混菌固態(tài)發(fā)酵米糠產(chǎn)谷維素的工藝及抗氧化活性評估

夏欣欣林 海楊谷良彭 霞賀辛樂

(1. 國家黑茶產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心〔湖南〕,湖南 益陽 413000;2. 益陽市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,湖南 益陽 413000;3. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410004;4. 湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湖南 長沙 410125)

米糠作為稻谷加工中的副產(chǎn)物,在中國年產(chǎn)量高達1 000萬t。米糠營養(yǎng)豐富,是稻谷產(chǎn)業(yè)中的重要組成部分[1]。谷維素又叫米糠素,是一種阿魏酸酯混合物,在非皂化性米糠油中,谷維素的含量為0.9%～2.9%[2]。谷維素作為米糠中最重要的抗氧化活性物質(zhì)之一,有著優(yōu)越的熱加工穩(wěn)定性[3]。研究表明,谷維素具有多種生理功能,如降低血脂[4]、減少肝臟脂質(zhì)水平[5]、抗氧化[6]、調(diào)節(jié)胃腸道功能[7]等。

目前制備米糠谷維素的方法有弱酸取代法、多溶劑浸提法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法[8]等。其中,弱酸取代法具有操作簡單、成本低、產(chǎn)品質(zhì)量好的優(yōu)點,但是甲醇損耗大,得率低[9];多溶劑浸提法制備的谷維素得率和純度較高,但是工藝復(fù)雜,成本較高[10];超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法具有提取效率高,純度高的優(yōu)點,但是存在操作復(fù)雜、設(shè)備成本高、能耗高等不足[11-12]。微生物可利用環(huán)境中的碳水化合物等產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等多種酶系,通過催化特定化學(xué)鍵的斷裂,從而將活性成分從植物基質(zhì)中釋放出來[13]。微生物發(fā)酵能促進米糠中氨基酸[14]、活性多肽[15]24-25、γ-氨基丁酸[16]、可溶性膳食纖維[17]等功能成分的滲出,改善米糠功能活性和品質(zhì)。已有研究[18]56-57[19]21-25表明,枯草芽孢桿菌、紫紅曲霉通過發(fā)酵米糠、苦蕎碎米富集谷維素含量為1.59～4.51 mg/g,用時48～216 h。糙米經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后,其谷維素含量明顯高于未發(fā)酵糙米[20]。說明微生物處理是富集米糠谷維素的一種現(xiàn)實可行的方法,但是現(xiàn)有技術(shù)制備提取米糠谷維素得率偏低,用時偏長。

固態(tài)發(fā)酵因成本低、操作簡單、反應(yīng)條件溫和、適合規(guī)模化生產(chǎn)而受到青睞。研究擬先篩選適宜米糠固態(tài)發(fā)酵的菌株,再對其固態(tài)發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,對發(fā)酵提取物的抗氧化活性進行評價,并通過掃描電鏡(SEM)分析混菌固態(tài)發(fā)酵對米糠結(jié)構(gòu)的影響,旨在為米糠谷維素的高效、綠色富集工藝及產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮米糠:2022年8月購于湖南益陽;

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum):湖南省微生物研究院;

黑曲霉(Aspergillusniger)、平菇曲霉(Aspergillushiratsukae)、冠突散囊菌(Eurotiumcristatum):中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保藏;

谷維素標準品:純度為99.5%,日本TCI公司;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS):上海麥克林生化科技有限公司;

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(YEPD)培養(yǎng)基:廣東環(huán)凱微生物有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

精密恒溫培養(yǎng)箱:BPH-9162型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;

超凈化工作臺:SW-CJ-1F型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;

液相色譜儀:LC-20AB,日本島津公司;

立式壓力蒸汽滅菌鍋:LDZX-50KBS型,上海申安醫(yī)療器械廠;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:YRE-2000B型,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;

超聲波清洗器:DS-2510DTH型,上海奧析科學(xué)儀器有限公司;

臺式低速離心機:CFG-4.5D型,濟南中天生物科技有限公司;

