超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜法快速篩查測定抗疲勞類保健食品中112種化學(xué)藥

黃 芳，鄧 欣，張秋炎，周 熙，梁梓洋，徐翠芳，賴曉娜，羅輝泰，吳惠勤

（廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070）

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民消費(fèi)潛力的提升，保健食品作為食品補(bǔ)充劑逐漸成為人們生活中的一種日常需求。然而，不少商家為了追求這類產(chǎn)品的快速效果，在其中非法添加化學(xué)藥，且添加量隨意，缺乏科學(xué)控制，一些有基礎(chǔ)病的消費(fèi)者在不知情的情況下服用后產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，對生命安全造成威脅。近年來有關(guān)監(jiān)管部門對非法添加的監(jiān)管越來越嚴(yán)格，但不法分子制假售假行為也越來越隱蔽，通過添加補(bǔ)充檢驗(yàn)方法以外的衍生物或類似物作為功效成分，且不直接在商品包裝上宣傳功效，用暗示的詞語或者在包裝盒里面介紹某些功能，從而逃避監(jiān)管。

國家食品藥品監(jiān)督管理局在2018 年發(fā)布的關(guān)于食品中那非類物質(zhì)的測定方法（BJS 201805）［1］中，規(guī)定了90種那非類物質(zhì)的篩查方法，該方法包括了以西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非、紅地那非為母體的大部分衍生物和合成副產(chǎn)物。該標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布以來對市場監(jiān)管起到一定作用，有效打擊了那非類非法添加現(xiàn)象。方法發(fā)布以來至2020年，筆者所在檢測機(jī)構(gòu)未在送檢產(chǎn)品中檢出非法添加，但近兩年發(fā)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)以外的衍生物和類似物檢出（例如2022年在產(chǎn)品中檢出的苯丙代卡巴地那非），可見原有的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法已相對滯后，需建立新的篩查檢測方法。

目前針對抗疲勞類保健食品中非法添加化學(xué)藥物的檢測方法主要有薄層色譜法［2-3］、高效液相色譜法［4-6］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［7-14］。李啟紅［2］建立了補(bǔ)益類中藥及保健食品中非法添加西地那非、氨基他達(dá)拉非、伐地那非的薄層鑒別和表面增強(qiáng)拉曼光譜法（SERS）；魯藝等［3］建立了薄層色譜-高效液相色譜法對可能摻加硫代西地那非的中藥制劑及保健食品進(jìn)行初步篩查，結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行確證。范小龍等［4］建立了一種高效液相色譜同時測定保健食品中13 種那非類非法添加物質(zhì)的定性及定量分析方法。徐紅斌等［7］采用超高效液相色譜-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜用于減肥和壯陽類保健食品中32種非法添加藥物的快速篩查和確證；陳燕等［9］建立了QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蒸餾酒及其配制酒中90種那非類非法添加藥物的分析方法。夏金濤等［10］通過多種技術(shù)手段（UPLC-Q/TOF MS、UPLC-LTQ 等）篩查出固體飲料中一種新型的、結(jié)構(gòu)未知的非法添加卡巴地那非類似物（N-苯基丙氧苯基卡巴地那非）。綜合分析各文獻(xiàn)可見：單用薄層色譜法或液相色譜法的定性效果差，均需結(jié)合質(zhì)譜或拉曼光譜確證；質(zhì)譜法或高分辨質(zhì)譜成為主流的方法，液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜具有選擇性好、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但采用MRM采集模式只針對目標(biāo)成分，不能發(fā)現(xiàn)方法以外的可疑物，有漏檢的風(fēng)險。超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜法（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）綜合了高分辨質(zhì)譜和三重四極桿質(zhì)譜的雙重優(yōu)勢，既能準(zhǔn)確定性又能準(zhǔn)確定量。

