氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定三七中212種農(nóng)藥殘留

王一帆，吳易峰，徐敦明*，陳達(dá)捷，鄭文杰，季 超

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.廈門海關(guān)技術(shù)中心，福建 廈門 361026；3.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300382；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091）

三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖，具有散瘀止血、消腫止痛之功效［1］，素有“南國(guó)神草”、“金不換”等美譽(yù)，產(chǎn)自云南、廣西等地［2-3］。三七也是我國(guó)民間最早使用的藥食兩用中藥材之一，被國(guó)家衛(wèi)健委納入可用于保健食品的物品名單中［4］。近年來(lái)由于全球盛起的中藥材熱潮及其在新冠疫情中發(fā)揮的重要作用，中藥材的銷量大幅增加［5-6］。但農(nóng)藥殘留問(wèn)題一直阻礙著中藥材進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)［7-8］。魏丹等［9］通過(guò)磁性親水親脂平衡萃取材料輔助基質(zhì)固相分散萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定中藥材中的76 種農(nóng)藥，在1 個(gè)金銀花樣品中檢出多菌靈。由于三七的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、性喜溫濕環(huán)境，易引起細(xì)菌滋生和病蟲害［10］。雖然三七早已采用人工種植且栽培技術(shù)不斷進(jìn)步［11］，但農(nóng)藥不規(guī)范使用現(xiàn)象始終存在，難以符合市場(chǎng)對(duì)三七的質(zhì)量要求。因此，研究三七中多農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)對(duì)于改善三七市場(chǎng)和控制品質(zhì)有重要意義。

目前，三七的用藥以病害防治為主，蟲害防治為輔［12-13］，主要涉及腐霉利、嘧菌胺、烯酰嗎啉、克菌丹等農(nóng)藥。世界范圍內(nèi)與三七相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)有美國(guó)藥典［14］、歐盟藥典［15］、韓國(guó)藥典［16］和日本藥典［17］等。我國(guó)除《中國(guó)藥典》［18］外，也有GB/T 19086-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 文山三七》［19］、T/CATCM 003-2017《無(wú)公害三七藥材及飲片的農(nóng)藥殘留與重金屬及有害元素殘留限量》［20］、GB 2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［21］等其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于三七中多農(nóng)殘的檢測(cè)技術(shù)有氣相色譜法（GC）及液相色譜法（LC）等。氣相色譜法適合熱不穩(wěn)定性農(nóng)藥，對(duì)于極性強(qiáng)、難揮發(fā)的農(nóng)藥普遍采用液相色譜［22］。張飛［23］利用GC 法對(duì)三七中 38 種農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果良好。張舉成等［24］通過(guò)LC 法對(duì)三七中6種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，均有較好的線性關(guān)系。色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有更強(qiáng)的抗干擾能力、更高的靈敏度和更好的選擇性，可對(duì)定性困難、低濃度目標(biāo)化合物進(jìn)行測(cè)定，為基質(zhì)復(fù)雜、背景干擾嚴(yán)重的中藥材農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供了技術(shù)保障［25］。Fu 等［26］采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）檢測(cè)了三七及其種植土壤中201 種農(nóng)藥，在三七和土壤中分別檢出29 種和15 種農(nóng)藥殘留，但其前處理耗時(shí)較長(zhǎng)，不適宜日常監(jiān)測(cè)。Duan 等［27］利用GC-MS/MS 測(cè)定了三七中有機(jī)氯、有機(jī)磷和擬除蟲菊酯等116 種農(nóng)藥，方法靈敏度高，重復(fù)性好，但其檢測(cè)物質(zhì)較少，目標(biāo)組分無(wú)法涵蓋三七中可能出現(xiàn)的所有農(nóng)藥。因此，迫切需要開發(fā)一種新的多農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法，以滿足中藥材三七的日常監(jiān)測(cè)需求。

