基于組學、機器學習和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物篩查方法研究

馮 超，盧大勝，汪國權(quán)，徐 騫，邱歆磊，金玉娥，陳宇航

（上海市疾病預(yù)防控制中心，國家環(huán)境保護新型污染物環(huán)境健康影響評價重點實驗室，上海 200336）

我國是全世界最大的農(nóng)藥生產(chǎn)和消費國，由于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化水平低、農(nóng)民用藥的安全意識淡薄，我國的農(nóng)藥污染情況相比國外更為嚴重［1-2］，呈現(xiàn)種類多、地域差異大的趨勢［3］。然而，受限于人員與設(shè)備，傳統(tǒng)的檢測方法僅適用于日常的靶向監(jiān)測，不能實現(xiàn)農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物的擬靶向廣譜篩查與鑒定。目前，食品安全領(lǐng)域的擬靶向篩查技術(shù)主要基于色譜與高分辨質(zhì)譜的聯(lián)用［4-5］，化合物的鑒定主要參考其色譜行為（保留時間RT）和質(zhì)譜特征，包括一級質(zhì)譜特征（精確質(zhì)荷比、同位素輪廓、中性丟失和加合形態(tài)）與二級質(zhì)譜特征（MS2）［6］。然而，廣譜和高通量的化合物篩查與鑒定需考慮以下3 方面：1）化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。雖然實驗室自建的數(shù)據(jù)庫可信度更高，但建庫不僅需儲備大量的標物，其過程也極為耗時耗力，所以商業(yè)數(shù)據(jù)庫（或方法包）仍為多數(shù)實驗室首選；2）低歧視性的樣品提取與廣譜的儀器分析方法。目前高穩(wěn)定性和低歧視性的QuEChERs 方法是該領(lǐng)域的主流提取方法［7］，色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用則是污染物廣譜篩查中最理想的儀器，特別是多色譜系統(tǒng)（如氣相色譜-質(zhì)譜與液相色譜-質(zhì)譜）的互補可以更完整地了解樣品中的化合物全貌［3］；3）高效的數(shù)據(jù)分析方法。分析方法主要包括靶向、擬靶向與非靶向3種；靶向方法主要基于數(shù)據(jù)庫中化合物色譜與質(zhì)譜特征的匹配［8］進行數(shù)據(jù)篩查；擬靶向方法則主要針對已知分子結(jié)構(gòu)，但缺乏RT與MS2信息的化合物。擬靶向方法通常僅通過一級質(zhì)譜特征（MS1）匹配篩查數(shù)據(jù)，結(jié)果的可靠性低，假陽性多，需進一步借助其他技術(shù)來排除假陽性，這些技術(shù)包括通過組學差異挖掘數(shù)據(jù)中的質(zhì)譜特征［9］，以及近年來在代謝組學和環(huán)境科學中逐漸流行的機器學習技術(shù)［10-11］；非靶向方法則主要針對未知結(jié)構(gòu)的化合物，如果未知物與已知化合物的結(jié)構(gòu)以及質(zhì)譜特征存在相似性，則可通過匹配質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的特征二級碎片或者特征中性丟失發(fā)現(xiàn)潛在的同系物或環(huán)境轉(zhuǎn)化物［12］，繼而通過質(zhì)量虧損、化合物轉(zhuǎn)化規(guī)律和質(zhì)譜裂解規(guī)律推導疑似化合物的結(jié)構(gòu)，或在了解化合物變化規(guī)律的前提下，通過預(yù)測或推導化合物的結(jié)構(gòu)，繼而在擬靶向的基礎(chǔ)上進一步篩查與鑒定［13］。然而，由于化合物在質(zhì)譜離子化時普遍存在源內(nèi)裂解的現(xiàn)象，以及同分異構(gòu)化合物在質(zhì)譜中難以被區(qū)分，擬靶向方法和非靶向方法的鑒定結(jié)果仍缺乏可信度，需要標準品幫助確證結(jié)果，因此標準品的匱乏始終是化合物鑒定的瓶頸［14］，尤其對于農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物。近年生物轉(zhuǎn)化技術(shù)也在分析化學領(lǐng)域得到了應(yīng)用，主要通過肝微粒［15］或微生物（細菌和藻類等）［16］等媒介模擬農(nóng)藥在環(huán)境媒介下的轉(zhuǎn)化得到農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物，從而有效獲取轉(zhuǎn)化物的色譜與質(zhì)譜特征，實現(xiàn)化合物的一級鑒定［14］。

