QuEChERS/超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法篩查鮮桃中的農(nóng)藥殘留

郭巧珍，楊 奕，劉麗萍，陳紹占，張 晶

（北京市疾病預防控制中心 食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京 100013）

桃以其香甜的味道和豐富的營養(yǎng)成分成為世界上最受歡迎的水果之一。根據(jù)《2020 中國果品產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告》統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2019年我國的桃種植面積和產(chǎn)量均居世界第1位［1］。桃的果實成熟期主要在高溫高濕的夏季，病蟲害發(fā)生率極高。為保障果實品質(zhì)和產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用必不可少［2］。農(nóng)藥殘留問題是桃類水果面臨的主要挑戰(zhàn)，也是國內(nèi)外最受關注的食品安全問題之一。GB 2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［3］中規(guī)定了376種（類）食品中564種農(nóng)藥的限量，其中涉及桃的有178種。有針對性地開展農(nóng)藥殘留風險監(jiān)測是保障農(nóng)產(chǎn)品安全的重要措施之一，為此，有必要了解桃中農(nóng)藥殘留的實際狀況。

目前，水果中農(nóng)藥的檢測多集中于蘋果、葡萄、芒果、草莓等水果［4-9］，對于桃中農(nóng)藥的檢測報道較少，已有報道也多集中于單一類別農(nóng)藥的檢測。程超等［4］研究了水果（包括桃）中有機磷的檢測；Costa 等［10］比較了不同QuEChERS 鹽析方法對罐頭桃和新鮮桃中農(nóng)藥殘留分析的影響；鄧雅靜［11］詳細研究了桃中抗菌劑的膳食暴露風險；Li等［12］在我國不同產(chǎn)地的312 份桃中檢出39 種農(nóng)藥，并對其進行了膳食風險評估，認為有9種殺蟲劑為高風險農(nóng)藥；Dong 等［13］對桃中苯磺隆和苯甲環(huán)唑的殘留水平進行了測定和暴露評估；李海飛等［14］采用QuEChERS 聯(lián)合在線凝膠滲透色譜/氣相色譜-質(zhì)譜（GPC/GC-MS）測定了蘋果、桃中的三唑類農(nóng)藥并對方法進行了評價；2021 年我國發(fā)布了GB23200.121《植物源性食品中331 種農(nóng)藥及其代謝物殘留測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》［15］。以上研究均采用單位分辨的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，為目前農(nóng)藥殘留領域的主流分析方法［7，16-18］。

果蔬中通常存在農(nóng)藥多殘留現(xiàn)象，因此農(nóng)藥高通量檢測具有重要的實際意義。盡管目前已有很多基于GC-MS/MS 或LC-MS/MS 建立的農(nóng)藥多殘留檢測的標準方法或報道，但是由于食品基質(zhì)的復雜性以及檢測窗口和采集點數(shù)的限制，低分辨的質(zhì)譜檢測方法在開展超高通量檢測時可能會存在假陽性或假陰性問題。以飛行時間質(zhì)譜為代表的高分辨質(zhì)譜（HRMS）分析技術具有超高的分辨能力和掃描速度，在多殘留分析中具有更多的優(yōu)勢。Li等［19］基于GC-HRMS篩查了水果中的439種農(nóng)藥殘留，殷雪琰等［20］基于氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速篩查和確證了農(nóng)產(chǎn)品中的222種農(nóng)藥殘留，畢軍等［21］利用QuEChERS-冷凍誘導液液萃取/液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定了蔬菜水果中的77 種農(nóng)藥殘留，Wang等［22-23］利用四極桿靜電場軌道阱類型的LC-HRMS 成功建立了水果中數(shù)百種農(nóng)藥的篩查方法。即便如此，與LC-MS/MS方法相比，液相色譜-高分辨質(zhì)譜在水果農(nóng)藥殘留檢測中的實際應用仍然較少。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜建立了鮮桃中農(nóng)藥的多殘留篩查方法，并對23份鮮桃樣本進行分析，以為水果中的農(nóng)藥殘留監(jiān)測和風險評估提供方法學借鑒和數(shù)據(jù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（Acquity UPLC- Xevo ? G2-XS QTOF MS，美國Waters公司），電子天平（德國梅特勒公司），KS501IKA 旋渦混勻器（艾卡（廣州）儀器設備有限公司），冷凍離心機（美國Beckman 公司），超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），Eppendorf 移液器（艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司）。Millipore-Elix-QE-QG 超純水機（美國Millipore公司）。