本研究從上述標(biāo)準(zhǔn)及GB 23200.113-2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》［28］入手，建立了同時(shí)檢測(cè)212 種農(nóng)藥殘留的GC-MS/MS 法。樣品采用FaPEx-BKT50 固相萃?。⊿PE）柱凈化，該柱中含有的PSA、C18、HLB、GCB 等吸附劑可有效去除三七中脂類、糖類、揮發(fā)油類以及色素等物質(zhì)，很好地解決三七基質(zhì)復(fù)雜、凈化難的問(wèn)題，且操作簡(jiǎn)單、可批量處理、節(jié)省時(shí)間，滿足日常監(jiān)測(cè)的需求。該方法操作簡(jiǎn)單高效，分離凈化效果好，成本低，且靈敏度高、選擇性好，可為三七藥材中多農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

TQ-8040氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電子轟擊（EI）源，日本島津公司）；ST16R 冷凍臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)ThermoFisher 公司）；Supelco 24 位固相萃取儀（美國(guó)Merck 公司）；N-EVAP-24 氮吹儀（美國(guó)Organomation 公司）；SIGMA3-18KS 高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；MTV-100 多管旋渦混合儀（杭州奧盛儀器有限公司）；MS3 圓周振蕩器（德國(guó)IKA 公司）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波有限公司）；CPA225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；SF1130中藥分析研磨機(jī)（長(zhǎng)沙中南制藥機(jī)械廠）。

1.2 材料與試劑

乙腈、乙酸乙酯、甲苯（色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；無(wú)水硫酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），中性氧化鋁柱（50 mg/3 mL，Supelco 公司），F(xiàn)aPEx-BKT50 SPE 柱（50 mg/3 mL，巨研科技有限公司）。212種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品名稱見表1，購(gòu)自天津阿爾塔公司。

表1 212種農(nóng)藥的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometry parameters of 212 pesticides

三七塊莖樣品購(gòu)于市場(chǎng)及藥店，將其充分研磨成細(xì)粉狀，儲(chǔ)存在鋁箔拉鏈袋中，置于涼爽干燥的環(huán)境溫度下備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 樣品前處理稱取5.0 g（精確至0.01 g）三七粉于50 mL 離心管中，加入15 mL 去離子水混勻，浸泡靜置30 min，加入15 mL 乙腈-乙酸乙酯（1∶3，體積比），混勻后振蕩提取20 min，加入6 g 無(wú)水硫酸鈉，4 ℃ 下8 000 r/min 離心5 min，取上清液待凈化。

用6 mL 乙酸乙酯潤(rùn)洗FaPEx-BKT50 SPE 柱，取10 mL 上述上清液過(guò)柱，收集流出液，用10 mL 乙腈-甲苯（3∶1，體積比）洗脫SPE 柱，收集洗脫液緩慢氮吹近干，用1 mL 乙酸乙酯定容，振蕩混勻裝瓶待用。

1.3.2 色譜條件色譜柱：Restek Rxi-5silMS 柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：60 ℃保持1 min，以25 ℃/min 加熱至180 ℃，再以10 ℃/min 加熱至310 ℃并保持10 min；載氣：氦氣（He），流速為1.2 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，吹掃時(shí)間為1 min。

1.3.3 質(zhì)譜條件電子轟擊離子源（EI）；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：300 ℃；離子源溫度：230 ℃；離子監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；212種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定性離子、定量離子和碰撞能量等參數(shù)見表1。

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化目前三七的提取溶劑主要有乙腈、0.1%乙酸-乙腈、1%乙酸-乙腈等。乙腈是農(nóng)藥殘留的常用提取溶劑［29］。在乙腈中加入乙酸乙酯不僅可提高非極性農(nóng)藥的提取效率，而且有助于兩相體系的形成，在一定程度上利于去除三七中的極性干擾成分。以三七中常見的8 種不同極性農(nóng)藥為代表，分別考察了乙腈、乙腈-乙酸乙酯（1∶1）、乙腈-乙酸乙酯（1∶3）和乙腈-乙酸乙酯（3∶1）4種提取體系的提取效果（見圖1）。結(jié)果表明，在 100 μg/kg添加水平下，4種提取體系的提取效果差異較明顯，相對(duì)于純乙腈，乙腈-乙酸乙酯可使目標(biāo)組分的回收率普遍提高，當(dāng)提取溶劑為乙腈-乙酸乙酯（1∶3）時(shí)，目標(biāo)組分的回收率最好。因此，選用乙腈-乙酸乙酯（1∶3）作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的提取效果對(duì)比Fig.1 Comparison on extraction effects of pesticides with different extractants

