消栓通絡(luò)片中三七莖葉及重金屬檢查*

盧旭波 周云峰 郭林峰 吳喆

消栓通絡(luò)片是由桂枝、木香等11味中藥組成的中藥制劑,具有活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)的功效[1,2]。方中含有三七,用藥部位為其干燥根和根莖[3]。然而三七屬于名貴藥材,不良商家為節(jié)約成本會將價格低廉的三七莖葉冒充三七進行投料生產(chǎn)[4-6],由于三七莖葉含有的化學(xué)成分與三七大致相同,這種違規(guī)行為一般難以發(fā)覺。另外,隨著中藥材野生資源日益枯竭,中藥材商業(yè)化栽培種植逐漸得到推廣,由于中藥材的生長習(xí)性和人工干預(yù),有相當(dāng)部分的中藥材出現(xiàn)重金屬殘留超標(biāo)問題[7,8],這可能會引發(fā)質(zhì)量風(fēng)險,甚至將安全風(fēng)險轉(zhuǎn)移至中藥制劑中,為了保證成品的療效和用藥安全,有必要對中藥制劑的重金屬進行限量檢查?；诓殚單墨I幾乎無對消栓通絡(luò)片中三七莖葉和重金屬有害元素檢查研究的報道,本研究首次對消栓通絡(luò)片中三七莖葉和重金屬殘留量進行檢查分析,具體報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器及試劑CAMAG雙波長紫外觀察箱(瑞士卡瑪公司);Nexlon 305D 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國PerkinElmer公司);Mars 6 微波消解儀(美國CEM 公司);KH-250DB超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。正丁醇、醋酸、乙醚、甲醇為分析純,濃硝酸為優(yōu)級純,水為蒸餾水。

1.2 試藥三七皂苷R1(批號:110745-201921)、三七對照藥材(批號:120941-201810)、三七莖葉皂苷對照提取物(批號:110871-202102)來自中國食品藥品檢定研究院;砷(As,批號:223004-2)、銅(Cu,批號:225017-7)的濃度均為1000 mg/L,來源于國家有色金屬及電子材料分析測試中心;汞(Hg,批號:B22100008)、鎘(Cd,批號:B21070285)、鉛(Pb,批號:B22060242)的濃度均為1000 mg/L,來源于壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;金標(biāo)準(zhǔn)液(Au,批號:23-2AUY1)和鉍、鍺、銦、鋰、鈧、鋱、釔內(nèi)標(biāo)液(Bi、Ge、In、Li、Sc、Tb、Y,批號:CL51-249CRY1)購于美國PerkinElmer公司;消栓通絡(luò)片(15批,來源于7家企業(yè),規(guī)格為0.38 g/片或相當(dāng)于原藥材1.8 g/片,批號分別為1812120、191203、480713、480712、470545、470158、20200301、20191202、20191104、20191003、20190802、20190702、180504、180302、20190502)。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七莖葉檢查

2.1.1 實驗方法取樣品5片,研細,加乙醚10 ml振搖10 min,濾過,棄去濾液,藥渣揮干后用5 ml水潤濕,加水飽和正丁醇10 ml,振搖提取10 min,浸泡2 h,取上清液,殘渣再加水飽和正丁醇10 ml,振搖提取,取上清液,與第1次提取的上清液合并,用60 ml正丁醇飽和的水洗滌,取正丁醇液,蒸干,殘渣加甲醇1 ml使溶解,作為供試品溶液。 取三七莖葉皂苷對照物適量,加甲醇制成每1 ml約含10 mg的三七莖葉皂苷對照物溶液;取三七對照藥材1.0 g,加70%甲醇20 ml,加熱回流30 min,濾過,濾液濃縮至2 ml,作為三七對照藥材溶液;取三七皂苷R1適量,加甲醇制成每1 ml約含2 mg的三七皂苷R1對照品溶液。照薄層色譜法試驗[9],以正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)放置分層的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10 %硫酸乙醇溶液,在110 ℃加熱至斑點顯色清晰,分別置日光下和紫外燈光(365 nm)下檢視。

