量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條檢測(cè)雞蛋中恩諾沙星的性能評(píng)價(jià)

張富生王宇宸盧禮生鄧家軍陳俊松楊琳芬郭 靜吳仁偉賴(lài)衛(wèi)華

(1. 江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心,江西 南昌 330077;2. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047;3. 九江市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,江西 九江 332000)

恩諾沙星屬于喹諾酮類(lèi)廣譜抗菌藥,對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均有良好的抗菌作用,在降低畜禽動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率等方面起到十分顯著的作用,已成為現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖業(yè)中不可缺少的藥物之一[1]。但是,畜牧業(yè)中濫用恩諾沙星和超標(biāo)使用恩諾沙星的現(xiàn)象普遍存在[2-3],其后果一方面是導(dǎo)致動(dòng)物性食品中存在獸藥殘留,影響人類(lèi)的健康;另一方面,各種養(yǎng)殖場(chǎng)大量排泄物向周?chē)h(huán)境排放,獸藥又成為環(huán)境污染物,給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)不利影響[4]。

中國(guó)對(duì)獸藥使用和殘留污染防控非常重視,GB 31650—2019和GB 31650.1—2022對(duì)各種食品中的獸藥殘留有明確限量規(guī)定,其中恩諾沙星在魚(yú)、家禽、豬、牛、羊和其他動(dòng)物組織中不得超過(guò)100 μg/kg,在禽蛋中不得超過(guò)10 μg/kg。

目前,恩諾沙星的主要檢測(cè)方法有高效液相色譜法[5-6]、質(zhì)譜聯(lián)用法[7-10]、表面增強(qiáng)拉曼散射法[11-14]、酶聯(lián)免疫吸附法[15-16]和免疫層析檢測(cè)方法[17-21]等。其中, GB/T 21312—2007是確證方法,可以對(duì)恩諾沙星進(jìn)行精確定量檢測(cè),但其設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)等,因而無(wú)法滿(mǎn)足大批量樣本快速篩查的需要。目前,國(guó)家對(duì)食品安全的重視程度不斷提高,對(duì)快速檢測(cè)產(chǎn)品的需求越來(lái)越大,對(duì)食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)的要求越來(lái)越嚴(yán)格,對(duì)食品安全快速檢測(cè)方法靈敏度的要求也隨之提高。靈敏度要求非常高的情況下,傳統(tǒng)的快檢方法通過(guò)肉眼進(jìn)行顏色深淺的判斷,主觀性強(qiáng),容易造成誤差,出現(xiàn)較多的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果,也無(wú)法提供數(shù)字化結(jié)果[22-24]。

量子點(diǎn)微球熒光免疫層析法是一種新型快速檢測(cè)技術(shù)[25]。使用結(jié)構(gòu)性能和光學(xué)性能優(yōu)異的量子點(diǎn)熒光微球作為標(biāo)記物,基于競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析技術(shù)原理,通過(guò)便攜式熒光讀取儀進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和分析,根據(jù)已設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中待測(cè)物質(zhì)含量,對(duì)動(dòng)物源性食品中金剛烷胺進(jìn)行定量檢測(cè),提高了檢測(cè)靈敏度,實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物的數(shù)字化檢測(cè),減少了人為因素導(dǎo)致的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局2023年1月發(fā)布了《關(guān)于規(guī)范食品快速檢測(cè)使用的意見(jiàn)》[26],研究擬參照其附件4《食品快速檢測(cè)產(chǎn)品符合性評(píng)價(jià)技術(shù)要求》,對(duì)恩諾沙星(雞蛋)量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快檢產(chǎn)品進(jìn)行符合性評(píng)價(jià),以期為雞蛋中恩諾沙星的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查提供產(chǎn)品選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

干式熒光免疫分析儀:AF-100型,激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為365,610 nm,江西維邦生物科技有限公司;

恒溫孵育器:DH-200型,武漢鐘瑞生物科技有限公司;

天平:ZT-2型,0.01 g,上海贊維衡器有限公司;

振蕩器:JC-25型,金壇區(qū)白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠;