LC-MS 級、色譜級乙腈（美國 J.T.Baker 公司），超純水（Milli-Q Water System 純化制備），乙酸（純度大于98%，Acros Organics 公司），亮氨酸腦啡肽（LE，純度＞96%，Sigma公司），無水醋酸鈉和無水硫酸鎂（百靈威公司），QuEChERS 填料（PSA、Carb 和無水硫酸鎂，迪馬公司）。農(nóng)藥類標準溶液（純度均≥95%）購自天津阿爾塔公司。

1.2 樣本信息

實驗用鮮桃樣品于2022 年5～7 月分別購買自北京、河北、江西、安徽、陜西、河南、江蘇、山西、山東、湖南、浙江等地，共23份。

1.3 樣本提取

將1 kg鮮桃清洗晾干后去除果核，取可食部分用多功能輔食機攪碎混勻。

稱取鮮桃約5 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入5 mL 含有1%乙酸的乙腈溶液，再加入0.5 g 無水醋酸鈉和2 g 無水硫酸鎂，渦旋混勻，超聲提取20 min，振蕩后于4 ℃ 下9 000 r/min 離心10 min。取上層清液1 mL 加入分散固相萃取填料PSA 25 mg，石墨化炭黑（Carb）7.5 mg 和無水硫酸鎂100 mg凈化，旋渦后于4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL用UPLC-QTOF MS測定。

基質(zhì)樣品制備：稱取5 g鮮桃樣品（篩查結果中農(nóng)藥種類少且含量低的樣品），每份樣品按上述萃取過程進行處理，所得基質(zhì)提取液用于配制標準溶液，質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、50、100、500μg/L。

1.4 儀器分析

色譜條件：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，粒徑1.7 μm，美國Waters公司）。柱溫：50 ℃ ，流速：0.45 mL/min，進樣體積：5.0 μL，流動相 A 為含0.1%甲酸的乙腈，流動相 B 為含 0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫：0～0.25 min，A 為2%，0.26～20 min，A 由2%升至99%，保持至第24 min，第25 min回到初始流動相，保持5 min，為下一針進樣做準備。

質(zhì)譜條件：離子源溫度、毛細管電壓等參數(shù)值見表1。為保證質(zhì)量數(shù)精度，數(shù)據(jù)采集時以亮氨酸腦啡肽（50 ng/mL，m/z556.277 1）進行實時校準。質(zhì)譜條件中共包含3 個通道（Function），其中Function 1 和Function 2 為不同碰撞能量（CE）下的質(zhì)譜信息，對應的CE 值分別為6 eV 和10 ～45 eV，F(xiàn)unction 3為亮氨酸腦啡肽的實時校正質(zhì)譜圖。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Parameters of QTOF MS

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采集和處理使用美國Waters公司的UNIFI 2.0 軟件完成。在“1.4”參數(shù)條件下采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集完成后，建立處理方法；導入已建立的農(nóng)藥質(zhì)譜庫信息，包括化合物名稱、分子式、母離子的精確質(zhì)荷比、2 個以上特征碎片離子的精確質(zhì)荷比、保留時間等。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部312公告［24］設置篩查參數(shù)：化合物的保留時間應至少大于死時間的2倍，目標物與參考標準品以相同條件測定所獲得保留時間的絕對偏差應不大于0.2 min。母離子精確質(zhì)荷比的相對偏差不大于5 ppm，子離子精確質(zhì)荷比的相對偏差不大于10 ppm。同時，利用實驗室質(zhì)控樣品進行本實驗室內(nèi)的篩查參數(shù)優(yōu)化，兼顧同位素峰與碎片離子相對豐度比，在最優(yōu)條件下進行樣品篩查檢索。

2 結果與討論

2.1 篩查方法的優(yōu)化

化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫是開展高通量篩查的基礎。參考文獻及農(nóng)藥殘留相關的限量標準文件，選取包含殺蟲劑、抗菌劑、除草劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等在內(nèi)的540 種農(nóng)藥開展篩查。配制標準溶液，在“1.4”條件下進行質(zhì)譜信息采集，構建液相色譜高分辨質(zhì)譜庫，質(zhì)譜庫信息包括農(nóng)藥名稱、保留時間、母離子和碎片離子等。

