基于QuEChERS-高效液相色譜法測定油炸食品中丙烯酰胺含量

董文靜 戴盡波 聶榮榮 沈 潔 葉彩平 蔡智濤

(梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗所,廣東 梅州 514071)

丙烯酰胺(acrylamide)為不飽和酰胺[1],其單體具有多種毒性及潛在致癌性[2-3]。丙烯酰胺暴露量0.000 5 mg/kg為常人每天允許的最大暴露量。世界衛(wèi)生組織(WHO)指出,丙烯酰胺對神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的損傷作用[4],具有神經(jīng)毒性[5]。國際腫瘤機構(IARC)將其認定為2A類致癌物[6]。

丙烯酰胺廣泛存在于各種食品中,尤其是經(jīng)高溫加工的富含淀粉類食品,其含量遠遠超過飲用水中規(guī)定的限量(0.5 μg/kg)[7]。2002年瑞典國家食品管理局與斯德哥爾摩大學研究人員[8]在一些油炸和燒烤的淀粉類食品中檢測到丙烯酰胺, 之后英國、挪威、美國、澳大利亞、新西蘭、加拿大等國家也報道了類似檢測結果[9-10]。2019年5月,國家食品安全風險評估中心將丙烯酰胺的風險監(jiān)測納入2020年食品安全風險監(jiān)測計劃之中[11]。油炸食品中丙烯酰胺含量最高[12],一般在加工溫度高于100 ℃時才會產(chǎn)生丙烯酰胺,且隨著高溫烹飪時間的延長丙烯酰胺的生成量逐漸增多[13]。

食品中丙烯酰胺的檢測方法通常有液相色譜法、液相色譜—質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜法、光譜法等。氣相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用技術需對分析物進行衍生化處理,前處理操作復雜,相對費時,不適宜大批量的處理分析。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法可有效排除檢測物中雜質(zhì)的影響,回收率較高,但對儀器要求高。液相色譜在傳統(tǒng)反相吸附柱中選擇性略低,適用于油炸、烘烤等丙烯酰胺含量高的食品檢測[14-21]。QuEChERS法是一種快速、簡便,對試驗器材和試劑要求不高的前處理方法。林濤等[22]使用QuEChERS結合超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定了咖啡中丙烯酰胺含量;歐陽小艷等[23]使用QuEChERS結合超高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定了焙烤蛋糕中的丙烯酰胺含量。研究擬將新型材料碳十八碳鍵合鋯膠(Z-Sep+)與C18應用于油炸食品中丙烯酰胺測定的前處理中,建立一種采用QuEChERS方法進行前處理,高效液相色譜和二極管陣列檢測器進行測定的檢測方法,以期為油炸食品中丙烯酰胺的篩查監(jiān)測工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、丙酮、甲醇:色譜純,美國ACS恩科化學;

C18:40～60 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司;

PSA:天津博納艾杰爾科技有限公司;

Z-Sep+:美國Supelco公司;

丙烯酰胺標準品:1 000 μg/mL,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所;

餅干中丙烯酰胺分析質(zhì)控樣品:MRM0276,北京美正檢測技術有限公司;

炸薯片:樂事薯片有限公司;

炸芋圓、炸馓子、炸南瓜圓:市售。

1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀:LC-20AT型,配備SPD-M20A二極管陣列檢測器,日本島津公司;

電子分析天平:AUW220型,日本島津公司;

全自動平行濃縮儀:AutoEVA-60型,?？萍瘓F股份有限公司;

高速冷凍離心機:ST16R型,美國Thermo Fisher公司;

調(diào)速多用振蕩器:HY-4型,金壇市宏華儀器廠;

超純水系統(tǒng):Milli Q型,美國Millipore公司。

1.3 樣品前處理

油炸食品經(jīng)高速粉碎機粉碎后過40目篩,于-18 ℃貯藏備用。稱取2 g經(jīng)粉碎后的油炸食品,加入10 mL正己烷脫脂,7 000 r/min離心5 min,棄去上層清液,待樣品中殘余正己烷完全揮發(fā)后加入10 mL甲醇,振搖30 min,7 000 r/min離心5 min,吸取8 mL上清液,加入150 mg Z-Sep+及200 mg C18,渦旋凈化1 min,7 000 r/min離心5 min,吸取7 mL上清液,室溫氮吹至干,用1 mL超純水復溶,過0.45 μm尼龍66濾膜,上機待測。

1.4 色譜條件

色譜柱為Capcell PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A為甲醇,流動相B為超純水;柱溫25 ℃;流速1 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長197 nm;等度洗脫比例:5% A+95% B。

