多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)的開環(huán)溫控系統(tǒng)及其在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用*

史寶軍，陳劉平，張子奇，魏春陽，李?yuàn)檴櫍?，李軍委

（1.河北工業(yè)大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院 河北省機(jī)器人傳感及人機(jī)融合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300130；2.電工裝備可靠性與智能化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300132；3.河北工業(yè)大學(xué)廊坊分校 電子信息工程系，河北 廊坊 065000）

0 引 言

核酸體外擴(kuò)增是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，在體外以特定溫度下進(jìn)行的基于酶促的DNA擴(kuò)增反應(yīng)被廣泛研究，許多裝置被開發(fā)以滿足擴(kuò)增需求［1］。隨著科技的快速發(fā)展，設(shè)備的微型化、集成化和智能化已然成為一種趨勢(shì)［2，3］。微流體設(shè)備作為一種微反應(yīng)器，表現(xiàn)出高效的傳質(zhì)傳熱效率、低樣品消耗、高度集成化的優(yōu)勢(shì)［4，5］，可應(yīng)用于食品檢測(cè)、生化分析等多個(gè)方面［6～8］，是用來研究聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的有利工具。對(duì)于核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)而言，溫度的準(zhǔn)確與否非常關(guān)鍵，如何準(zhǔn)確測(cè)量和控制微流體實(shí)時(shí)溫度是一個(gè)重要問題。

微流體反應(yīng)體系采用的溫控方式有閉環(huán)控制和開環(huán)控制，閉環(huán)控制精度較高，例如潘井宇等人［9］利用PID控制器設(shè)計(jì)了PCR 擴(kuò)增熒光系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)傳染病類的病原體（寨卡病毒）的檢測(cè)；李志剛等人［10］提出Bang-Bang 算法結(jié)合PID算法的復(fù)合算法，完成了血液中病毒核酸快速檢測(cè)。為實(shí)現(xiàn)微系統(tǒng)的集成化和小型化，有學(xué)者嘗試使用開環(huán)控制方法實(shí)現(xiàn)微流控體系下的溫度及控制和核酸擴(kuò)增，例如Wu D等人［11］也通過開環(huán)控制去尋找PCR 的合適電壓，實(shí)現(xiàn)連續(xù)流動(dòng)的PCR循環(huán)；Liu C等人［12］設(shè)計(jì)了一種帶有集成隔離膜的等溫?cái)U(kuò)增器，利用熱電偶校正輸入電壓和溫度關(guān)系，使得后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再重復(fù)估計(jì)電壓和溫度模型。本課題組前期研究中，以供電電壓為參量，采用系統(tǒng)辨識(shí)［13］的方法對(duì)微流體實(shí)時(shí)溫度進(jìn)行了較為精準(zhǔn)的控制，并在微流體芯片中成功合成了針狀CsPbI3量子點(diǎn)。

考慮到環(huán)境溫度對(duì)溫控過程具有不可忽視的影響，本文提出一種基于多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)的微反應(yīng)系統(tǒng)開環(huán)控制方法，利用實(shí)驗(yàn)采集得到的多維溫度數(shù)據(jù)，考慮供電功率、環(huán)境初始溫度等參數(shù)對(duì)溫控系統(tǒng)的影響，對(duì)微流體溫控體系進(jìn)行多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)，得到溫度控制模型，開發(fā)了相應(yīng)的溫度控制系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于不同工況下溫度傳感器采集的實(shí)時(shí)溫度數(shù)據(jù)，利用上位機(jī)溫控模型的關(guān)鍵參數(shù)辨識(shí)，并根據(jù)下一輪數(shù)據(jù)采集來隨時(shí)修正溫控模型參數(shù)，充分降低了外部環(huán)境和硬件老化或漂移帶來的干擾，保證了開環(huán)微流控系統(tǒng)溫控的魯棒性。最后，利用該系統(tǒng)完成了對(duì)鴨源性目的基因的恒溫?cái)U(kuò)增，充分驗(yàn)證了此開環(huán)溫控系統(tǒng)的溫控性能的優(yōu)異性能。

