糖析萃取/超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜快速篩查蜂蜜中的化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)

高 佳，劉夢(mèng)穎，任貝貝，路 楊，陳福尊，王麗英*，康維鈞

（1.河北醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.河北省疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050021）

蜂蜜是一種純天然的滋養(yǎng)食品，富含果糖、葡萄糖、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、脂類、生物酶等營(yíng)養(yǎng)成分［1-2］。在養(yǎng)蜂過程中，農(nóng)作物用藥和蜂農(nóng)用藥可能導(dǎo)致農(nóng)藥在蜂蜜中殘留甚至超標(biāo)［3-4］，而且在預(yù)防和治療蜜蜂感染性疾病中也存在抗生素使用不當(dāng)?shù)膯栴}［5］，同時(shí)蜜蜂在采蜜過程中可能采到有毒蜜源［6］，以上均可能導(dǎo)致人類食用蜂蜜后引起中毒。中國(guó)、日本、美國(guó)和歐盟等國(guó)家和地區(qū)均對(duì)蜂蜜中的農(nóng)藥、抗生素等制定了最大殘留限量［7-8］，因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的蜂蜜中多種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的篩查方法對(duì)于保障人民舌尖上的安全非常重要。

針對(duì)蜂蜜的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜（HPLC）法［9］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法［3-5］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法［10］等。隨著檢測(cè)儀器、技術(shù)的發(fā)展，樣品前處理技術(shù)也逐步簡(jiǎn)化。糖析萃取是以糖為相分離劑引發(fā)親水有機(jī)溶劑與水相分離的前處理技術(shù)，在乙腈-水體系中，加入的單糖越多，上層富集的乙腈濃度越高，且糖易溶于水微溶于乙腈，因此糖主要富集在下層水相［11-12］，對(duì)儀器影響較小；同時(shí)乙腈作為萃取劑，可直接進(jìn)樣，操作更簡(jiǎn)便。GB 14963-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》［13］中規(guī)定蜂蜜的果糖和葡萄糖含量應(yīng)大于等于60 g/100 g，蜂蜜作為一種含糖量很高的食品，采用糖析萃取作為樣品前處理技術(shù)，不需再另外添加糖即可使乙腈-水體系產(chǎn)生相分離效果，減少雜質(zhì)引入。

四極桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜是近年來食品檢測(cè)中使用較多的一種高分辨質(zhì)譜技術(shù)［14-16］，可以實(shí)現(xiàn)樣品中目標(biāo)物的高通量準(zhǔn)確定性篩查。高分辨質(zhì)譜技術(shù)已應(yīng)用于蜂蜜中植物毒素及農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，如甘源等［17］建立了蜂蜜中 5 種雷公藤毒素的高分辨質(zhì)譜定量分析方法，昝珂等［18］建立了蜂蜜中28個(gè)吡咯里西啶生物堿的快速檢測(cè)方法，呂冰等［19］建立了蜂蜜中7種新煙堿類農(nóng)藥殘留的高分辨質(zhì)譜檢測(cè)方法。但目前將高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于蜂蜜中農(nóng)殘、獸殘及植物毒源成分同時(shí)檢測(cè)的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究以蜂蜜為研究基質(zhì)，糖析萃取為前處理技術(shù)，通過超高效液相色譜-四極桿/軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-Q/Orbitrap-HRMS），建立了68 種常見的農(nóng)殘、獸殘及植物毒源成分風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)一級(jí)質(zhì)譜的分子離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、同位素豐度比進(jìn)行初篩，并采用二級(jí)碎片離子解析對(duì)初篩的陽性化合物進(jìn)一步確證，實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的快速篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Q-Exactive Plus 四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)及 Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）；JJ 600電子天平（0.01 g，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；ME204E電子天平（0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；Multi Reax試管振蕩器（德國(guó)Heidolph公司）；3-30K 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó) Sigma 公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸（色譜純，德國(guó)默克公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為屈臣氏蒸餾水。