本文采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜分析，建立了112種那非及雄激素類化合物數(shù)據(jù)庫，采用儀器自帶軟件篩查分析，能快速鑒定出保健食品中非法添加藥物，并針對檢出物采用一級母離子提取峰面積外標(biāo)法定量，準(zhǔn)確測定其目標(biāo)物的含量。該方法與現(xiàn)有文獻(xiàn)方法及補(bǔ)充檢驗(yàn)方法對比具有以下優(yōu)勢：（1）分辨率高、選擇性強(qiáng)、定性定量準(zhǔn)確；（2）對采集的數(shù)據(jù)可再次分析，針對多出的可疑色譜峰進(jìn)一步推測分子式，結(jié)合二級碎片離子信息及同位素信息推測結(jié)構(gòu)式，可發(fā)現(xiàn)新的添加物；（3）結(jié)合超高效液相色譜的高效便捷分離，優(yōu)于傳統(tǒng)液相方法，適用于復(fù)雜基質(zhì)的高選擇性、高通量篩查，還可以不斷地擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫中藥物種類和數(shù)量。本方法檢測目標(biāo)物已達(dá)112 種，比現(xiàn)有的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法多22種，鑒別的非法添加品種更全面。方法已用于實(shí)際工作，能更好地為企業(yè)提供原材料及成品的風(fēng)險監(jiān)控，可為政府監(jiān)管及第三方檢測機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

112 種化學(xué)藥標(biāo)準(zhǔn)品（見表1，均購自阿爾塔公司）；甲酸（純度大于99%，麥克林試劑）；甲醇、乙腈（色譜純，默克公司）；水為屈臣氏蒸餾水。高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜（Thermo公司）。

表1 112種化學(xué)藥的數(shù)據(jù)庫信息Table1 Database information of 112 compounds

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制112 種標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)溶液，質(zhì)量濃度為100 μg/L，用甲醇逐步稀釋，配制成0、1.0、2.5、5、10、25、50、75、100 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液待用。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY BEH C18柱，（100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm）；柱溫：40 ℃。流動相：A 為0.1%甲酸水，B 為乙腈；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。梯度洗脫條件：0～1 min，10% B；1～5 min，10%～40% B；5～10 min，40%～70% B；10～15 min，70%～95% B；15～17 min，95% B；17～17.1 min，95%～10% B；17.1～22 min：10% B。

質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧電離源（H-ESI 源），源區(qū)主要參數(shù)：正離子檢測模式（ESI+）噴霧電壓3 500 V，鞘氣流量35 Arb，輔助氣流量為7 Arb，毛細(xì)管（離子傳輸管）溫度320 ℃，蒸發(fā)溫度275 ℃。

建立化學(xué)藥數(shù)據(jù)庫的掃描方式為：一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描（Full MS-ddMS2），全掃描模式分辨率為6 000，掃描范圍為m/z100～1 500，二級掃描分辨率為15 000，強(qiáng)度閾值為50 000，分離窗口為1.5m/z，碰撞能量為30%、50%、70%。采集數(shù)據(jù)通過Freestyle 軟件提取化合物信息，并建立TraceFinder數(shù)據(jù)庫。

快速篩查的掃描方式為：一級質(zhì)譜全掃描。分辨率為6 000，掃描范圍為m/z100～1 500。采集數(shù)據(jù)通過TraceFinder設(shè)定母離子及保留時間（tR）。

1.4 樣品前處理

稱取待測樣品1 g（精確至0.01 g）（壓片糖果磨成細(xì)粉，咖啡直接取粉末，膠囊直接取內(nèi)容物，酒樣取液體），置于25 mL 具塞試管中，加入90%甲醇（含0.1%甲酸） 20 mL，渦旋5 min，超聲15 min，定容至刻度，待測。

1.5 定性、定量方法

采用一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描測定112 種化學(xué)藥物的對照品溶液，利用得到的一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間及二級質(zhì)譜圖及碎片離子信息，建立每個化合物的數(shù)據(jù)庫。

參照歐盟準(zhǔn)則2002/657/EC［15］高分辨質(zhì)譜對目標(biāo)化合物的鑒定要求，1個母離子和1個子離子、或2個子離子匹配，則可判定樣品中含有該化合物。對供試品溶液進(jìn)行Full MS-ddMS2全掃描，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)篩查數(shù)據(jù)庫中m/z的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間對目標(biāo)化合物進(jìn)行篩查。當(dāng)未知物保留時間在±0.2 min，且母離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差在5 ppm范圍內(nèi)，子離子的精確質(zhì)量數(shù)偏差在10 ppm范圍內(nèi)時，可判定含有該化合物。再針對檢出的化合物，用母離子提取離子色譜峰面積為指標(biāo)，進(jìn)行外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 可疑化合物的發(fā)現(xiàn)與鑒定