2.1.2 其它條件的選擇三七的含水量低，為保證最佳提取效果，通常會(huì)減少樣品量并添加水溶液進(jìn)行浸泡［30］。目前大多數(shù)的研究表明最佳浸泡時(shí)間為30 min［31］。因此本研究選取浸泡時(shí)間為30 min。中藥材的主要提取方式有超聲提?。?2］和振蕩提取等。目前大多數(shù)研究選用振蕩提取。因此本研究采用振蕩提取方式。

2.1.3 凈化條件的選擇在用無(wú)水硫酸鈉清除水分的條件下，分別考察了中性氧化鋁小柱和FaPEx-BKT50 SPE柱對(duì)三七中8種代表性農(nóng)藥的凈化效果。FaPEx-BKT50 SPE柱中含有多種吸附劑，其中PSA可去除基質(zhì)中的有機(jī)酸、糖類等極性干擾物；C18可有效去除基質(zhì)中的脂類、固醇等非極性干擾物；HLB 可去除基質(zhì)中的部分葉綠素、磷脂和揮發(fā)油；GCB 可有效去除基質(zhì)中的色素。結(jié)果表明，F(xiàn)aPEx-BKT50 SPE 柱中的PSA、C18、GCB 以及HLB 等組分對(duì)三七的凈化效果更強(qiáng)，顏色去除更明顯，且目標(biāo)組分的回收率相對(duì)較高?？紤]到連續(xù)大量進(jìn)樣會(huì)對(duì)色譜柱和儀器造成損害及污染，最終采用FaPEx-BKT50 SPE柱作為凈化條件。

2.1.4 洗脫試劑的選擇分別考察了乙酸乙酯、乙腈-甲苯（3∶1）和乙腈-乙酸乙酯（1∶3）作為洗脫試劑時(shí)對(duì)8種代表性農(nóng)藥提取效果的影響。結(jié)果表明，乙腈-甲苯（3∶1）作為洗脫試劑時(shí)的提取效果最好，因此選擇乙腈-甲苯（3∶1）作為洗脫試劑。

2.1.5 洗脫體積的選擇考察了洗脫體積分別為4、6、10 mL 時(shí)對(duì)8 種代表性農(nóng)藥提取效果的影響。結(jié)果表明，洗脫體積為10 mL時(shí)的提取效果最好。因此，選擇洗脫體積為10 mL。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)GC-MS/MS母離子和子離子一一對(duì)應(yīng)的MRM 模式，通過(guò)設(shè)定多個(gè)時(shí)間段和掃描通道同時(shí)分析多種農(nóng)藥成分，先通過(guò)GC對(duì)其進(jìn)行分離和全掃描，確定農(nóng)藥的出峰時(shí)間和一級(jí)碎片離子。選擇離子強(qiáng)度高的一級(jí)碎片離子作為母離子，應(yīng)用電子轟擊掃描模式對(duì)母離子在不同碰撞能量下進(jìn)行二次電離，選擇信號(hào)較強(qiáng)的二級(jí)碎片離子作為子離子，以產(chǎn)生信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)的碰撞能量作為最優(yōu)碰撞能量，優(yōu)化后的條件見表1。在此條件下，212種農(nóng)藥的總離子流圖（TIC）如圖2。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是痕量目標(biāo)物質(zhì)譜分析的常見現(xiàn)象。采用下式計(jì)算每種化合物的基質(zhì)效應(yīng)：ME=［（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）-1］× 100%。結(jié)果顯示，僅有18 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)不明顯（＜20%），如滅蟻靈、三氯殺螨砜、甲氰菊酯、β-硫丹等；92 種農(nóng)藥產(chǎn)生中等的基質(zhì)抑制效應(yīng)（20%～50%），如殘殺威、益棉磷、氯苯嘧啶醇、敵草胺等；102 種農(nóng)藥產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)（≥50%），如噠嗪硫磷、苯醚菊酯、氯菊酯、溴氰菊酯、喹禾靈等。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析。