2.1.2 檢測結(jié)果編號1～15為15批次消栓通絡(luò)片供試品溶液,與三七對照藥材及三七皂苷R1對照品相比,各斑點亮度、顏色及位置等均較一致;編號16為三七莖葉皂苷對照物,其與三七對照藥材化學(xué)成分大致相同,如同樣含有三七皂苷R1,但與樣品和三七對照藥材相比均多出現(xiàn)1個明顯的斑點,能有效區(qū)分差異,說明該7家企業(yè)未出現(xiàn)三七莖葉冒充三七投料生產(chǎn)的違規(guī)行為。見圖1。

注:A:在日光下檢視;B:在紫外燈光365 nm下檢視,1-15 供試品,16三七莖葉皂苷對照物,17 三七對照藥材,18 三七皂苷R1對照品。圖1 TCL色譜圖

2.2 重金屬殘留量測定

2.2.1 對照品溶液的制備精密量取As、Cd、Cu、Pb、Hg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量,加5%硝酸溶液稀釋成含As(0.5、2、5、10、50 μg/L)、Cd(1、5、10、20、50 μg/L)、Cu(10、40、80、100、250 μg/L)、Pb(1、5、10、50、100 μg/L)、Hg(0.2、0.5、1、5、20 μg/L)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取本品細粉約0.5 g,精密稱定,置消解罐中,加入濃硝酸10 ml,靜置2 h,經(jīng)微波消解后將消解液轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中,加入200 μl金元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/ml),加水稀釋至刻度,搖勻,離心,取上清液作為供試品溶液。

2.2.3 儀器參數(shù)霧化氣流量、等離子體氣流量分別為0.95 L/min、18 L/min;電感耦合等離子體射頻功率為1300 W;檢測器雙模式,Standard掃描模式;數(shù)據(jù)采集模式為跳峰模式,重復(fù)次數(shù)3 次;同位素202Hg 、208Pb 以209Bi 為內(nèi)標(biāo),111Cd以115In 為內(nèi)標(biāo),63Cu、75As 以89Y 為內(nèi)標(biāo)。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密度與重復(fù)性采集一系列對照品溶液的響應(yīng)計數(shù)值,以各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物計數(shù)值的比值為縱坐標(biāo)(Y)、濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制曲線方程;取1份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,連續(xù)進樣6次,計算各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物計數(shù)值的RSD<4%;選擇1批樣品(樣品序號:6),平行稱取6份,按2.2.2項下方法處理,測定含量,各元素RSD<6%。見表1。

2.2.5 加標(biāo)回收取樣品(樣品序號:6)約0.25 g,精密稱定,置于消解罐內(nèi),精密加入相當(dāng)于樣品各元素含量100%的標(biāo)準(zhǔn)液,按2.2.2項下制備供試品溶液,平行制備 6 份,測定各元素的含量,各元素的回收率。見表2。

表2 加樣回收率

2.2.6 樣品測定消栓通絡(luò)片樣品中As、Cd、Hg、Cu和Pb的含量見表3。按照中國的重金屬有害元素限量[15]：Cu≤20 mg/kg、Pb≤5 mg/kg、As≤2 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg,樣品中有1批Hg超標(biāo),2批As超標(biāo)。

表3 消栓通絡(luò)片中5種元素測定結(jié)果 (mg/kg)