在實(shí)際樣品測試過程中發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩查結(jié)果為未檢出，但對比總離子流圖與空白樣品，發(fā)現(xiàn)有異常高的一個峰。對該峰進(jìn)一步解析，其準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+為m/z464.219 6，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)推測該化合物的分子式為C26H29N3O5，二級質(zhì)譜圖（圖1A）中的主要特征碎片離子為m/z86.096 6、135.044 4、274.086 5、334.107 6，通過文獻(xiàn)檢索與比對［16-17］，并結(jié)合對照品，確認(rèn)該化合物為二乙氨基前他達(dá)那非（Diethylaminopretadalafil），結(jié)構(gòu)式見圖1B 所示，推測可能的質(zhì)譜裂解途徑如圖2 所示。其中，m/z86.096 6為母離子在C6與C7之間發(fā)生斷裂形成，且該途徑為二乙氨基前他達(dá)那非的主要裂解方式。子離子m/z334.107 6 則是母離子的9 號N 原子與C10 及C14 發(fā)生斷裂而形成，并進(jìn)一步脫去CH3OH 與CO 而形成m/z274.086 5 離子，當(dāng)m/z334.107 6 在C10 與C26 發(fā)生斷裂時則形成了m/z135.044 4離子。

圖1 二乙氨基前他達(dá)那非的二級質(zhì)譜圖（A）與結(jié)構(gòu)式（B）Fig.1 MS2 spectrum（A） and structural formula（B） of diethylaminopretadalafil

圖2 二乙氨基前他達(dá)那非的質(zhì)譜裂解機(jī)理Fig.2 MS fragmentation pattern of diethylaminopretadalafil

2.2 數(shù)據(jù)庫的建立

采用“2.1”方法，對收集的112 種化學(xué)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液在ddMS2模式下進(jìn)行分析，得到每個化合物的保留時間（tR）、母離子和子離子信息，建立供篩查的數(shù)據(jù)庫信息，見表1。

（續(xù)表1）

分析表1 中的化合物，主要為西地那非、伐地那非和他達(dá)拉非類化合物、同系物及同分異構(gòu)體。其中西地那非類化合物根據(jù)取代基種類及取代位置的不同，又可分為西地那非類、紅地那非類、硫代西地那非類、卡巴地那非類、二硫代卡巴地那非類等，主要的質(zhì)譜裂解方式如圖3A所示，該類化合物可通過苯環(huán)上的C-Y與O-R3發(fā)生斷裂與重排，形成強(qiáng)度較高的碎片離子，包括西地那非和艾地那非的碎片離子m/z283.118 7，硫代西地那非的碎片離子m/z299.085 9。盡管該類化合物因取代基的不同導(dǎo)致質(zhì)譜裂解方式略有差異，但由于其母核結(jié)構(gòu)相同，該類化合物的質(zhì)譜裂解行為有著較高的相似度。

圖3 西地那非類（A）、伐地那非類（B）、他達(dá)那非類（C）化合物的主要裂解過程Fig.3 Fragmentation mechanisms of sildenafil or its analogues（A），vardenafil or its analogues（B） and tadalafil or its analogues（C）

伐地那非類化合物在結(jié)構(gòu)上與西地那非類化合物較為相似，包括伐地那非類、硫代伐地那非類和乙酰伐地那非類等。該類化合物的主要質(zhì)譜裂解方式如圖3B所示。因?yàn)榕c西地那非結(jié)構(gòu)類似，因此西地那非苯環(huán)上的裂解方式同樣存在于伐地那非類化合物中。由于伐地那非與西地那非的區(qū)別在于母核中氮原子位置的不同，因此兩類化合物由母核發(fā)生裂解所形成的碎片離子具有明顯差異，如伐地那非的碎片離子m/z151.086 6，可用于區(qū)分西地那非和伐地那非。