阿維菌素類藥物混標(biāo)（依普菌素、阿維菌素B1a、多拉菌素、伊維菌素B1a）、有機(jī)磷農(nóng)藥混標(biāo)（敵百蟲、甲基吡啶磷、敵敵畏、馬拉硫磷、烯蟲磷、蠅毒磷、倍硫磷、二嗪磷、辛硫磷）、氨基甲酸酯類殺蟲劑混標(biāo)（抗蚜威-脫甲基、涕滅威砜、3-羥基克百威、抗蚜威、涕滅威、殘殺威、惡蟲威、克百威、甲萘威、乙硫苯威、滅除威、異丙威、3，4，5-混殺威、仲丁威、滅梭威、苯醚威、茚蟲威）均購(gòu)自上海安譜科技有限公司；雷公藤甲素、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤吉堿、雷公藤內(nèi)酯甲、醚菊酯、噠螨靈、5-甲基糠醛、氟蟲腈及其代謝物（氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜）、新煙堿殺蟲劑混標(biāo)（環(huán)氧蟲啶、噻蟲胺、吡蟲啉、氯噻啉、啶蟲脒、噻蟲啉、哌蟲啶）均購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司；磺胺硝苯、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲唑、周效磺胺、磺胺異唑、磺胺苯酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹啉、氯霉素均購(gòu)自德國(guó) Dr.Ehrenstorfer 公司。

32份蜂蜜樣品購(gòu)自超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取化合物10 mg，用甲醇溶解配制成 1 000 mg/L 的儲(chǔ)備液，于-20 ℃儲(chǔ)存；混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確吸取各類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋，配制成 10.0 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-20 ℃儲(chǔ)存；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：使用時(shí)用基質(zhì)匹配溶液稀釋配制成 1.00 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

精確稱取蜂蜜樣品2 g（精確至0.01 g）置于15 mL具塞離心管中，加入 1.5 mL水，混勻；加入3.5 mL乙腈，渦旋10 min 使其混合均勻。8 000 r/min 離心 10 min，取1.5 mL上清液至2 mL離心管中，15 000 r/min 離心 10 min，取上清液供UPLC-Q/Orbitrap-HRMS 分析測(cè)定。

1.4 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相由 0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）組成。梯度洗脫程序：0～2.5 min，95%～90% A，2.5～8.0 min，90%～5% A；8.0～12.0 min，5% A；12.0～14.0 min，5%～95% A；14.0～17.0 min，95% A。流速和柱溫分別設(shè)定為 0.3 mL/min 和40 ℃，樣品進(jìn)樣量為5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：加熱電噴霧離子源； 噴霧電壓 3.8 kV（正離子模式）、3.2 kV（負(fù)離子模式）；透鏡電壓：50.0 V；以氮?dú)鉃榍蕷夂洼o助氣，鞘氣壓力2.8×105Pa（40 psi），輔助氣壓力1.0×105Pa（15 psi）；離子傳輸管溫度 380 ℃；輔助氣加熱器溫度 350 ℃； 掃描模式：一級(jí)母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)子離子掃描監(jiān)測(cè)模式（Full MS/dd-MS2）；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z100～1 000，掃描分辨率70 000；二級(jí)掃描分辨率35 000；歸一化碰撞能為 20、40、60 eV。

68種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的詳細(xì)信息見表1。

表1 68種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的名稱、CAS 號(hào)、分子式、理論質(zhì)量數(shù)、加合方式和保留時(shí)間Table 1 Compound name，CAS number，molecular formula，theoretical mass，adduct and retention time of 68 kinds of risk substance

(續(xù)表1)