掃描電子顯微鏡:Hitachi Regulus8100型,日立科學(xué)儀器(北京)有限公司;

濺射鍍膜儀:Quorum SC7620型,英國Quorum公司。

1.2 方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵米糠

(1) 菌液制備:取保存的6株菌種各一環(huán)接種到相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基中,其中植物乳桿菌(MRS培養(yǎng)基)和枯草芽孢桿菌(LB培養(yǎng)基)于37 ℃培養(yǎng)24 h,釀酒酵母(YEPD培養(yǎng)基)于30 ℃培養(yǎng)24 h,黑曲霉、平菇曲霉和冠突散囊菌(PDA培養(yǎng)基)于30 ℃培養(yǎng)96 h,待各菌種長滿斜面后,適量無菌水洗滌,用接種環(huán)輕輕將菌種刮下,收集菌懸液。其中,釀酒酵母、黑曲霉、平菇曲霉和冠突散囊菌用血球計數(shù)板計數(shù),植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌用平板計算法計數(shù),調(diào)整各菌懸液含菌數(shù)為1.0×107CFU/mL。

(2) 發(fā)酵基質(zhì)制備:將新鮮米糠過20目篩,稱取適量新鮮米糠于發(fā)酵袋中,加入一定比例的水,充分潤濕均勻,套好封口,121 ℃下滅菌30 min,冷卻,備用。

(3) 固態(tài)發(fā)酵:將準備好的菌懸液分別接入發(fā)酵袋中,充分混勻,放入適宜溫度的培養(yǎng)箱中,每隔24 h翻料和補水(3 mL)一次,發(fā)酵結(jié)束,放入60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重,備用。

1.2.2 菌種篩選 設(shè)定裝料量30 g,接種量6%,含水量50%,發(fā)酵溫度37 ℃,固定其他條件,分別考察植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵時間(0,12,24,36,48,72 h)對米糠谷維素含量的影響;設(shè)定裝料量30 g,接種量6%,含水量50%,發(fā)酵溫度30 ℃,固定其他條件,考察釀酒酵母發(fā)酵時間(0,12,24,36,48,72 h)對米糠谷維素含量的影響;設(shè)定裝料量30 g,接種量6%,含水量50%,發(fā)酵溫度30 ℃,固定其他條件,考察黑曲霉、平菇曲霉和冠突散囊菌發(fā)酵時間(0,1,3,5,7,9 d)對米糠谷維素含量的影響。

1.2.3 發(fā)酵條件單因素試驗 設(shè)定釀酒酵母與枯草芽孢桿菌菌液體積比1∶1,發(fā)酵裝料量30 g,接種量6%,含水量50%,發(fā)酵時間24 h,發(fā)酵溫度37 ℃,固定其他條件,分別考察發(fā)酵時間(12,24,36,48,72 h)、發(fā)酵溫度(28,30,33,37,40 ℃)、接種量(3%,6%,9%,12%,15%)、含水量(35%,40%,45%,50%,55%)對米糠谷維素含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面試驗。

1.2.5 固態(tài)發(fā)酵提取物制備 準確稱取發(fā)酵米糠1 g,加入5 mL的甲醇,采用超聲波進行提取,15 min/次,提取結(jié)束,5 000 r/min離心10 min,收集上清液,重復(fù)提取3次,減壓濃縮,定容至25 mL后待測。

1.2.6 溶劑浸提法樣品制備 在Kumar等[12]方法的基礎(chǔ)上進行微小調(diào)整,準確稱取干燥至恒重的米糠1 g,加入5 mL的甲醇,于38 ℃水浴鍋中浸提60 min,5 000 r/min離心10 min,收集上清液,重復(fù)提取3次,減壓濃縮,定容后待測。

1.2.7 未發(fā)酵樣品制備 準確稱取干燥至恒重的米糠1 g,加入5 mL的甲醇,后續(xù)提取方法參照1.2.5。

1.2.8 HPLC檢測 根據(jù)Zhang等[20]的方法修改如下:色譜柱為InertSustain C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為乙酸—乙腈—甲醇(V乙酸∶V乙腈∶V甲醇=3∶44∶53),流速1.0 min/mL,波長326 nm,分析時間50 min。