他達(dá)那非類化合物結(jié)構(gòu)上與西地那非及伐地那非相差較大，從結(jié)構(gòu)上主要分為含哌嗪二酮環(huán)與不含哌嗪二酮環(huán)兩種類型。從圖3C的質(zhì)譜裂解方式可以看出，這兩類他達(dá)那非類化合物有特征的碎片離子m/z135.044 1 和m/z262.086 2，其中m/z262.086 2 是由母核中心的含氮六元環(huán)發(fā)生裂解產(chǎn)生，而m/z135.044 1為母核中苯環(huán)處發(fā)生斷裂形成的3，4-（亞甲二氧基）甲苯正離子，可用于初步判斷是否屬于他達(dá)拉非類化合物。同時，在苯環(huán)處斷裂后亦可中性丟失1，2-亞甲二氧基苯，形成如他達(dá)那非的碎片離子m/z268.107 8。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

由于112 種化合物的理化性質(zhì)不同，因此選擇提取溶劑需綜合各化合物的極性及溶解性能。由于待測樣品大部分基質(zhì)為水溶性，在樣品中加入適量的水有利于提取。取空白樣品加標(biāo)后的提取溶劑提取并測試，以各化合物的一級提取離子峰面積為指標(biāo)，對比了甲醇、乙腈、乙腈（含0.1%甲酸）、90%甲醇（含0.1%甲酸）4 種提取溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，選擇90%甲醇（含0.1%甲酸）作為提取溶劑時，提取后溶液相對澄清，容易過濾，且各化合物的提取效果好，因此，實(shí)驗(yàn)選擇其為最佳提取溶劑。實(shí)驗(yàn)還考察了將樣品過Oasis HLB 固相萃取小柱的凈化方法，結(jié)果顯示過柱后部分化合物的回收率偏低，如脫硫伐地那非為44%，去甲基他達(dá)拉非為58%?？紤]到儀器的高靈敏性能，樣品稀釋后進(jìn)樣也能達(dá)到足夠檢出限，因此選擇直接提取法更簡單實(shí)用。

2.4 液相色譜條件的優(yōu)化及同分異構(gòu)體的處理

考察了多個因素對色譜分離、靈敏度和離子化效率的影響。由于所測112 種化合物含有14 對同分異構(gòu)體，比較了乙腈、甲醇、水、0.1%甲酸不同組合作為流動相，以不同梯度在ACQUITY BEH C18色譜柱上的分離效果。結(jié)果顯示，在甲醇-水和乙腈-水中，均有多對同分異構(gòu)體未能完全分離，在乙腈-水中加入0.1%甲酸，大部分物質(zhì)的靈敏度均有提高，且峰形改善，因此實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈和0.1%甲酸水作為流動相組成。

112 種化學(xué)藥中14 組同分異構(gòu)體的精確分子離子和同分異構(gòu)體化合物個數(shù)分別為：m/z434.171 0（2 個）、m/z467.276 5（3 個）、m/z489.227 9（5 個）、m/z453.260 9（2 個）、m/z505.222 8（3 個）、m/z521.199 9（2 個）、m/z475.212 2（2 個）、m/z461.196 6（3 個）、m/z519.220 7（2 個）、m/z438.250 0（2個）、m/z505.205 0（3個）、m/z517.259 2（2個）、m/z460.201 3（2個）、m/z835.301 4（2個），其中精確離子為m/z489.227 9的同分異構(gòu)體有5個，試驗(yàn)了不同流動相體系和色譜條件均未能達(dá)到完全分離（見圖4A），保留時間7.88 min 的色譜峰中存在兩個化合物（異丁基西地那非和丙氧基苯基西地那非），其二級質(zhì)譜圖中有不同的特征碎片離子，可根據(jù)二級質(zhì)譜進(jìn)一步定性鑒定。其余13組均能達(dá)到分離，部分同分異構(gòu)體的提取離子圖見圖4（A-J）所示。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在正、負(fù)離子同時采集模式下，112 種化合物中大部分化合物的分子離子峰在正離子模式下的響應(yīng)值較高，因此方法采用正離子掃描。對比一級全掃描與目標(biāo)物二級掃描方式下的靈敏度發(fā)現(xiàn)，一級全掃描方式的靈敏度較高。因此，采用全掃描方式進(jìn)行定量分析。對于在同樣保留時間下篩查到的目標(biāo)離子，通過二級譜圖進(jìn)行定性分析。對比不同碰撞能量下化合物的二級譜圖發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)化合物在30、50、70 eV下得到其特征性二級碎片。在該碰撞能下采集化合物的二級質(zhì)譜圖。由于色譜柱的粒徑較小，色譜峰峰寬較窄（約0.1 min），為盡可能獲得目標(biāo)物的二級質(zhì)譜圖，采用動態(tài)排除方法進(jìn)行dd-MS2掃描。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 檢出限、定量下限與線性范圍分別采用溶劑和空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)曲線，以質(zhì)量濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)比值 = 溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，計算基質(zhì)效應(yīng)比值。結(jié)果表明，有6 種成分的基質(zhì)效應(yīng)明顯。因此，本方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法定量以抵消基質(zhì)引起的定量誤差。