1.6 結(jié)果判定

依據(jù)歐盟 2002/657/EC 準(zhǔn)則［20］，使用高分辨質(zhì)譜法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性分析時(shí)，有 1 個(gè)母離子和 1 個(gè)子離子，或 2 個(gè)子離子匹配，即可確定樣品中存在目標(biāo)化合物。本研究對(duì)初篩陽性的樣品依據(jù)母離子與碎片離子進(jìn)行判定，若母離子和碎片離子的測(cè)量精確質(zhì)量數(shù)與理論精確質(zhì)量數(shù)偏差小于5×10-6且碎片離子的相對(duì)豐度比滿足歐盟 2002/657/EC 準(zhǔn)則要求，即可確定樣品中含有該化合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件選擇

2.1.1 色譜條件優(yōu)化對(duì)目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜全掃描發(fā)現(xiàn)：大部分化合物在 ESI+模式下生成正離子；氯霉素、磺胺硝苯、氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜、雷公藤紅素在ESI-模式下生成負(fù)離子。比較了正、負(fù)離子模式同時(shí)掃描時(shí)，水-甲醇、5 mmol/L 乙酸銨-甲醇和0.1%甲酸-甲醇3種流動(dòng)相的效果。結(jié)果表明，部分化合物在水-甲醇流動(dòng)相中生成的正離子的響應(yīng)較低，但在水相中加入0.1%甲酸后正離子的響應(yīng)明顯提高且對(duì)負(fù)離子響應(yīng)影響不大，如磺胺氯吡嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺苯酰、雷公藤次堿等正離子的響應(yīng)提高，雷公藤紅素、磺胺苯酰等目標(biāo)物的峰形得到明顯改善；而以5 mmol/L 乙酸銨為水相時(shí)，化合物保留時(shí)間的穩(wěn)定性及分離效果無明顯提高，故本實(shí)驗(yàn)選用0.1%甲酸-甲醇作為流動(dòng)相。圖1為蜂蜜在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖。

圖1 蜂蜜在正（A）、負(fù)（B）離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagrams of honey under positive（A） and negative（B） modes

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化考慮到不同化合物的電離方式不同，本研究選擇正、負(fù)離子模式同時(shí)進(jìn)行掃描，并根據(jù)68種化合物的分子量設(shè)定母離子的掃描范圍為m/z100～1 000。比較了正離子模式下目標(biāo)化合物［M+H］+峰和［M+Na］+峰的響應(yīng)，當(dāng)［M+Na］+峰明顯高于［M+H］+峰時(shí)，選擇［M+Na］+峰為定量峰，否則選擇［M+H］+峰進(jìn)行定量。

2.2 樣品前處理方法的選擇

蜂蜜較為粘稠，故先加水使其溶解再加乙腈進(jìn)行提取。分別向2 g 蜂蜜中加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL 水，充分振搖使其溶解。加入0.5 mL 水的蜂蜜粘稠不均勻，其余3 組為均勻液態(tài)，故2 g 蜂蜜至少需加入1.0 mL水進(jìn)行溶解。

分別將4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0 mL 的水與2 g 蜂蜜充分混勻，再加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 乙腈充分混勻，使體系中水和乙腈的總體積為5.0 mL（即乙腈的體積分?jǐn)?shù) 分 別 為20%、 30%、 40%、 50%、 60%、70%、80%），8 000 r/min 離心 10 min。結(jié)果表明，使用體積分?jǐn)?shù)為20%、30%的乙腈-水時(shí)提取液不分層，其余5 組提取液分層且上層乙腈相澄清透明。

向陰性蜂蜜樣品中加入100 μL 1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙腈-水溶液按“1.3”進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析。各化合物經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈-水提取后的回收率如圖2所示。從圖中可看出使用70%乙腈-水溶液時(shí)，目標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的加標(biāo)回收效果最佳，故選擇70%乙腈-水進(jìn)行樣品提取。

圖2 目標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈-水提取后的回收率Fig.2 Recoveries of target risk substances extracted with different volume fraction of acetonitrile-water