1 傳熱模型

1.1 系統(tǒng)模型傳熱分析

如圖1（a）所示，基于多參數(shù)辨識(shí)的開環(huán)溫控系統(tǒng)包括外部供電模塊、基于STM32 的可調(diào)電壓控制器、加熱單元等，其中加熱單元由鋁制熱沉、金屬陶瓷發(fā)熱體（metal ceramics heater，MCH）和微流體芯片組成。微流體芯片利用軟光刻法制備，光刻膜使用SU—8 干膜，在聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）蓋片表面得到微米級(jí)通道，然后與載玻片進(jìn)行鍵合得到微流控芯片。系統(tǒng)通過可調(diào)電壓控制模塊準(zhǔn)確控制輸入電壓，從而控制MCH加熱片加熱微流體芯片。

圖1 微型開環(huán)溫控系統(tǒng)示意和實(shí)物

取圖1（a）所示的系統(tǒng)為研究對(duì)象，芯片內(nèi)部微流體與玻璃基底之間的傳熱僅為幾百毫秒，因此玻璃基底的溫度可表征微流體的實(shí)時(shí)溫度。為了獲得系統(tǒng)的準(zhǔn)確加熱規(guī)律，通過可調(diào)電壓模塊改變MCH 加熱片兩端的電壓值，如圖2所示?？梢钥闯?，不同功率加熱片溫升特性都是相同的，本文取功率為10 W 的加熱片進(jìn)行研究，溫升變化如圖2（b）所示，可以看出，隨著時(shí)間的改變，逐漸增大電壓輸入值，穩(wěn)態(tài)溫升值先快速上升，然后緩慢增加，直到達(dá)到穩(wěn)態(tài)值，可見系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)溫升值主要受外部施加電壓的影響。

圖2 不同參數(shù)下溫控系統(tǒng)響應(yīng)曲線

對(duì)圖1（a）溫控模塊的熱量傳遞進(jìn)行簡化分析，如圖3所示，系統(tǒng)發(fā)熱元件為MCH 加熱片，其產(chǎn)生的熱量由鋁塊傳遞到石英玻璃，中間會(huì)經(jīng)過多次的熱量傳遞及時(shí)間延遲，熱量主要以溫度傳遞的形式表現(xiàn)出來。

圖3 微流體溫控模塊的熱量傳遞模型示意

圖3中，將MCH 氧化鋁（Al2O3）陶瓷加熱片本身的溫升系數(shù)記為k1，時(shí)間常數(shù)記為τ1；鋁塊和石英玻璃在熱量傳遞過程中的溫升系數(shù)分別記為k2、k3，時(shí)間常數(shù)分別記為τ2、τ3；由經(jīng)典控制理論可知，MCH加熱片、鋁塊和石英玻璃熱量傳遞過程分別符合一階慣性環(huán)節(jié)［14］。又由于鋁和石英傳熱速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于PDMS，即τ1＜τ2?τ3，則該溫控系統(tǒng)可整體近似等于一階慣性環(huán)節(jié)?？紤]到系統(tǒng)為線性系統(tǒng)，故記該系統(tǒng)的總的穩(wěn)態(tài)溫升系數(shù)值為K；也考慮鋁質(zhì)導(dǎo)熱片及石英玻璃的傳熱延遲，記系統(tǒng)總的響應(yīng)時(shí)間為τ；MCH陶瓷加熱片作為系統(tǒng)的發(fā)熱元件，由圖2可知系統(tǒng)的響應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)態(tài)溫升值均是關(guān)于輸入電壓和初始溫度的函數(shù)，綜合考慮整個(gè)開環(huán)溫控系統(tǒng)的熱量傳遞情況，系統(tǒng)的溫升加熱規(guī)律可以寫成式（1）