2.4 方法性能評(píng)價(jià)

在10～200 μg/L范圍內(nèi)，根據(jù)不同定量下限將基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取一定量該溶液，用乙酸乙酯逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?？瞻谆|(zhì)溶液氮?dú)獯蹈珊?，分別加入1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶，得到系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用本方法測(cè)定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，212種農(nóng)藥在10～200 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999，檢出限（S/N=3，LOD）和定量下限（S/N=10，LOQ）分別為0.003～0.02 mg/kg和0.01～0.05 mg/kg（見表2）。

表2 212種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Correlation coefficients（r2），LODs，LOQs，spiked recoveries and RSDs of 212 pesticide residues（n=6）

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于三七的農(nóng)藥最大殘留限量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)主要以藥典為主?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定了33 種禁限用農(nóng)藥的MRL值；《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（10th）［33］對(duì)20種農(nóng)藥進(jìn)行了規(guī)定，其MRL值為0.05～1.00 mg/kg；《臺(tái)灣藥典》（3th）［34］、《歐盟藥典》（10th）、《美國(guó)藥典》（USP44）、《韓國(guó)藥典》（10th）和《日本藥典》（18th）規(guī)定了與三七同科的人參中農(nóng)藥的MRL 值。本研究中212 種農(nóng)藥的LOQ 為0.01～0.05 mg/kg，均低于中國(guó)（0.01～5 mg/kg）、歐盟（0.01～4 mg/kg）、美國(guó)（0.01～4 mg/kg）、韓國(guó)（0.01～5 mg/kg）和日本（0.01～75 mg/kg）建立的MRL值。

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白樣品中準(zhǔn)確添加0.02、0.04、0.1 mg/kg 三水平的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度做6次平行實(shí)驗(yàn)（見表2）。結(jié)果表明，212 種農(nóng)藥的平均回收率為60.0%～121%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.90%～31%。

2.6 實(shí)際樣品分析

為驗(yàn)證本方法的實(shí)用性并了解市售三七中農(nóng)藥殘留情況，采用本方法對(duì)采自藥店、藥材市場(chǎng)及種植地等的66批三七藥材進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，66批樣品中均檢出多種農(nóng)藥。從農(nóng)藥種類來(lái)看，共檢出40 種農(nóng)藥，以腐霉利、毒死蜱、六氯苯、嘧菌胺和烯酰嗎啉等檢出最多，檢出率分別為79.3%、72.1%、75.8%、62.5%、60.9%，其中毒死蜱的最高殘留量達(dá)324 μg/kg，腐霉利的最高殘留量達(dá)64μg/kg，烯酰嗎啉的最高殘留量達(dá)1 023 μg/kg。從種植地區(qū)來(lái)看，所有林下種植的三七農(nóng)藥殘留普遍較少，每批檢出農(nóng)藥在5 ～ 10種之間；農(nóng)田種植的三七農(nóng)藥殘留檢出較多，其中62%的樣品檢出13～25種農(nóng)藥。整體來(lái)看，雖然林下種植的三七農(nóng)藥殘留相對(duì)較少，但無(wú)論是農(nóng)田種植或是林下種植，三七中毒死蜱、腐霉利、六氯苯的檢出率均較高，應(yīng)引起重點(diǎn)關(guān)注和防控，從而提升中藥材三七的品質(zhì)。

3 結(jié) 論

本研究建立了GC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定三七中212 種農(nóng)藥的檢測(cè)方法。針對(duì)三七色素多、基質(zhì)雜的特點(diǎn)，選用FaPEx-BKT50固相萃取柱進(jìn)行前處理，除雜效果好，凈化更徹底。本方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，一次性前處理可同時(shí)檢測(cè)多種農(nóng)藥，為中藥材三七的農(nóng)殘檢測(cè)提供了一種切實(shí)可行的方法。