通過表1可以得出模型階數(shù)越高,殘差越小,相應(yīng)的AIC準則越小,但階數(shù)越高計算越繁瑣,綜合考慮該文取AR(2)模型作為陀螺隨機誤差模型。具體模型如下:

1.2.9 抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除能力:參照韋濤等[21]的方法。

(2) ABTS自由基清除能力:參照伍蓉等[22]的方法。

1.2.10 掃描電鏡(SEM)分析 米糠經(jīng)不同方法處理后烘干,取微量樣品粘到導(dǎo)電膠上,使用濺射鍍膜儀噴金,噴金為10 mA,在加速電壓為3 000 V下使用掃描電子顯微鏡拍攝樣品形貌,放大2 000倍進行觀察。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理方法 通過Design-Expert 11、SPSS軟件、Excel軟件和GraphPad Prism 8.0.1進行試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析及繪圖,各試驗均重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種對米糠中谷維素含量的影響

如圖1所示,隨著發(fā)酵時間的延長,米糠中谷維素含量整體呈先升后降的趨勢。其中,釀酒酵母和植物乳桿菌在發(fā)酵48 h時谷維素含量達到最大值;枯草芽孢桿菌在發(fā)酵24 h時谷維素含量達到最大值;黑曲霉在發(fā)酵3 d時谷維素含量達到最大值;平菇曲霉和冠突散囊菌在發(fā)酵7 d時谷維素含量達到最大值。在3種霉菌中,黑曲霉活性相對較強、繁殖較快,但研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉在一定條件下可代謝產(chǎn)生阿魏酸酯酶,谷維素在此酶作用下會發(fā)生降解[23]。冠突散囊菌能促進茶葉、豆類、谷物中多酚、總黃酮及多糖含量的增加[24]。但是冠突散囊菌和平菇曲霉發(fā)酵米糠制備谷維素的研究鮮有報道,試驗過程中發(fā)現(xiàn),冠突散囊菌和平菇曲霉具有促進米糠中谷維素釋放的作用,但對谷維素的富集用時相對偏長。以上結(jié)果可以看出,不同菌種處理對谷維素的含量存在一定的差異,同一菌種不同發(fā)酵時間對谷維素含量的影響差異顯著,可能與其生長速度、所產(chǎn)酶系等因素有關(guān)。綜合考慮谷維素富集效果和發(fā)酵時間,選取釀酒酵母和枯草芽孢桿菌進行后續(xù)試驗。枯草腸桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母混合發(fā)酵豆粕(菌液體積比1∶1)時,糖化酶、β-淀粉酶、蛋白酶活力最高值明顯高于單一菌種[25]。因此,選取釀酒酵母(1.0×107CFU/mL)菌液和枯草芽孢桿菌(1.0×107CFU/mL)菌液體積比為1∶1,接種量6%,含水量50%,發(fā)酵時間24 h,發(fā)酵溫度33 ℃,谷維素含量為(6.786±0.160) mg/g,高于單一菌種發(fā)酵制備的谷維素含量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 發(fā)酵條件對米糠中谷維素含量影響的單因素試驗