掌上離心機(jī):Meteor 7.2k型,寧波拓普森科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 主要材料

150個(gè)經(jīng)參比方法檢測(cè)為陰性的雞蛋樣本:市售;

50個(gè)與確證方法比較的實(shí)際雞蛋樣本:江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全專(zhuān)項(xiàng)監(jiān)測(cè)的50批次雞蛋樣品,編號(hào)為1～50;

恩諾沙星(雞蛋)量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條:定量檢測(cè)范圍為2.5～40.0 μg/kg,江西維邦生物科技有限公司;

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、馬坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、氟甲喹、噁喹酸和沙拉沙星等標(biāo)準(zhǔn)品:德國(guó)DR.E公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 盲樣樣本制備 按照GB 31650.1—2022要求,雞蛋中恩諾沙星的最大殘留限量為10 μg/kg。依據(jù)《關(guān)于規(guī)范食品快速檢測(cè)使用的意見(jiàn)》中附件4《食品快速檢測(cè)產(chǎn)品符合性評(píng)價(jià)技術(shù)要求》制備加標(biāo)樣本。使用經(jīng)參比方法檢測(cè)為陰性的雞蛋樣本進(jìn)行加標(biāo),因恩諾沙星屬于有國(guó)家限量要求的物質(zhì),制備3個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣本。空白樣品、標(biāo)準(zhǔn)限量要求的0.5倍濃度水平加標(biāo)樣本用以評(píng)價(jià)快檢方法的假陽(yáng)性率,每個(gè)濃度水平的樣本50份,標(biāo)準(zhǔn)限量要求1倍濃度水平的加標(biāo)樣本50份,用以考察快檢方法的假陰性率。

1.2.2 量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條的樣本前處理和檢測(cè)方法

(1) 樣本前處理:取樣部分按GB 31650 執(zhí)行(將雞蛋去殼后攪勻),準(zhǔn)確稱(chēng)取4 g樣本于50 mL離心管中,加入3 mL恩諾沙星樣本提取劑,漩渦振蕩混勻2 min,4 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確吸取100 μL上清于離心管中,加入500 μL恩諾沙星樣本稀釋液混勻,離心2 min,上層溶液即為備用待測(cè)液。

(2) 檢測(cè)方法:測(cè)試前打開(kāi)干式熒光免疫分析儀,將產(chǎn)品ID卡插入儀器讀取產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線,將恒溫孵育器設(shè)置反應(yīng)溫度為37 ℃,反應(yīng)時(shí)間為10 min。檢測(cè)時(shí)將恩諾沙星量子點(diǎn)微球熒光免疫層析快速檢測(cè)卡平放至恒溫孵育器上,用移液器吸取90 μL備用待測(cè)液加入檢測(cè)卡加樣孔中,37 ℃孵育10 min,反應(yīng)結(jié)束后將檢測(cè)卡插入干式熒光免疫分析儀檢測(cè)卡槽中進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取,儀器會(huì)自動(dòng)給出測(cè)試結(jié)果。

1.2.3 靈敏度評(píng)價(jià) 檢測(cè)恩諾沙星加標(biāo)濃度為10 μg/kg的樣本50份,并按式(1)計(jì)算靈敏度。

(1)

式中:

P+——靈敏度,%;

N11——檢出陽(yáng)性結(jié)果的陽(yáng)性樣品數(shù);

N1——總陽(yáng)性樣品數(shù)。

1.2.4 交叉反應(yīng)率評(píng)價(jià) 在空白樣本中添加環(huán)丙沙星、馬坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品,使其終質(zhì)量濃度為1 000 μg/L,用恩諾沙星量子點(diǎn)微球熒光免疫層析快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè),記錄檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的最小濃度,并按式(2)計(jì)算交叉反應(yīng)率。

(2)

式中:

CR——交叉反應(yīng)率,%;

C1——目標(biāo)物質(zhì)檢出限,μg/L;

