野、草灘或松林邊緣。其莖細(xì)，葉小青色、花為藍(lán)色，具有清肝熱、止血、愈瘡、干黃水等功效［1］。甘青青蘭的化學(xué)成分復(fù)雜，含有揮發(fā)性成分、多糖類、黃酮類、萜類及有機(jī)酸類成分［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明甘青青蘭具有抗氧化、抗缺氧、抑菌、抗病毒和保肝等活性［4］。

目前，對(duì)甘青青蘭的化學(xué)成分研究主要采用溶劑提取、柱層析分離制備結(jié)合核磁鑒定的方法，該方法繁瑣、耗時(shí)耗力［5］。近年來，隨著氣相色譜和液相色譜在藥材成分分析中的廣泛應(yīng)用，特別是液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于化學(xué)成分分析，具有高選擇性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，可提供化合物結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)甘青青蘭化學(xué)成分的快速鑒定。甘青青蘭雖在藏東、藏南、川西、青東和甘南均有分布，但青藏高原才是道地產(chǎn)區(qū)及核心產(chǎn)區(qū)，根據(jù)資源普查結(jié)果，西藏至少有44個(gè)縣區(qū)分布著甘青青蘭［1］。本研究收集了藏東、藏南部分地區(qū)的甘青青蘭，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q/Orbitrap HRMS）技術(shù)對(duì)不同地區(qū)甘青青蘭的差異性化學(xué)成分進(jìn)行分析，以期為甘青青蘭質(zhì)量控制研究及資源開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；BSA124S萬分之一天平（德國(guó)Sartorius公司）；BT25S型十萬分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；PCWJ-10超純水機(jī)（成都品成科技有限公司）；SK3300HP型數(shù)控超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

乙腈（色譜純）、甲酸（質(zhì)譜純）均購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司；純凈水（陜西娃哈哈乳品有限公司制造）；對(duì)照品：迷迭香酸（MUST-21111817）、金合歡素（MUST-22100813）、丹酚酸B（MUST-22101219）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（PCS-200313）、新綠原酸（PCS-220404）、木犀草苷（PCS-200816）、隱綠原酸（PCS-220912）、蒙花苷（PCS0629）均購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷（wkq22072903）購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；綠原酸（PS0131-0025）、香葉木苷（PS012991）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，以上對(duì)照品純度均不低于98%。

1.2 樣 品

甘青青蘭樣品共采集41 批，其中山南市11 份、拉薩市10 份、昌都市20 份，均為一年生，夏季7月采收。不同來源的干燥樣本的葉子數(shù)量略有差異，且各自的粉末顏色與細(xì)膩程度也有差別，其中以昌都樣本葉子最多，粉末最為細(xì)膩且為嫩綠色，山南市樣本莖枝最多，粉末較為粗糙，有較多粗纖維，顏色為淺棕色。經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院格桑巴珠副主任藥師鑒定為唇形科青蘭屬植物甘青青蘭Dracocephalum tanguticumMaxim.干燥地上部分。

1.3 溶液配制

1.3.1 對(duì)照品溶液的配制取上述對(duì)照品適量置于10 mL量瓶中，加入二甲基亞砜溶解后，用甲醇定容制備成1.0 mg/mL 的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各儲(chǔ)備液適量，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容、搖勻，得各對(duì)照品質(zhì)量濃度均約為10 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

表1 甘青青蘭樣品采集信息Table 1 Collection informations of Ganqingqinglan samples

1.3.2 供試品溶液的制備取甘青青蘭適量，粉碎，過二號(hào)篩，精密稱定0.50 g，加入70%甲醇25 mL，超聲提取60 min，冷卻至室溫后補(bǔ)足失重，搖勻，過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。取供試品溶液各1 mL，等容混勻，過0.22 μm濾膜，即得QC樣本溶液。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B 為乙腈，梯度洗脫：0～2 min，5%～10% B；2～6 min，10%～15% B；6～17.5 min，15% B；17.5～18 min，15%～19% B；18～21 min，19%～25% B；21～26 min，25%～30% B；26～31 min，30%～90%B。柱溫為40 ℃，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式檢測(cè)。噴霧電壓：3.5 kV（+）、3.2 kV（-）；鞘氣（N2）：8 L/min（+）、16 L/min（-）；輔助氣（N2）：2 L/min（+）、3 L/min（-）；離子傳輸管溫度：320 ℃；離子透鏡電壓（S-LensRF Level）：55；歸一化碰撞能（NCE%）：20、40、60；檢測(cè)方式：全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描（Full MS/ddMS2），一級(jí)分辨率為70 000，二級(jí)分辨率為17 500；質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1 500。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 化合物鑒定采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS 分別在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)和采集數(shù)據(jù)，得到總離子流圖。首先，檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，整理甘青青蘭及其種屬的已知化學(xué)成分，構(gòu)建甘青青蘭的化學(xué)成分信息表。同時(shí)，采用Xcalibur 軟件采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，Compound Discoverer 3.2 軟件進(jìn)行分析處理，選用天然產(chǎn)物未知化合物鑒定模板，對(duì)未知化合物進(jìn)行分子式擬合，并根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)碎片離子信息等結(jié)合Chemspider 和mzCloud 等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片信息，進(jìn)行相關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)的推導(dǎo)，總結(jié)出特征碎片，并通過比對(duì)對(duì)照品、參考相關(guān)文獻(xiàn)和利用MassFrontier 8.0質(zhì)譜解析軟件對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。

1.5.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將41 批甘青青蘭質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.2 軟件進(jìn)行處理，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA14.1 軟件，通過主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對(duì)各產(chǎn)地的甘青青蘭樣本進(jìn)行比較，以變量對(duì)模型的重要性（VIP）值大于1且P＜0.05作為條件篩選差異化合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘青青蘭化學(xué)成分分析