本研究基于廣譜低歧視的QuEChERS 提取方法和液相色譜-靜電場軌道阱聯(lián)用（LC-Q-Orbitrap）檢測，在組學、機器學習和生物轉(zhuǎn)化等多學科技術(shù)的幫助下，搭建了基于數(shù)據(jù)庫匹配的靶向篩查方法，并借助組學和人工智能（AI）預(yù)測技術(shù)建立了農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的擬靶向篩查方法。同時，運用肝微粒體外孵育技術(shù)建立了疑似轉(zhuǎn)化物的高置信度確證方法。該方法具有高效、廣譜和高特異性等特點，可滿足不同食品類型中多農(nóng)藥殘留及其轉(zhuǎn)化物的快速篩查與確證需求（圖1）。鑒于多農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物在食品中的殘留分析重點在于廣譜的樣品提取方法、低歧視的數(shù)據(jù)采集方法和高通量與高置信度的數(shù)據(jù)挖掘方法，本研究將通過以下4 方面討論如何在真實樣本中系統(tǒng)地篩查并確證農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物的陽性結(jié)果：1）廣譜的農(nóng)藥提取方法；2）高分辨質(zhì)譜中的二級質(zhì)譜特征采集方式；3）基于數(shù)據(jù)庫多元參數(shù)匹配的靶向數(shù)據(jù)篩查；4）基于AI預(yù)測與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的擬靶向篩查。

圖1 擬靶向篩查方法的技術(shù)框架Fig.1 Framework of suspect screening method

1 實驗部分

1.1 標準品與試劑

所有農(nóng)藥標準物質(zhì)均購自Dr.Ehrenstorfer（Augsburg，Germany）或者 LGC Standards（Teddington，UK），純度均大于95%；甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸鈉、無水硫酸鎂（HPLC 級試劑）均購自Sigma-Aldrich（Steinheim，Germany），其他試劑均為HPLC級；去離子水采用Milli-Q-Plus超純水設(shè)備制備。

磷酸緩沖液（0.1 mol/L）、NADPH 再生系統(tǒng)（0.1 mol/L）和混合人肝微粒（20 mg/mL，0.5 mL/管）均購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；固相萃取小柱（Oasis HLB，6 cc，500 mg）購自Waters（Milford，USA）；食品基質(zhì)如玉米（Rye，EUPT-CF10）、檸檬（Lemon，EUPT-FV19）、綠豆（Green bean，EUPT-FV20）、紅甘藍（Red cabbage，EUPT-FV21，EUPT-FV-SM11）、洋蔥（Onion，EUPT-FVSM12）、茄子（Aubergine，EUPT-FV-SM13）、西紅柿（Tomato，EUPT-FV-SM14）和小麥（Wheat kernel，EUPT-FV-SM15）均來自歐盟農(nóng)藥參比實驗室（EURL，www.eurl-pesticides.eu）；75件菊花茶采自北京、浙江和上海三地的商超和菜場；實驗用水均為去離子水。

1.2 軟件與數(shù)據(jù)庫

液相色譜控制、質(zhì)譜調(diào)諧采集與進樣序列控制軟件分別為Chromeleon、Tune 和Xcalibur v4.0；靶向和擬靶向數(shù)據(jù)分析軟件為TraceFinder v4.1 和Compound Discoverer v3.3；機器學習的RT 模型構(gòu)建平臺為R（Retip Package，www.retip.app），特征二級碎片預(yù)測軟件為CFM-ID v4.5；靶向數(shù)據(jù)庫為實驗室自建，約含1 000 多種農(nóng)藥原形物與200 多種轉(zhuǎn)化物；擬靶向數(shù)據(jù)庫為文獻與在線數(shù)據(jù)庫收集（來自PPDB和Swisspest19），約含1 200多種農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物。