由圖2可知,隨著發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量和含水量的增加,米糠中谷維素含量均呈先升高后下降的趨勢。這是因為釀酒酵母和枯草芽孢桿菌達到對數(shù)生長期需要一定的時間,當(dāng)其充分生長繁殖時才能利用發(fā)酵基質(zhì)分泌大量的代謝物,如纖維素酶等,從而作用于植物細胞壁,促進活性物質(zhì)的釋放[20,26]。當(dāng)發(fā)酵時間過長時,發(fā)酵體系營養(yǎng)物質(zhì)消耗,其他有害物質(zhì)過度積累,細胞可能出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象,致使谷維素氧化或降解[27]。發(fā)酵溫度直接影響微生物的生長速度,溫度過低或過高都不利于菌種的繁殖和代謝。釀酒酵母和枯草芽孢桿菌的接種量越多,分泌的纖維素酶、果膠酶等越多,發(fā)酵效率越高,但是發(fā)酵基質(zhì)是固定的,當(dāng)接種量過多時,每個細胞所獲得的營養(yǎng)物質(zhì)會減少,細胞生長受到抑制,同時供氧不足也會導(dǎo)致好氧菌產(chǎn)酶下降?；炀虘B(tài)發(fā)酵時,發(fā)酵基質(zhì)中的含水量直接影響發(fā)酵效率,含水量偏低不能滿足釀酒酵母和枯草芽孢桿菌自身代謝所需,含水量偏高時,發(fā)酵體系中通氣性較差,枯草芽孢桿菌作為好氧菌生長受到抑制[18]8。因此,選取發(fā)酵時間36 h,發(fā)酵溫度33 ℃,接種量9%,含水量40%進行后續(xù)試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 試驗設(shè)計 基于單因素試驗結(jié)果,選擇發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化,各因素水平見表1,試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 試驗設(shè)計因素與水平表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面模型建立與方差分析 通過Design-Expert 11對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行分析,得到谷維素含量與各因素的二次多項式方程:

Y=7.77+0.21A+0.30B+0.15C-0.02AB+0.10AC+0.03BC-0.21A2-1.07B2-0.36C2。

(1)

由表3可知,模型P=0.000 2<0.01,極顯著;失擬項P=0.398 3>0.05,不顯著,表明該回歸方程擬合較好。模型中A、B、B2、C2的P值均小于0.01,對谷維素含量的影響極顯著;C和A2的P值均小于0.05,對谷維素含量的影響顯著。各因素對谷維素含量的影響從大到小依次為發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>接種量。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果?

由圖3可知,發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量、發(fā)酵時間和接種量均相互影響但交互作用不顯著。

圖3 各因素交互作用對米糠中谷維素含量的影響

2.3.3 實驗驗證 根據(jù)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)發(fā)酵工藝:發(fā)酵時間43.8 h、發(fā)酵溫度33.9 ℃、接種量9.7%,此條件下谷維素含量預(yù)測值為7.866 mg/g。為了方便操作,將最優(yōu)發(fā)酵工藝調(diào)整為發(fā)酵時間44 h,發(fā)酵溫度34 ℃,接種量10%,含水量40%,在此條件下制備的發(fā)酵米糠中谷維素含量為(7.816±0.038) mg/g,與預(yù)測值接近,說明模型擬合較好,工藝可行。

苗圃[18]56-57采用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵米糠120 h,經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后,谷維素含量由未發(fā)酵的2.76 mg/g提高到4.51 mg/g。采用紫紅曲霉固態(tài)發(fā)酵苦蕎碎米9 d,測得谷維素含量最高為1.59 mg/g[19]24。馮海燕[28]利用枯草芽孢桿菌XZI125改善米糠營養(yǎng)價值,通過固態(tài)發(fā)酵72 h,測得其谷維素含量分別為4.48 mg/g,而原米糠中谷維素僅為2.38 mg/g。而采用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵,谷維素含量由未發(fā)酵米糠4.152 mg/g增加到7.816 mg/g,增加了1.9倍,且用時更短。