2.1.1 前處理條件優(yōu)化目前水果蔬菜中農(nóng)藥高通量測定的前處理方法主要為QuEChERS 法，該法具有簡單便捷、快速準確、成本低廉等優(yōu)點。本研究通過加標實驗對QuEChERS 方法的提取溶劑和凈化填料進行優(yōu)化，兼顧數(shù)據(jù)庫中540種農(nóng)藥的種類和化學性質(zhì)，選取50種農(nóng)藥（表2）開展方法學考察，這50種藥物的辛醇水分配系數(shù)為-0.9～6.7，覆蓋范圍廣，具有較強的代表性。

表2 代表性農(nóng)藥在鮮桃中的加標回收率Table 2 Spiked recoveries of the representatives pesticides in fresh peach samples

乙腈是QuEChERS方法中最常用的有機提取溶劑，實驗對比了乙腈和含有1%乙酸的乙腈溶液的提取效果。結果表明酸化乙腈能增強化合物的質(zhì)譜響應，因此采用1%乙酸乙腈進行提取。桃中含有多種糖類、氨基酸、維生素、膳食纖維等，為降低這些內(nèi)源性物質(zhì)對目標化合物的影響，需對提取液進行凈化處理。對比了分散填料C18、PSA、石墨化炭黑（Carb）單獨處理或復配處理的凈化效果，樣品中50種加標化合物經(jīng)不同填料處理后回收率大于60%的農(nóng)藥種數(shù)見圖1。結果顯示，僅使用1種填料時，盡管PSA 的效果優(yōu)于C18，但88%的農(nóng)藥在鮮桃基質(zhì)中的抑制效應較明顯；當PSA 與Carb聯(lián)合使用時，基質(zhì)抑制的農(nóng)藥比例降為58%，推測是兩種填料可有效去除鮮桃中有機酸、色素等干擾物質(zhì)的緣故。由于Carb 的用量增加可以降低基質(zhì)效應，故進一步對Carb 的使用量進行優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)對于1 mL 提取液，使用25 mg PSA 和7.5 mg Carb 可去除干擾，有效凈化目標化合物。因此本實驗采用1%乙酸乙腈提取后，取1 mL提取液用25 mg PSA和7.5 mg Carb凈化。

圖1 經(jīng)不同凈化填料處理后回收率高于60%的農(nóng)藥種數(shù)Fig.1 Number of pesticides with recoveries higher than 60% in peach samples after purifed with different fillers extract solution volume：1 mL

2.1.2 方法確證在質(zhì)譜檢測中目標化合物的電離易受到基質(zhì)的干擾，導致離子抑制或增強，使得基質(zhì)匹配標準溶液的響應值與純?nèi)軇┑捻憫灰恢?，且不同化合物受到的基質(zhì)影響不同。當基質(zhì)效應過大時，會降低靈敏度，影響方法準確性，因此需要對基質(zhì)效應進行評價?；|(zhì)效應（ME）%=基質(zhì)匹配峰面積/純?nèi)軇┓迕娣e×100%。ME%大于120%為基質(zhì)增強效應，小于80%為基質(zhì)抑制效應。結果表明，所選取的50 種農(nóng)藥中32%屬于基質(zhì)增強效應（122%～160%），50%屬于基質(zhì)抑制效應（38.7%～79.4%）。

用基質(zhì)配制標準系列濃度，利用最低濃度母離子提取離子色譜峰的信噪比（S/N）推算目標物農(nóng)藥的檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10）。結果表明，目標農(nóng)藥在鮮桃中的LOD 為0.1～5.0 μg/kg，LOQ 為0.4～15 μg/kg。

為最大限度消除基質(zhì)效應的干擾，采用基質(zhì)匹配標準曲線法進行定量分析。在均質(zhì)的空白樣品中加入適量混合標準溶液，添加高、中、低3個濃度水平，每個水平設6個平行，計算目標化合物的回收率和相對標準偏差（RSD）。結果表明，代表性化合物的回收率為70.3%～127%（表2），RSD為0.60%～23%。表明該方法具有良好的準確度和精密度。

（續(xù)表2）

2.2 樣品篩查及定量

23 份樣品經(jīng)“1.3”方法處理后，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜的MSE模式進行質(zhì)譜信息采集，獲得樣本的總離子流圖，利用本實驗室建立的農(nóng)藥譜庫進行篩查，篩出的物質(zhì)詳細信息見表3。在23 份桃樣本中檢出33 種農(nóng)藥，其中殺蟲劑占49%（16 種），抗菌劑占33%（11 種），其余為除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑（圖2）。檢出頻率最高的農(nóng)藥包括殺蟲劑除蟲菊素和抗菌劑吡唑醚菌酯（圖3）、氧化萎銹和苯醚甲環(huán)唑，在15 份樣本中均有檢出，檢出率為65%；其次是新型抗菌劑8-羥基喹啉，檢出率61%。所有樣品均有一種或多種農(nóng)藥檢出，有兩種以上農(nóng)藥同時檢出的樣本，大多是一種或兩種殺菌劑和一種或多種殺蟲劑共殘留。