1.3 提取方法

取1 g 干樣/5 g 半干樣/10 g 濕樣于50 mL 離心管，加入10 mL（干樣）/5 mL（半干樣）/不加（濕樣）水，干樣/半干樣在加水后分別浸泡20 /10 min。然后，加入10 mL含1%乙酸的乙腈，渦旋振蕩1 min后，先后加入1 g乙酸鈉和4 g無水硫酸鎂，劇烈振搖后離心2 min（5 000 r/min，約2 000 G），將約1 mL的上清液過0.22 μm 的PVDF 濾膜（Millex FG，Millipore，USA），待上機。對于色素、硫化物和油脂等含量較高的食品如中草藥、韭菜和牛油果，將提取的上清液作2～5倍稀釋后上機分析。

1.4 色譜條件

液相色譜為Dionex UltiMate 3000 高效液相色譜系統(tǒng)（Thermo Fisher ScientificTM，USA），Thermo Accucore aQ（150 mm×2.1 mm：2.6 μm）色譜柱，柱溫20 °C，流速0.4 mL/min。流動相A 為2 %甲醇（含0.1 %甲酸和5 mmol/L 甲酸銨），流動相B 為98%甲醇（含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨）。梯度洗脫程序為：-5～0 min，100% A；0～4 min，100%～80% A，4～5.5 min，80%～60% A，5.5～10.5 min，60%～0% A；10.5～12.9 min，0% A；12.9～15 min，0%～100% A。

1.5 質(zhì)譜條件

四極桿-靜電場軌道肼質(zhì)譜（Q-Orbitrap MS，Q Exactive）分別采用ESI+與ESI-電離模式，配備加熱電噴霧離子源（HESI），源參數(shù)為：噴霧電壓分別為3.8 kV（ESI+）與3.2 kV（ESI-），離子傳輸管溫度為320 ℃，鞘氣（霧化氣）流速為 40 arb.unit，輔助氣流速為10 arb.unit，輔助氣溫度為350 ℃。質(zhì)譜采集中同時進行MS1和MS2掃描，一次MS1掃描搭配5次MS2掃描。

MS1掃描模式為全掃描（FS），掃描范圍為m/z80～1 200；分辨率為70 000 FWHM；自動增益控制（AGC）為1×106；最大注入時間（MAX IT）為100 ms。

MS2掃描模式分為數(shù)據(jù)依賴（DDA，DDA-List）和非數(shù)據(jù)依賴（DIA或AIF）兩類，其中DDA 參數(shù)：分辨率為17 500 FWHM；AGC 為1×105；MAX IT 為50 ms；事件循環(huán)次數(shù)（Loop count）為5；質(zhì)量隔離窗（Isolation window）為2 Da；歸一化碰撞能量（NCE）為20、40、60；二級觸發(fā)響應(yīng)閾值為2×104；同位素排除（Exclude isotope）為 ON；峰頂觸發(fā)時間（Apex trigger）為2～6 s；動態(tài)排除時間（Dynamic exclusion）為5 s。DDA-List 將關(guān)注化合物加合形態(tài)的m/z導入特定列表（Inclusion list），其他參數(shù)與DDA 一致。DIA 將m/z100～900 分為16 個間隔50 Da 的質(zhì)量區(qū)間段，對每個質(zhì)量段內(nèi)的母離子進行混合MS2掃描。AIF 同時將質(zhì)量段內(nèi)的所有母離子進行MS2掃描。DIA 和AIF 中的分辨率、AGC 和碰撞能量等參數(shù)與DDA模式一致。

1.6 保留時間預(yù)測模型的構(gòu)建

基于實驗室已有約400 種農(nóng)藥的小規(guī)模數(shù)據(jù)，基于R 平臺的Retip 包中的4 種機器學習算法（決策樹：隨機森林、XGBoost、lightGBM；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)：Keras），化合物的分子描述符組（Molecular descriptor set，每個化合物約含3 800 個變量信息）和化合物在本方法下的RT 信息，將數(shù)據(jù)以訓練集和測試集（8∶2）的分配形式用4 種不同算法進行訓練，構(gòu)建混合預(yù)測模型（Ensemble model），測試集在RT 偏差＜1.0 min的閾值內(nèi)陽性物質(zhì)的篩查率達到97%［17］。