用咖啡陰性樣品提取液做溶劑，配制一定質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/L）的系列基質(zhì)加標(biāo)溶液，從低至高進(jìn)樣，以化合物呈明顯色譜峰的最低濃度為檢出限（LOD），以化合物在線性范圍中滿足回收率在80%～120%區(qū)間內(nèi)的最低濃度為定量下限。結(jié)果表明，112種化合物的檢出限為0.012 5～0.062 5 mg/kg，定量下限為0.025～0.125 mg/kg。

用甲醇做溶劑，配制質(zhì)量濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10、25、50、75、100 μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察各成分的線性范圍。按實(shí)際情況選取5 個濃度點(diǎn)計算，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，母離子提取離子流圖的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線及對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（r2），各成分的線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2，相關(guān)系數(shù)均不低于0.999。表明方法的線性關(guān)系良好，滿足定量分析的要求。

2.6.2 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差用咖啡做基質(zhì)，在低（10 μg/L）、中（25 μg/L）、高（50 μg/L） 3 個加標(biāo)濃度下測試回收率，每個加標(biāo)水平測定6次，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。方法的回收率為62.0%～124%，RSD 為2.4%～8.9%。將加標(biāo)溶液進(jìn)行數(shù)據(jù)庫篩查，所有成分均能匹配檢出，準(zhǔn)確率達(dá)100%。實(shí)驗(yàn)分別采用壓片糖果、膠囊和保健酒做基質(zhì)，考察加標(biāo)回收率，測得回收率為78.4%～122%，方法能滿足定量要求。

2.7 實(shí)際樣品的測定

近2 年檢測了客戶送檢的抗疲勞類樣品近150 個，樣品類型有壓片糖果、膠囊、保健酒、咖啡等，部分陽性樣品的測定結(jié)果見表3。檢出成分有育亨賓（Yohimbine）、二乙氨基前他達(dá)拉非（Diethylamino pro-tadalafil）、苯丙代卡巴地那非（Carbodenafil impurity 7）等，其中檢出頻率最高的是苯丙代卡巴地那非，由此可見此類物質(zhì)非法添加現(xiàn)象仍然存在。

表3 部分典型陽性樣品的測定結(jié)果Table 3 Detection results of some typical positive samples

（續(xù)表3）

3 結(jié) 論

本文采用酸性有機(jī)混合溶劑超聲提取樣品，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，通過UPLC-Q-Orbitrap HRMS法對保健食品中的非法添加化學(xué)藥進(jìn)行快速篩查測定，可準(zhǔn)確測定112 種非法添加化合物。對全掃描數(shù)據(jù)再次分析，還可發(fā)現(xiàn)其它可疑色譜峰，推測其分子式，并結(jié)合二級碎片離子信息及同位素信息可推測結(jié)構(gòu)式，發(fā)現(xiàn)新的非法添加物。方法適用于抗疲勞類保健食品及普通食品中非法添加化學(xué)藥的快速篩查。