2.2.7 風(fēng)險評價重金屬進入人體易在皮膚、肝臟、腎臟等蓄積造成中毒損傷[10],從2.2.6項下測定結(jié)果可知,有部分樣品的重金屬含量超過限度值,這有必要對不同企業(yè)的15批樣品的整體安全風(fēng)險進行評估。采用中國食品藥品檢定研究院發(fā)布的中藥中外源性有害殘留物安全風(fēng)險評估技術(shù)指導(dǎo)原則(Guideline of risk assessment of exogenous harmful residues in traditional Chinese medicines, GRAEHRTCM)和美國環(huán)境保護署(Environmental Protection Agency,EPA)推薦的健康風(fēng)險評估(Health risk assessment,HRA)2種模型對安全風(fēng)險進行分析:(1)GRAEHRTCM模型:①HI=IR×C×EF×Ed×10/(AT×W×HBGV) ,式①中,IR為制劑每日服入最大值,為6.84 g;C 為所有樣品某重金屬含量的平均值(mg/kg);EF為中藥制劑的暴露頻率,指導(dǎo)值為90 d/年;Ed為中藥服用年限20年;AT為平均壽命天數(shù),指導(dǎo)值為25550 d;W為人體體質(zhì)量,成年人體質(zhì)量以63 kg計;10為安全因子;HBGV為重金屬的健康指導(dǎo)值,As、Cu、Hg、Pb和Cd的HBGV 分別為2.1、50、0.57、3.6、0.83 μg/kg[10]。若HI>1,風(fēng)險出現(xiàn)概率較高,需要關(guān)注。通過計算,Cu、As、Cd、Hg、Pb的HI分別為0.003、0.245、0.010、0.009、0.012,均小于1,且5種元素的HI疊加值為0.279,低于安全閾值[11]。(2) HRA模型:②HI=(F×C/BW)/ADI,式②中,F 為消栓通絡(luò)片每日服用量,同式①中的IR; C 為藥品某重金屬的殘留值,同式①;BW 是人體質(zhì)量,此處采用國際通用標(biāo)準(zhǔn)成人為55.9 kg;ADI 同式①中的HBGV 。經(jīng)算Cu、As、Cd、Hg、Pb的HI值分別為0.005、0.393、0.016、0.014和0.018。5種元素的風(fēng)險大小順序依次為As>Pb>Cd>Hg>Cu,5種重金屬的疊加風(fēng)險值HI為0.446,小于1,提示該品種殘留的5種重金屬元素產(chǎn)生的安全風(fēng)險較小[12]。

3 討論

中國藥典以人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1[3]對消栓通絡(luò)片中的三七進行了定性定量控制,這對三七原料的質(zhì)量控制起到了一定作用,然而相對于多年生的三七根資源,三七莖葉資源易得、價格便宜,且均含有三七根的上述3種成分[13,14],不法企業(yè)便有可乘之機,以三七莖葉冒充摻偽三七根投料生產(chǎn),達到以假亂真、以次充好之效。為遏制這種不法行為,不少科研者對含三七的中藥制劑的三七莖葉檢查方法進行了研究,范可青等[15]采用HPLC法對復(fù)方丹參片中三七莖葉進行檢查,通過比對三七莖葉、三七根和制劑色譜峰的差異評估該制劑三七的摻偽情況。相比于HPLC法,薄層色譜法快速、簡便、檢測成本低,本研究首次采用薄層色譜法建立了消栓通絡(luò)片中三七莖葉的篩查法,該法也可有效區(qū)分三七與三七莖葉的差異,能準(zhǔn)確判斷消栓通絡(luò)片中是否存在三七莖葉冒充三七投料行為,可作為該制劑質(zhì)量控制補充檢驗方法的一種借鑒。

Hg、Pb中毒嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16],As、Cd具有明確的致癌、致畸及致突變作用[17-19],中藥制劑若重金屬含量過高,可能會良藥變成毒藥,這有必要對中藥制劑中多種重金屬有害元素殘留量進行監(jiān)測。本研究采用ICP-MS法測定消栓通絡(luò)片中5種重金屬殘留量,并首次采用GARM和HRA 2種模型對其重金屬可能導(dǎo)致的安全風(fēng)險進行分析,結(jié)果表明所抽取的樣品整體上重金屬殘留量較低,出現(xiàn)安全風(fēng)險的概率較低。但需要注意的是有個別生產(chǎn)企業(yè)樣品重金屬殘留量超標(biāo)問題,如A企業(yè)樣品(批號:1812120)中As的含量是限量值的44倍以上,這有可能會超過人體耐受值,造成中毒損傷。該制劑的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中無重金屬檢查項,部分生產(chǎn)企業(yè)在該制劑生產(chǎn)過程中可能會忽視外源性重金屬帶來的污染,為有效降低重金屬所致的安全風(fēng)險,建議在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中補充重金屬檢查項。