1.7 肝微粒孵育方法

在3 mL 的EP 管中加入約420 μL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L），再加入60 μL 的NADPH 再生系統(tǒng)（0.1 mol/L）和5 μL農(nóng)藥混合標準（2 mg/mL），然后加入20 μL混合人肝微粒（20 mg/mL），于37 ℃水浴中孵育2 h，加入200 μL 的冰乙腈（-18 ℃）終止反應(yīng)，離心1 min（4 000 r/min，約2 000 G），取上清液過0.22μm的PVDF濾膜后，待上機。

1.8 數(shù)據(jù)篩查策略

樣本中數(shù)據(jù)篩查的策略如圖1所示：待測物經(jīng)提取和儀器數(shù)據(jù)采集（FS-DDA-List）后，數(shù)據(jù)中農(nóng)藥原形物采用基于自建數(shù)據(jù)庫的靶向方法進行分析，化合物鑒定的維度圍繞RT、MS1和MS2三個維度的信息，質(zhì)譜特征（Mass feature）依次通過1）m/z（Δm/z＜5 ppm，響應(yīng)＞2×105，S/N＞5）；2）溶劑空白（Blank，10 倍背景扣除）；3）同位素輪廓（IP，Δm/z＜5 ppm，響應(yīng)偏差＜30%，總體打分＞70%）；4）RT（＜ 0.3 min）；5）MS2（至少匹配2個的二級特征，Δm/z＜10 ppm，響應(yīng)＞1×104）共5個參數(shù)進行過濾，均能滿足的質(zhì)譜特征可認為是陽性結(jié)果（鑒定級別=1）。數(shù)據(jù)中農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物用基于結(jié)構(gòu)列表的擬靶向方法分析，由于列表中的化合物缺失RT 和MS2信息，因此方法基于自建的RT 預(yù)測模型［17］，以及美國環(huán)保署（EPA）推薦的MS2預(yù)測軟件（CFM-ID）［11］，對列表中已知結(jié)構(gòu)的化合物進行RT 與MS2預(yù)測，除了RT 過濾參數(shù)（＜1.0 min）設(shè)定較為寬泛外，其他過濾參數(shù)與靶向方法一致。如滿足以上篩查特征，則被認為是疑似結(jié)果（鑒定級別=3），如果農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的篩查結(jié)果可通過肝微粒體外合成輔助確證，則結(jié)果的置信度達2級。

2 結(jié)果與討論

2.1 廣譜的農(nóng)藥提取方法

為確保方法對食品基質(zhì)的普適性以及對絕大多數(shù)親水性較弱的農(nóng)藥有較好的回收率，本研究對提取進行標準化，提取時不同含水量樣品的取樣與加水量不同，但提取過程盡可能一致。通過乙腈和鹽析輔助的液液萃取方法將樣本中親水的雜質(zhì)與親有機相的農(nóng)藥進行兩相分離，去除絕大多數(shù)高極性物質(zhì)。方法適用于不同含水量的食品（如谷物、中草藥和奶粉等干樣，禽蛋、水產(chǎn)品和菌菇等半干樣，以及多數(shù)的果蔬等濕樣）。由于前期實驗或報道證明，石墨化炭黑（GCB）或者N-丙基乙二胺（PSA）均易造成個別物質(zhì)的吸附，如乙酰甲胺磷和滅菌丹等農(nóng)藥易被PSA 吸附［18］，六氯苯等平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥易被GCB 吸附［19］。此外，復雜基質(zhì)（如綠茶和中草藥）中大量雜質(zhì)也難以通過分散性填料有效凈化。因此，本方法不使用任何選擇性的凈化試劑，主要采用多倍稀釋方法對復雜基質(zhì)的提取液進行凈化，以降低所有基質(zhì)的上樣量和防止個別物質(zhì)的損失（圖2A）。