C2——干擾物質(zhì)檢出陽(yáng)性時(shí)的最小質(zhì)量濃度,μg/L。

1.2.5 假陰性率和假陽(yáng)性率評(píng)價(jià) 依據(jù)《關(guān)于規(guī)范食品快速檢測(cè)使用的意見(jiàn)》中附件4《食品快速檢測(cè)產(chǎn)品符合性評(píng)價(jià)技術(shù)要求》,分別按式(3)、式(4)計(jì)算所有檢測(cè)結(jié)果中的假陰性率和假陽(yáng)性率。

(3)

(4)

式中:

N12——陽(yáng)性樣品的陰性結(jié)果數(shù);

N1——總陽(yáng)性樣品數(shù);

N21——陰性樣品的陽(yáng)性結(jié)果數(shù);

N2——總陰性樣品數(shù)。

1.2.6 實(shí)際雞蛋樣本的檢測(cè)比較 50個(gè)實(shí)際雞蛋樣本分別用GB/T 21312—2007和量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快檢方法進(jìn)行檢測(cè),并比較結(jié)果符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度

由表1可知,檢出陽(yáng)性結(jié)果的陽(yáng)性樣品數(shù)占總陽(yáng)性樣品數(shù)的百分比為100%,即靈敏度為100%。

表1 標(biāo)準(zhǔn)限量要求1倍濃度水平雞蛋(10 μg/kg)的量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果

2.2 交叉反應(yīng)率

由表2可知,恩諾沙星(雞蛋)量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條在檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物環(huán)丙沙星、馬坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、氟甲喹、噁喹酸和沙拉沙星時(shí),交叉反應(yīng)率均<0.1%。

表2 量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條的交叉反應(yīng)率

2.3 假陰性率和假陽(yáng)性率

由表3、表4可知,恩諾沙星量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條在檢測(cè)雞蛋中恩諾沙星時(shí),50個(gè)空白樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,50個(gè)標(biāo)準(zhǔn)限量要求的0.5倍濃度水平盲樣的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)50個(gè)陰性,100個(gè)陰性盲樣雞蛋的整體假陽(yáng)性率為0%。50個(gè)標(biāo)準(zhǔn)限量要求的1倍濃度水平盲樣的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,即量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條的假陰性率為0%。

表3 空白樣品雞蛋量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果?

表4 標(biāo)準(zhǔn)限量要求的0.5倍濃度水平雞蛋(5 μg/kg)量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果

2.4 實(shí)際雞蛋樣本檢測(cè)方法比較

由表5可知,采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)時(shí),5、36、40、42號(hào)樣品的檢測(cè)結(jié)果分別為0.73,0.57,5.57,21.90 μg/kg,其他樣品均未檢出。采用量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條檢測(cè)時(shí),40、42號(hào)樣品檢測(cè)結(jié)果分別為5.34,22.02 μg/kg,其他樣品均未檢出(量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條的定量檢測(cè)限為2.5 μg/kg),說(shuō)明液質(zhì)聯(lián)用法和量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果的符合率較高。

表5 實(shí)際雞蛋樣本檢測(cè)方法的比較?

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)恩諾沙星量子點(diǎn)微球熒光免疫層析產(chǎn)品評(píng)價(jià),結(jié)果顯示該方法可以滿(mǎn)足GB 31650.1—2022雞蛋中恩諾沙星殘留的國(guó)家限量要求,其靈敏度為100%,假陰性率為0%,假陽(yáng)性率為0%,實(shí)際雞蛋樣本檢測(cè)時(shí),與國(guó)家參比方法符合率高(GB/T 21312—2007)。量子點(diǎn)微球熒光免疫層析法檢測(cè)準(zhǔn)確度高、特異性好,產(chǎn)品操作簡(jiǎn)便、快速且可以同時(shí)出具定性結(jié)果和數(shù)字化檢測(cè)結(jié)果,適合雞蛋中高風(fēng)險(xiǎn)因子的大批量樣本現(xiàn)場(chǎng)篩查。后續(xù)可以基于量子點(diǎn)微球熒光免疫層析平臺(tái),建立更多的雞蛋中獸藥殘留的快速檢測(cè)方法。