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)（ME）［21］指待測(cè)物質(zhì)受基質(zhì)影響，導(dǎo)致化合物響應(yīng)值產(chǎn)生增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象。采用陰性蜂蜜的空白基質(zhì)溶液和乙腈分別配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用基質(zhì)匹配曲線的斜率與純?nèi)軇┣€斜率的比值評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，ME在0.80～1.20之間時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)可忽略；ME＞1.20為基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，ME＜0.80為基質(zhì)效應(yīng)抑制。68 種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的 ME 值見表2，其中37種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)介于 0.80～1.20 之間；9種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)低于 0.80，介于0.452～0.799之間，雷公藤內(nèi)酯甲、甲萘威、惡蟲威、涕滅威、烯蟲磷等化合物存在明顯的基質(zhì)抑制現(xiàn)象；21種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)介于1.204～1.688之間，氯霉素的基質(zhì)效應(yīng)為2.010，噻蟲啉、3-羥基克百威、甲基吡啶磷、啶蟲脒、氯霉素等化合物存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)現(xiàn)象。因此本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響。

表2 68種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，LODs，LOQs，recoveries，RSDs and ME results of 68 risk substances

2.3.2 線性范圍、檢出限與定量下限用陰性蜂蜜的空白基質(zhì)溶液配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測(cè)，目標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）為 0.991 4～0.999 9；向空白樣品中添加低濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”進(jìn)行前處理后測(cè)定，分別以3倍、10 倍信噪比計(jì)算方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。測(cè)得 68 種農(nóng)藥的 LOD 為 0.03～2.73 μg/kg，LOQ 為0.10～9.00μg/kg。68 種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的線性范圍、檢出限和定量下限見表2。

2.3.3 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差取蜂蜜陰性樣品添加不同水平（1.75、8.75、35.0、70.0 μg/kg）的68 種風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)6 次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。方法的平均加標(biāo)回收率為50.7% ～ 122%，RSD為 1.0% ～15%。

（續(xù)表2）

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)從市場(chǎng)采購(gòu)的32 份蜂蜜樣品進(jìn)行測(cè)定，在12 份樣品中檢出蠅毒磷，含量范圍為0.74～24.87 μg/kg，其余樣品均未檢出。蠅毒磷母離子的精確質(zhì)量數(shù)為m/z363.021 74，測(cè)量精確質(zhì)量數(shù)為m/z363.021 12，偏差為1.7×10-6，小于5×10-6，且其保留時(shí)間、同位素豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品一致。采用 Full MS/dd-MS2采集蠅毒磷標(biāo)準(zhǔn)品和陽性樣品信號(hào)進(jìn)行確證，在一級(jí)質(zhì)譜圖中可見蠅毒磷的分子離子峰［M+H］+（m/z363.021 74），二級(jí)質(zhì)譜圖中可見其特征碎片離子m/z226.992 52、306.958 74、211.015 47、114.961 45。樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品二級(jí)質(zhì)譜圖匹配良好，可確認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。蠅毒磷標(biāo)準(zhǔn)品及其陽性樣品的提取離子色譜圖、同位素豐度比、一級(jí)質(zhì)譜圖及二級(jí)質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 蠅毒磷標(biāo)準(zhǔn)品（A）和陽性樣品（B）的提取離子色譜圖（1）、同位素豐度比（2）、一級(jí)質(zhì)譜圖（3）及二級(jí)質(zhì)譜圖（4）Fig.3 Extraction ion chromatograms（1），isotope abundance ratios（2），primary mass spectrograms（3） and secondary mass spectrograms（4） of coumaphos standard（A） and a positive sample（B）

3 結(jié) 論

本研究建立了蜂蜜中68 種化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜分析方法。樣品經(jīng)70%乙腈-水提取，糖析萃取后測(cè)定。方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，檢出限為 0.03～2.73 μg/kg，定量下限為0.10～9.00 μg/kg，平均加標(biāo)回收率為 50.7% ～ 122%，RSD 為1.0% ～15%。該方法通量高、速度快、定量準(zhǔn)確，可用于蜂蜜中風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的快速篩查。