2.4 固態(tài)發(fā)酵對抗氧化活性的影響

2.4.1 DPPH自由基清除能力 為了評估混菌固態(tài)發(fā)酵法對抗氧化活性的影響,考察了溶劑浸提法、未發(fā)酵法和混菌固態(tài)發(fā)酵法對DPPH自由基清除能力的影響。從圖4可以看出,在米糠提取物質(zhì)量濃度為0.015 6～1.000 0 mg/mL時,隨著提取物濃度的升高,提取物對DPPH自由基清除率逐漸上升,后趨于平緩。其中,混菌固態(tài)發(fā)酵樣品制備的提取物清除DPPH自由基活性顯著強于溶劑浸提法和未發(fā)酵樣品制備的提取物,其IC50值分別為(0.220±0.007),(0.389±0.013),(0.308±0.058) mg/mL。這可能與混菌固態(tài)發(fā)酵法制備的提取物中抗氧化活性成分尤其是谷維素含量更高緊密相關(guān)。郭利娜[15]53-66采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵小米糠,經(jīng)體內(nèi)外抗氧化試驗證明,發(fā)酵小米糠對DPPH自由基清除率顯著高于谷胱甘肽,小鼠經(jīng)發(fā)酵小米糠處理后,體內(nèi)丙二醛含量明顯下降,超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活力顯著提高。Le等[29]研究發(fā)現(xiàn),米糠經(jīng)各乳酸菌發(fā)酵后,其發(fā)酵物(質(zhì)量濃度為2 mg/mL)最高可清除88.64%的DPPH自由基,是未發(fā)酵米糠的1.2倍。說明混菌固態(tài)發(fā)酵法對促進抗氧化活性成分釋放,增強抗氧化活性效果顯著。

圖4 混菌固態(tài)發(fā)酵對DPPH自由基清除率的影響

2.4.2 ABTS自由基清除能力 從圖5可以看出,在米糠提取物質(zhì)量濃度為0.015 6～1.000 0 mg/mL時,隨著提取物濃度的升高,ABTS自由基清除率逐漸增強。其中,混菌固態(tài)發(fā)酵樣品制備的提取物清除ABTS自由基活性要顯著高于溶劑浸提法和未發(fā)酵樣品制備的提取物,其IC50值分別為(0.409±0.014),(0.842±0.022),(0.678±0.032) mg/mL。發(fā)酵米糠提取物質(zhì)量濃度為0.500 0 mg/mL時,混菌固態(tài)發(fā)酵法、溶劑浸提法和未發(fā)酵樣品制備的提取物對ABTS自由基清除率分別為57.50%,27.83%,41.13%。將紅曲菌和枯草芽孢桿菌對燕麥進行連續(xù)發(fā)酵,發(fā)酵后的樣品清除ABTS自由基活性也顯著高于未發(fā)酵樣品[30]。該試驗結(jié)果與DPPH自由基清除結(jié)果趨勢一致,進一步說明與溶劑浸提法和未發(fā)酵米糠相比,混菌固態(tài)發(fā)酵米糠抗氧化活性更強。

2.5 掃描電鏡分析

為了從宏觀上觀察混菌固態(tài)發(fā)酵法對米糠的影響,研究采用掃描電鏡分析對米糠形態(tài)進行觀察。從圖6可以看出,新鮮米糠組織結(jié)構(gòu)致密,表面上附著一層泛有光澤的油脂。溶劑浸提后,米糠組織表面的油脂大大減少,但組織結(jié)構(gòu)基本保持完整。未發(fā)酵米糠因超聲波處理后,米糠組織表面的油脂大大減少,且組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一定程度的破碎。而固態(tài)發(fā)酵米糠組織表面油脂幾乎消失,且在超聲波處理下組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴重的破碎,有利于米糠中活性成分的釋放。

圖6 不同處理方式下米糠的掃描電鏡圖

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌和釀酒酵母具有富集谷維素的能力,這與纖維素酶、果膠酶等的活性相關(guān)。因此,篩選高水平表達纖維素酶、果膠酶的菌株,是高產(chǎn)米糠谷維素的有效途徑。試驗表明,釀酒酵母與枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵富集米糠谷維素的最優(yōu)工藝為發(fā)酵時間44 h,發(fā)酵溫度34 ℃,接種量10%,含水量40%,此條件下谷維素含量為(7.816±0.038) mg/g,是未發(fā)酵米糠中谷維素含量的1.9倍。但是,研究還未闡明不同培養(yǎng)條件下,枯草芽孢桿菌和釀酒酵母中該酶的活性差異,在后續(xù)研究中,將聚焦這方面的研究。