式中 K為開環(huán)溫控系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)溫升值，是關(guān)于輸入電壓U和室溫T0的函數(shù)；τ為開環(huán)溫控系統(tǒng)的響應(yīng)時(shí)間，是關(guān)于輸入電壓U和室溫T0的函數(shù)。

1.2 多參數(shù)辨識(shí)算例

如前所述，多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)系統(tǒng)控制模型的求解，本質(zhì)上是基于不同工況下溫度傳感器采集到的實(shí)時(shí)溫度數(shù)據(jù)來完成，下一輪數(shù)據(jù)的采集會(huì)對(duì)前一輪得到的溫控模型關(guān)鍵參數(shù)做出一定的修正，以避免外部環(huán)境和硬件老化或漂移帶來的自身系統(tǒng)特性的干擾。因此，多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)是一個(gè)動(dòng)態(tài)求解過程，此處提供該算例闡述多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)的求解過程。

由式（1）可知，微型開環(huán)系統(tǒng)模型參數(shù)有穩(wěn)態(tài)溫升值K和響應(yīng)時(shí)間τ，K和τ均為關(guān)于輸入電壓U和室溫T0的函數(shù)，利用圖2（a）計(jì)算開環(huán)溫控系統(tǒng)在3，4，5，6 V時(shí)的穩(wěn)態(tài)溫升值K和響應(yīng)時(shí)間τ，如表1所示。

表1 當(dāng)初始溫度不同時(shí)，不同電壓的溫控系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)溫升值及響應(yīng)時(shí)間

為獲取不同電壓和初始溫度下系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)溫升值及響應(yīng)時(shí)間準(zhǔn)確的模型，對(duì)不同電壓和室溫下系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)溫升值K及響應(yīng)時(shí)間τ的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，如圖4所示。

圖4 系統(tǒng)電壓、室溫分別與響應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)態(tài)溫升值的模型

則系統(tǒng)響應(yīng)時(shí)間τ與電壓U的模型關(guān)系如下

系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)溫升值K與電壓U的模型關(guān)系如下

式（2）和式（3）模型的線性擬合度均在99%，經(jīng)過多次重復(fù)性驗(yàn)證，辨識(shí)參數(shù)的誤差不超過1%，由式（1）可知，系統(tǒng)的溫升模型如下

則開環(huán)微流控溫度控制系統(tǒng)的實(shí)時(shí)目標(biāo)溫度模型為

式中 Td為目標(biāo)溫度，T0為實(shí)驗(yàn)環(huán)境的室溫，td為達(dá)到目標(biāo)溫度所需的時(shí)間，U為MCH加熱片兩端施加的電壓值。

特別地，當(dāng)多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)求解得到的關(guān)鍵參數(shù)的相對(duì)差值在1%之內(nèi)時(shí)，停止進(jìn)行對(duì)系統(tǒng)關(guān)鍵參數(shù)的下一輪修正。

2 溫控系統(tǒng)開發(fā)

微型開環(huán)加熱系統(tǒng)電路如圖5 所示，采用負(fù)溫度系數(shù)（negative temperature coefficient，NTC）熱敏電阻（型號(hào)：10—D9）將溫度變化轉(zhuǎn)化為電阻變化，通過壓分電路將電阻變化轉(zhuǎn)化為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)，然后在單片機(jī)內(nèi)實(shí)現(xiàn)模／數(shù)（analog to digital，A／D）轉(zhuǎn)換。通過自行設(shè)計(jì)的半橋脈寬調(diào)制（pulse width modulation，PWM）電路，單片機(jī)驅(qū)動(dòng)MCH加熱片實(shí)現(xiàn)溫度控制。同時(shí)單片機(jī)控制Pt100 溫度傳感器測(cè)量溫度值，電風(fēng)扇用于加熱片散熱。最后使用串口通信，上述電路可以通過上位機(jī)控制和監(jiān)測(cè)。