2 結果與分析

2.1 凈化材料的選擇

采用Plackett-Burman試驗(n=12),考察PSA用量、C18用量、Z-Sep+用量 3個因素在QuEChERS前處理方法中的凈化效果,試驗因素水平見表1,試驗設計及結果見表2。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平

由表2可知,單獨使用PSA凈化時,回收率最低,甚至低于未使用凈化材料的對照組,隨著Z-Sep+和C18的加入,回收率有不同程度的上升,Z-Sep+和C18配合使用的回收率高于單獨使用時的。為了更直觀地體現(xiàn)3種凈化材料的使用對回收率的影響,運用Minitab 18軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析處理,以回收率作為響應值,結果用標準化帕累托圖表示(見圖1)。

基準參照線表示99%置信區(qū)間(P<0.01)

由圖1可知,C18和Z-Sep+的標準化效應值超過了基準參照線,表明這兩個因素對回收率影響顯著,影響丙烯酰胺回收率因素顯著性為C18> Z-Sep+。與未使用Z-Sep+的處理組相比,使用Z-Sep+處理后的色譜圖雜質(zhì)峰更小;而使用PSA處理后,在緊挨著丙烯酰胺色譜峰的位置之后出現(xiàn)了一個巨大的雜質(zhì)峰,可能是PSA本身引入的雜質(zhì),導致信噪比與回收率降低。后續(xù)試驗以C18和Z-Sep+兩種因素作為主要因素進行優(yōu)化。

2.2 凈化材料比例與提取溶劑的選擇

在單因素試驗基礎上,對C18用量、Z-Sep+用量、提取溶劑的選擇進行正交試驗設計。由于丙烯酰胺屬于食品中內(nèi)源性污染物[24],為充分考察待優(yōu)化因素的真實提取效率和凈化效果,使用丙烯酰胺分析質(zhì)控樣品作為試驗樣品,以測量值與質(zhì)控樣品真實值間的誤差準確度,誤差越小,代表準確度越高。試驗因素水平見表3,試驗設計及結果見表4。

表3 正交試驗設計因素與水平

表4 正交試驗設計與結果

由表4可知,以乙腈作為提取溶劑時誤差普遍偏高,說明以丙酮或甲醇作為提取溶劑更合適。當C18用量提高時,誤差的變化趨勢逐漸減小;當Z-Sep+用量變化時,誤差的變化趨勢不易直觀看出。為了更直觀地體現(xiàn)兩種凈化材料在不同用量時對誤差的影響,以及不同提取溶劑對試驗結果影響的優(yōu)劣程度,使用SPSS軟件對試驗結果進行方差分析,以準確度的估算邊際均值為縱坐標,單因素變量為橫坐標,繪制方差的單變量分析圖如圖2所示。

圖2 準確度與提取溶劑、C18用量、Z-Sep+用量的方差分析圖

由圖2可知,當Z-Sep+用量增大時,誤差反而升高,可能是由于過量Z-Sep+吸附了部分待測物使結果偏離真值。當C18用量為50～200 mg時,誤差隨C18用量的增加而減小,說明C18對油炸食品中雜質(zhì)的吸附效果較好,在此范圍內(nèi)增加C18用量可以有效減少結果誤差。C18和Z-Sep+吸附的雜質(zhì)種類不同,配合使用時可凈化樣品中大部分雜質(zhì),凈化效果優(yōu)于單獨使用。使用甲醇作為提取溶劑時,提取效率最高,誤差最小,丙酮其次,乙腈的提取效率最低。因此,最佳提取條件為甲醇為提取溶劑,Z-Sep+用量75 mg, C18用量200 mg。

2.3 流動相比例的選擇

預試驗發(fā)現(xiàn),甲醇—水、乙腈—水均有較好的分離效果,試驗選擇甲醇—水為流動相,通過考察不同體積比(V甲醇∶V水為30∶70,20∶80,10∶90,5∶95,2∶98)下甲醇—水的分離效果來確定最佳的流動相比例。

由圖3可知,隨著流動相中水所占比例的升高,丙烯酰胺的保留時間也逐漸后移,當V甲醇∶V水為30∶70～10∶90時,丙烯酰胺的保留時間為2～4 min;當V甲醇∶V水上升至5∶95時,丙烯酰胺的保留時間為4.302 min;當V甲醇∶V水為2∶98時,丙烯酰胺的保留時間為4.928 min。由圖4可知,樣品中的雜質(zhì)峰主要集中在2～4 min,丙烯酰胺保留時間若晚于4 min有利于待測物與雜質(zhì)更好的分離。當V甲醇∶V水為5∶95時,丙烯酰胺峰面積最大,響應值最高。常立偉等[25]采用高效液相色譜法測定薯條中的丙烯酰胺,所用流動相V甲醇∶V水為0.5∶99.5,與試驗結果接近。但試驗發(fā)現(xiàn),水的比例并非越高越好,結合保留時間與響應值,選擇V甲醇∶V水為5∶95作為丙烯酰胺檢測的流動相。