圖2 鮮桃樣品中農(nóng)藥的檢出情況Fig.2 Detection of pesticides in fresh peach samples

圖3 抗菌劑吡唑醚菌酯在標準品（上）及鮮桃樣品（下）中的色譜圖及對應的質(zhì)譜碎片圖Fig.3 The chromatograms and mass fragments of pyraclostrobin in standard（up） and fresh peach samples（down）

表3 鮮桃中篩查出的農(nóng)藥種類及信息Table 3 The pesticide information screened from the fresh peach samples

采用基質(zhì)校準曲線對23份鮮桃樣品中檢出的33種農(nóng)藥進行定量，結果見表4。從檢出濃度來看，90%的檢出含量小于0.1 mg/kg；超過1 mg/kg的農(nóng)藥有3種，分別是多菌靈（2.10 mg/kg）、丙環(huán)唑（1.80 mg/kg）和肟菌酯（1.80 mg/kg）。篩查出的33種農(nóng)藥中有18種農(nóng)藥在GB2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［3］中有最大殘留限量標準，其余無相關限量標準。共檢測到抗菌劑多菌靈和氟硅唑超標樣本各1份。

表4 鮮桃中的農(nóng)藥殘留情況Table 4 The residue of pesticides in fresh peach samples

2.3 與文獻比較

本研究在不同產(chǎn)地的桃樣品中檢出了33 種農(nóng)藥殘留，高檢出率的農(nóng)藥包括抗菌劑（吡唑醚菌酯、氧化萎銹、苯醚甲環(huán)唑）、殺蟲劑（除蟲菊素）等。Li等［12］在300余份鮮桃樣品中檢出了39種農(nóng)藥，樣本總檢出率為92.3%。本研究的檢出種數(shù)和檢出率與之相當，但具體農(nóng)藥種類有所差異，兩者檢出的農(nóng)藥中有10種相同，包括抗菌劑5種（多菌靈、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑和戊唑醇），殺蟲劑5種（啶蟲脒、滅幼脲、甲基毒死蜱、噠螨靈和螺螨酯），文獻［12］的檢出含量為0.001～3.4 mg/kg，稍高于本研究；除此之外，其余20余種農(nóng)藥各不相同，說明桃種植過程中的農(nóng)藥使用非常多樣化。Costa等［10］在新鮮桃中檢出戊唑醇、苯并環(huán)唑、馬拉硫磷等，Liu 等［25］在水果中檢測到多菌靈，Bibi等［26］在橘類水果中檢出莠去津和嘧菌酯，Jafarian 等［27］在棗中檢測到甲草胺和螺螨酯。本實驗檢出的農(nóng)藥與上述報道中的檢出農(nóng)藥一致，說明這些農(nóng)藥在水果栽培中被廣泛使用。但是本文中氯芬新、多效唑、溴蟲腈等未被推薦用于桃的農(nóng)藥也被檢出，且最高殘留濃度為0.071 mg/kg，說明果農(nóng)或種植企業(yè)未遵循用藥指導，或者果園內(nèi)不同水果未區(qū)分用藥。考慮到這些藥物的潛在危害，需進一步開展殘留水平監(jiān)測和健康暴露評估，為相關部門做好用藥監(jiān)管和控制提供技術支持。

3 結 論

農(nóng)藥殘留的高通量篩查離不開快速可靠的提取凈化前處理技術和強大的儀器分析技術。本研究基于改良的QuEChERS 技術建立了桃中農(nóng)藥殘留的高通量篩查前處理方法，代表性農(nóng)藥經(jīng)樣品前處理及分析，回收率均在70%～130%之間，RSD 小于25%，滿足高通量監(jiān)測的技術指標要求。對23 份桃樣品進行篩查，共檢出33種農(nóng)藥，其中殺蟲劑16種，抗菌劑11種，其余為除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑。

由于樣本數(shù)量有限，篩查結果不能代表相關產(chǎn)品的殘留情況。后續(xù)會進一步收集不同產(chǎn)地的桃樣品進行分析，以更準確更全面地反映農(nóng)藥使用情況，為食品安全管理提供更充分的數(shù)據(jù)支持。