圖2 基于QuEChERS的不同類型食品基質(zhì)的標準化提取方法（A）和PPDB數(shù)據(jù)庫上1 364種農(nóng)藥的油水分配系數(shù)（LogP）預(yù)測（B）Fig.2 Unified QuEChERS-based extraction method for different food types（A） and LogP prediction of 1 364 pesticides from PPDB database（B）

研究通過對PPDB 數(shù)據(jù)庫（sitem.herts.ac.uk）中1 364 個農(nóng)藥活性物質(zhì)的LogP［20］進行匯總與預(yù)測（圖2B），調(diào)研了不同親水性/極性農(nóng)藥提取和儀器分析的可行性。結(jié)果表明，只有極少數(shù)（小于5%）農(nóng)藥（如百草枯、敵草快、草銨膦等）的LogP值小于0，即屬于較高極性化合物，這類物質(zhì)不僅難以通過液液萃取直接從水相中萃取，還需使用離子對色譜、HILIC體系［21］或者超臨界流體色譜（SFC）［22］才能實現(xiàn)良好的色譜保留。而對于絕大多數(shù)中低極性農(nóng)藥的分析，均可通過與本方法［6］一致的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（反相體系，ESI 源）進行分析，少部分的低極性農(nóng)藥（如有機氯或擬除蟲菊酯類農(nóng)藥）則需采用氣相色譜-質(zhì)譜（EI源）進行分析［23］。

基于以上提取方法和理論依據(jù)，研究來自歐盟農(nóng)藥殘留參比實驗室（EURL）的果蔬和飼料等食品基質(zhì)，如玉米（谷物，干樣）、檸檬（水果，濕樣）、綠豆（蔬菜，半干樣）和紅甘藍（蔬菜，濕樣）中不同類型（如擬除蟲菊酯、有機磷、新煙堿、三唑等）農(nóng)藥的加標回收率（表1）。結(jié)果顯示，不同基質(zhì)中不同類型化合物的回收率為66.3%～126%，方法對不同基質(zhì)和農(nóng)藥的適用性良好，驗證了該提取體系的可靠性。

表1 4類食品基質(zhì)中多農(nóng)藥殘留的回收率Table 1 Recoveries of pesticide multi-residues in four types of food matrices

2.2 高分辨數(shù)據(jù)采集模式的比較

為使低歧視的儀器分析方法盡可能采集到各類農(nóng)藥的MS1和MS2特征，研究評價了目前最常見的3種不同高分辨質(zhì)譜二級采集模式在紅甘藍（Red cabbage，EUPT-FV-SM11）中陽性農(nóng)藥篩查中（圖3A）的應(yīng)用，二級采集模式分別為FS-DDA（數(shù)據(jù)依賴性掃描模式）、FS-DIA（數(shù)據(jù)非依賴性性掃描模式）、FS-AIF（全碎片掃描模式）和FS-DDA-List（帶列表的數(shù)據(jù)依賴性掃描模式）。結(jié)果顯示，在無RT輔助確證的情況下，使用DDA、DIA、AIF、DDA-List共篩選出12、16、16、16個陽性結(jié)果和1、8、18、1個假陽性結(jié)果（圖3B）。由于數(shù)據(jù)依賴性的掃描方法會依據(jù)質(zhì)譜特征的響應(yīng)強度排序進行二級掃描，所以DDA 的4 個假陰性（黃色標注）結(jié)果是由其相對的低豐度（響應(yīng)普遍低于5×107）引起（圖3A）；而DIA 和AIF 等非數(shù)據(jù)依賴性的掃描方式則可以檢出所有（16種）陽性特征，但其假陽性數(shù)量卻顯著高于DDA 方式，原因是這些模式下二級碎片的共流混雜度太高導致MS2數(shù)據(jù)的特異性較差，除非有RT 協(xié)助確證，否則將極大增加后續(xù)排除假陽性結(jié)果的工作量。為了解決DDA模式下的響應(yīng)歧視問題，DDA-List通過設(shè)置擬靶向化合物列表的方式，優(yōu)先篩查列表中目標物，同時實現(xiàn)高陽性檢出率和低假陽性率。以上研究表明，非數(shù)據(jù)依賴性的掃描方式可獲取更全面的化合物二級質(zhì)譜信息，但數(shù)據(jù)的特異性不如依賴性的掃描方式，需要其他維度（如RT）補充以進一步排除假陽性數(shù)據(jù)，而帶列表的數(shù)據(jù)依賴性掃描方式則可以兼顧數(shù)據(jù)的檢出率和特異性。