圖3 不同流動相比例下液相色譜圖

圖4 QuEChERS法提取炸芋圓中丙烯酰胺的高效液相色譜圖

2.4 檢測波長的選擇

由圖5可知,丙烯酰胺在190～250 nm處均有吸收,最大吸收波長為197.56 nm。通過不同波長下標準曲線的響應值與信噪比也可看出,197 nm下丙烯酰胺的峰面積與信噪比最大。因此,選用197 nm作為丙烯酰胺的檢測波長。

圖5 丙烯酰胺在190～300 nm的吸收光譜圖

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系、檢出限和定量限 配制質(zhì)量濃度為0.1～2.0 mg/L的一系列丙烯酰胺標準溶液,按1.4的色譜條件進行測定。以丙烯酰胺峰面積為縱坐標,質(zhì)量濃度為橫坐標,繪制丙烯酰胺的標準曲線方程為Y=92 039.8X+1 068.39,R2=0.999 4,檢出限為0.007 mg/kg,定量限為0.02 mg/kg,與GB 5009.204—2014中規(guī)定的定量限(0.01 mg/kg)接近,且大大簡化了使用儀器和前處理過程,可以滿足日常油炸食品中丙烯酰胺含量的篩查與監(jiān)測。

2.5.2 精密度和穩(wěn)定性 稱取6份丙烯酰胺質(zhì)控樣,按1.3的方法進行前處理,結果表明,該方法相對標準偏差為0.66%,重復性良好。

選取一份待測樣品,分別在制備后的0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h時進樣測定,結果顯示丙烯酰胺的日內(nèi)精密度為1.00%,表示樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。選取一份待測樣品,分別在制備后的0,1,2 d進樣測定,結果顯示丙烯酰胺的日間精密度為0.14%,表示樣品溶液可在3 d內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5.3 回收率 在丙烯酰胺質(zhì)控樣中添加丙烯酰胺標準溶液,根據(jù)國家食品安全風險評估中心發(fā)布的《食品中丙烯酰胺的危險性評估》中列出的不同食品的丙烯酰胺含量可知,大部分油炸食品的丙烯酰胺含量為0.2～1.0 mg/L。試驗在0.2,0.5,1.0 mg/L 3個水平下進行加標回收試驗,結果見表5。

表5 丙烯酰胺的回收率和相對標準偏差

由表5可知,當加標量為0.2～1.0 mg/L時,樣品回收率均>90%,RSD均<2%,說明試驗方法回收率良好,精密度高,結果穩(wěn)定。

2.6 實際樣品測定

由表6可知,4種不同食品基質(zhì)的油炸食品中,以土豆片為基質(zhì)的炸薯片中的丙烯酰胺含量最高,其次是以南瓜絲為基質(zhì)的炸南瓜圓,兩種炸品的丙烯酰胺含量均>0.5 mg/kg。以芋頭絲為基質(zhì)的炸芋圓中的丙烯酰胺含量相對較低,含量最低的為以小麥粉面團為基質(zhì)的炸馓子。食品原料對油炸食品中丙烯酰胺含量的影響為土豆片>芋絲>南瓜絲>面團。由于南瓜含有天然色素,導致炸南瓜圓的樣品提取液顏色較黃,經(jīng)凈化后顏色變淺,并未影響試驗結果,說明試驗方法對含有一定量色素的樣品同樣具備較好的檢測能力,可以適應多種不同油炸食品中丙烯酰胺含量的檢測。

表6 不同油炸食品中丙烯酰胺含量

3 結論

研究采用新型材料碳十八鍵合鋯膠(Z-Sep+)結合C18作為凈化材料應用于油炸食品中丙烯酰胺含量的測定,建立了一種簡便、高效的QuEChERS前處理方法。與傳統(tǒng)方法相比,試驗方法打破了丙烯酰胺檢測中使用QuEChERS前處理必須配備質(zhì)譜檢測器的固定模式,在簡化前處理過程的同時,降低了對儀器的要求,可以滿足日常對油炸食品中丙烯酰胺的篩查監(jiān)測工作,尤其適合儀器條件有限的基層檢測單位和一些經(jīng)費有限的研究機構進行油炸食品中丙烯酰胺含量的科研監(jiān)測工作。后續(xù)可以此為延伸,對凈化材料進行更多的調(diào)整,為其他食品中丙烯酰胺含量的測定提供依據(jù)。