實(shí)驗(yàn)前期，對(duì)甘青青蘭的提取溶劑、流動(dòng)相及洗脫梯度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)以70%甲醇提取，采用“1.4.1”的色譜條件進(jìn)行洗脫，所得的總離子流圖峰形良好且離子峰分離較好（見圖1）。

圖1 甘青青蘭樣品（A、B）與對(duì)照品（C、D）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Ganqingqinglan samples（A，B） and reference samples（C，D）

通過UPLC-Q-Qrbitrap HRMS 分析技術(shù)，從甘青青蘭中共鑒定出73 種化合物，包括黃酮類化合物41種，有機(jī)酸類15種，氨基酸類8種，其他類9種，其中11種成分由對(duì)照品比對(duì)鑒定。

2.2 主成分分析

對(duì)Compound Discoverer 3.2軟件分析出的化合物進(jìn)行過濾，以變異系數(shù)CV＜50%作為篩選條件，最終得到3 085個(gè)化合物特征離子。將41批甘青青蘭樣本及6個(gè)QC 樣本數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA14.1軟件進(jìn)行主成分分析（圖2A）。圖中QC 樣本聚集于模型中央，證明采用的樣品處理和儀器分析方法穩(wěn)定，且重復(fù)性良好。山南市樣本、拉薩市樣本、昌都市樣本各自成組，這也與甘青青蘭樣本的葉子數(shù)量和粉末顏色深淺相關(guān)。甘青青蘭中黃酮類化學(xué)成分占比最多，而黃酮類成分合成受光照強(qiáng)度影響較大，山南地區(qū)山高谷深，年平均日照數(shù)最少，拉薩市、昌都市次之，但昌都市水資源豐富且氣候區(qū)域性差異大，日溫差大適合植物積累養(yǎng)分，有利于甘青青蘭生長(zhǎng)，因此推測(cè)光照日長(zhǎng)與日溫差對(duì)甘青青蘭化學(xué)成分及其性狀有影響。

圖2 不同地區(qū)甘青青蘭的PCA得分圖（A）、OPLS-DA得分圖（B）、隨機(jī)置換檢驗(yàn)圖（C）及兩組間的OPLS-DA得分圖（D～F）Fig.2 PCA score plot（A），OPLS-DA score plot（B），permutation test plot（C） of Ganqingqinglan samples from different regions and OPLS-DA score plots between the two groups（D-F）

2.3 OPLS-DA分析

對(duì)3組樣本進(jìn)行有監(jiān)督OPLS-DA分析（圖2B），其模型參數(shù)R2X=0.824，R2Y=0.982，Q2=0.969。對(duì)模型進(jìn)行200 次隨機(jī)置換檢驗(yàn)（圖2C），檢驗(yàn)參數(shù)R2X=0.034 9＜1，Q2=-0.592＜0.05，證實(shí)所建OPLSDA 模型可解釋和預(yù)測(cè)能力高，擬合良好。將3組樣本進(jìn)行兩兩比較，并結(jié)合VIP＞1，P＜0.05篩選變化顯著的差異代謝物。在SN 與LS兩組樣本間共篩選鑒定出11個(gè)差異化合物（圖2D），SN 與CD 兩組樣本間共篩選鑒定出18個(gè)差異化合物（圖2E），LS與CD 兩組樣本間共篩選鑒定出21個(gè)差異化合物（圖2F）。大多數(shù)差異化合物為黃酮類及有機(jī)酸類化合物（表2）。綠原酸、金合歡素、柳穿魚黃素是3組樣本共同的差異化合物，以相對(duì)峰面積作為計(jì)算數(shù)值，其中綠原酸在三組之間的含量差別最大，在CD組含量最高（約為11.85 mg/g），LS 組次之（約為7.85 mg/g），SN 組最低（約為5.30 mg/g），推測(cè)光照時(shí)長(zhǎng)與日溫差對(duì)甘青青蘭合成綠原酸的影響較大。綠原酸在甘青青蘭中的含量較為豐富［2］且具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及保肝的作用［16-17］。從公元8 世紀(jì)開始，甘青青蘭清肝熱的功效就已被世人承認(rèn)，到公元17世紀(jì)還發(fā)現(xiàn)其具有止血、干黃水、收斂傷口等功效［1］，因此推測(cè)綠原酸是甘青青蘭的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一?！毒е楸静荨分刑岬剑骸扒嗵m陰陽(yáng)二坡皆生?！蔽鞑囟喔呱?，陰坡處甘青青蘭葉子少，陽(yáng)坡處葉子多，可見地理環(huán)境的差異可能對(duì)甘青青蘭的性狀及化學(xué)成分有顯著影響。

（續(xù)表2）

3 結(jié) 論

本研究采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS 技術(shù)聯(lián)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)3 批西藏不同地區(qū)甘青青蘭樣本進(jìn)行分析，從甘青青蘭中共鑒定出73 種化合物，包括黃酮類化合物41 種，有機(jī)酸類15 種，氨基酸類8 種，其他類9 種，并且發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的甘青青蘭樣本化學(xué)成分存在差異，結(jié)合不同地區(qū)地理環(huán)境，推測(cè)光照日長(zhǎng)及日溫差對(duì)甘青青蘭化學(xué)成分有影響。綠原酸是不同地區(qū)甘青青蘭樣本中含量差異較大的化合物，同時(shí)也是含量較為豐富的化學(xué)成分之一，因此推測(cè)綠原酸是甘青青蘭的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，而產(chǎn)地差異可能會(huì)影響甘青青蘭質(zhì)量。以上數(shù)據(jù)可為甘青青蘭的質(zhì)量控制及后續(xù)合理開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。