圖3 紅甘藍中陽性農(nóng)藥列表（A）和不同掃描模式下紅甘藍中陽性/假陽性農(nóng)藥的篩查結(jié)果（B）Fig.3 List of positive pesticides in red cabbage（A） and screening result of positive/false positive pesticides in red cabbage under different scanning modes（B）

2.3 基于數(shù)據(jù)庫匹配的靶向篩查

2.3.1 多元參數(shù)的特征過濾在液相色譜-高分辨質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)中，靶向數(shù)據(jù)的特征挖掘主要基于數(shù)據(jù)庫的多元參數(shù)匹配，涉及RT 偏差、MS1（m/z偏差、同位素輪廓打分）和MS2（特征碎片離子）等參數(shù)。研究基于一個小麥樣本（EUPT-FV-SM15）在ESI+模式下采集的FS-DDA數(shù)據(jù)，依次通過m/z、溶劑空白、同位素輪廓、RT 和MS25 個維度的參數(shù)進行特征過濾。結(jié)果顯示，滿足質(zhì)荷比偏差的疑似特征共1 779 種，溶劑背景的扣除將可將特征數(shù)降至1 666 個，而同位素輪廓和RT 對特征數(shù)的過濾貢獻較大，依次將特征數(shù)削減至267 個和72個。經(jīng)MS2確證后（僅全掃描的數(shù)據(jù)需要二次進樣確證），能達標的物質(zhì)僅剩13種（圖4）。將該過濾后的結(jié)果與官方公布的陽性結(jié)果相比，陽性結(jié)果除一個ESI-出峰的化合物（Fluroxypyr）外都在其中，且無假陽性的特征。因此，在多元參數(shù)的限定下，可以最大程度地減少候選特征數(shù)和篩查工作量，增加結(jié)果的置信度。

圖4 不同維度參數(shù)過濾下的質(zhì)譜特征數(shù)Fig.4 Number of mass feature under different dimension parameter filtering

2.3.2 靶向數(shù)據(jù)篩查的應(yīng)用研究在紅甘藍樣品中發(fā)現(xiàn)了疑似苯菌酮（Metrafenone）化合物（圖5A），其+H 特征峰的質(zhì)荷比偏差（Δm/z）小于5 ppm，響應(yīng)（＞2×105）和信噪比（S/N＞5）均滿足要求，而其+Na 的加合形態(tài)也能滿足Δm/z＜ 5 ppm，RT偏差也小于0.5 min。由于化合物含鹵素（溴），其同位素輪廓的特異性較好，且每個同位素特征（M+1、M+2、M+3等）與理論的響應(yīng)偏差（＜30%）和Δm/z（＜ 5 ppm）均滿足要求，同位素輪廓打分為100%（＞70%）（圖5B）。除MS1特征，該化合物MS2的特征也與mzCloud 數(shù)據(jù)庫匹配良好（94.1 分，圖5B）。此外，化合物還存在明顯的源內(nèi)裂解（in-source CID）現(xiàn)象，在MS1特征中存在的m/z209.080 70 和m/z229.970 00 兩個離子與苯菌酮的特征離子（m/z409.064 12）具有相同的RT和相似的峰形（圖5D），且這兩個特征屬于苯菌酮的主要特征MS2（圖5C），其MS2中個別離子（如m/z181.049 3和m/z168.964 6等）也存在于苯菌酮的MS2輪廓中。

圖5 基于多元參數(shù)綜合鑒定疑似苯菌酮農(nóng)藥Fig.5 Comprehensive identification of suspected metrafenone pesticides based on multivariate parameters