圖5 以STM32 為核心的開環(huán)溫控系統(tǒng)電路

系統(tǒng)下位機(jī)設(shè)計(jì)采用編程語言為C語言的Keil開發(fā)環(huán)境。如圖6所示，微流控溫控系統(tǒng)的上位機(jī)可以通過參數(shù)辨識(shí)得到加熱系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)溫升值k 和響應(yīng)時(shí)間τ 參數(shù)，更新溫控系統(tǒng)目標(biāo)溫度Td模型，得到實(shí)時(shí)溫度曲線。如圖6（b），首先打開相應(yīng)的串口接收實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊辨識(shí)規(guī)律，實(shí)現(xiàn)微流體溫控系統(tǒng)的實(shí)時(shí)溫度模型的更新。然后輸入目標(biāo)溫度值Td和期待的反應(yīng)時(shí)間td，點(diǎn)擊開始，上位機(jī)得到實(shí)時(shí)溫度響應(yīng)曲線。設(shè)置采集數(shù)據(jù)方便保存數(shù)據(jù)。

圖6 系統(tǒng)上位機(jī)流程和操作界面

3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與分析

多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增（multienzyme isothermal rapid amplification，MIRA）技術(shù)是一種在恒溫條件下高效完成的核酸擴(kuò)增反應(yīng)［15］，通過在恒溫39 ℃下使基因片段擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果能夠可視化判別。為了驗(yàn)證該開環(huán)實(shí)時(shí)溫度控制方法的可行性與有效性，采用MIRA 技術(shù)對(duì)鴨肉中提取的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，利用顯微鏡觀察檢測(cè)結(jié)果處于熒光狀態(tài)，證明溫度控制的準(zhǔn)確性。

反應(yīng)試劑盒（安普未來生物科技有限公司，常州，中國）包括干粉管、緩沖液（Buffer）A和Buffer B、正對(duì)照引物探針混合物、正對(duì)照模板。實(shí)驗(yàn)時(shí)，在干粉管加入29.4 μL 的Buffer A、2.5 μL的Buffer B、4.6 μL的正對(duì)照引物探針混合物、11.5 μL的ddH2O和2 μL的正對(duì)照模板，充分混合，等待使用。

擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室室溫為27 ℃，設(shè)置期待的反應(yīng)時(shí)間td為245 s。利用圖1（b）搭建的系統(tǒng)將配置好的反應(yīng)液分散成液滴［16］，并在顯微鏡下觀察，拍攝暗場(chǎng)圖片，如圖7（a）所示；將芯片轉(zhuǎn)移到恒溫加熱控制系統(tǒng)，加熱20 min，在暗場(chǎng)下拍攝熒光圖片，如圖7（b）所示?？梢钥闯?，液滴發(fā)出強(qiáng)烈熒光，表明目的基因片段成功擴(kuò)增，采用多參數(shù)辨識(shí)的方法成功將溫度維持在39 ℃（±0.1 ℃），證明了該微流體溫控系統(tǒng)采用多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)的開環(huán)溫度控制方法的可行性與有效性。

圖7 利用MIRA技術(shù)，對(duì)鴨源DNA恒溫?cái)U(kuò)增前后的對(duì)比

4 結(jié) 論

本文采用多參數(shù)系統(tǒng)辨識(shí)的方法獲得了微流體系統(tǒng)準(zhǔn)確的加熱規(guī)律，基于模型的方法控制核酸擴(kuò)增反應(yīng)溫度。建立了基于STM32的開環(huán)微流體溫控的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，研究了上位機(jī)隨時(shí)辨識(shí)溫控系統(tǒng)的主要參數(shù)，更新了系統(tǒng)加熱模型，有效解決了開環(huán)溫控系統(tǒng)不穩(wěn)定性所帶來的系統(tǒng)干擾，為核酸擴(kuò)增反應(yīng)提供了穩(wěn)定而準(zhǔn)確的溫度。結(jié)果證明，該系統(tǒng)方法可靠，可重復(fù)性強(qiáng)，在核酸檢測(cè)中有廣闊的應(yīng)用前景。