2.4 基于AI預(yù)測與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的擬靶向篩查方法

傳統(tǒng)的擬靶向篩查基于疑似列表做MS1特征匹配來發(fā)現(xiàn)疑似特征，篩查結(jié)果的置信度較低。本方法受益于組學和AI 預(yù)測技術(shù)，在扣除空白特征、MS1特征匹配的基礎(chǔ)上，基于疑似特征可能的化合物結(jié)構(gòu)（SMILES）來預(yù)測保留時間（RT）和MS2后進行特征過濾。在實際應(yīng)用中，基于MS1特征篩查，本方法在75件菊花茶中發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的殘留，且其預(yù)測RT偏差均滿足要求（＜1.0 min）。為進一步確證轉(zhuǎn)化物的篩查結(jié)果，研究通過肝微粒體外孵育技術(shù)，獲得部分農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的色譜與質(zhì)譜特征，其中8 種轉(zhuǎn)化物的MS2得到解析，且其RT 偏差（＜ 0.3 min）與樣本特征較一致（表3）。如咪鮮胺的疑似轉(zhuǎn)化物BTS44596（圖6），其孵育RT 與樣本RT 的偏差為 0.11 min，通過AI輔助的質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析后，注釋了其主要特征碎片（m/z335.293 64、308.000 43、216.921 83）的結(jié)構(gòu)，確證了該化合物的分子結(jié)構(gòu)。最后，通過孵育后的特征與樣品中的特征進行色譜與質(zhì)譜特征的匹配，確證該轉(zhuǎn)化物的陽性結(jié)果，鑒定的置信度為2a級，有關(guān)化合物的鑒定置信度級別見表4［14］。

表3 菊花茶中8種農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的篩查與鑒定結(jié)果Table 3 Summary of eight pesticide transformation products in chrysanthemum tea

表4 高分辨質(zhì)譜中化合物的鑒定置信度級別Table 4 Proposed identification confidence levels in high resolution mass spectrometry

圖6 經(jīng)肝微粒孵育后獲得的咪鮮胺轉(zhuǎn)化物（BTS44596）的鑒定與碎片注釋Fig.6 Identification and fragment ions annotation of transformation products of prochloraz（BTS44596） after liver microsome incubation

2.5 方法的可靠性驗證

本實驗室自2014 年以來，歷年參與EURL 舉辦的盲樣篩查考核（EUPT-FV-SM）。在無參考標物的情況下，實驗室在2019～2021 連續(xù)3 年的考核中，基于該方法體系，在72 h 內(nèi)，分別在卷心菜（EUPTFV-SM11，Lab002）、洋蔥（EUPT-FV-SM12，Lab023）、茄子（EUPT-FV-SM13，Lab021）3 類盲樣中實現(xiàn)10 多種不同類型農(nóng)藥100%的陽性檢出，也在西紅柿（EUPT-FV-SM14，Lab010）中鑒定出多個農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物（如Propamocarb-N-oxide、Spirotetramat-enol、Bifenazate-diazene 等），證明了該方法對農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物篩查的廣譜、高效和高可信度等特征。

3 結(jié) 論

本研究基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物的篩查與鑒定體系，對各類食品基質(zhì)和不同農(nóng)藥進行廣譜提取，低歧視儀器采集以及高通量和高置信度的數(shù)據(jù)挖掘與確證，特別是在缺乏標準品的情況下，可通過生物轉(zhuǎn)化方法提升疑似農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物鑒定的置信度。研究通過來自歐盟參比實驗室的真實樣本驗證了該方法體系的可靠性，并在歷年全國代表性食品監(jiān)測中使用該方法體系發(fā)現(xiàn)并確證了不少農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物。通過組學、機器學習和生物轉(zhuǎn)化等多種技術(shù)的融合，該研究突破了目前食品安全領(lǐng)域農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物篩查與鑒定的瓶頸。在未來研究中，期望通過不斷擴充實驗數(shù)據(jù)庫并提高數(shù)據(jù)分析的智能化，實現(xiàn)農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物快速與廣譜的檢測。