一株好氧反硝化菌的脫氮特性及其氮代謝機(jī)理研究

楊景瑞，王 瑩，陳 虎，呂永康

（1.山西能源學(xué)院資源與環(huán)境工程系，山西太原 030000；2.太原理工大學(xué)省部共建煤基能源清潔高效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030024；3.太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西太原 030024）

氮是生物必不可少的元素，在水生生態(tài)系統(tǒng)的生化循環(huán)中至關(guān)重要。工業(yè)活動(dòng)和大量氮肥的使用使氮循環(huán)在全球范圍內(nèi)加速，雖使人類受益，但也產(chǎn)生了一系列重大且具有挑戰(zhàn)性的全球環(huán)境問(wèn)題〔1〕。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，工業(yè)廢水排放的氮會(huì)污染淡水及其沉積物，對(duì)環(huán)境和人類健康有害〔2〕。沉積物中氮的富集會(huì)導(dǎo)致有害藻類大量繁殖，隨全球變暖，此類事件急劇增加〔3〕。地下水硝酸鹽污染和地表水富營(yíng)養(yǎng)化是近幾十年來(lái)頻繁發(fā)生的問(wèn)題〔4〕。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新型的氮污染控制技術(shù)，尤其是脫氮技術(shù)，來(lái)保護(hù)水生生態(tài)系統(tǒng)。

生物反硝化被認(rèn)為是減少自然或工程生態(tài)系統(tǒng)中氮污染，并在區(qū)域乃至全球范圍內(nèi)調(diào)節(jié)氮循環(huán)的最有效、低成本和環(huán)境友好的策略〔5〕。在傳統(tǒng)理論中，由于生理、生物能量和動(dòng)力學(xué)原因，細(xì)菌反硝化通常由厭氧反硝化細(xì)菌在溶解氧（DO）水平極低的水環(huán)境中進(jìn)行〔6〕，傳統(tǒng)生物反硝化過(guò)程脫氮周期長(zhǎng)，容易受有機(jī)碳源和DO 等因素的影響。能在好氧條件下進(jìn)行反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)反硝化的限制，強(qiáng)調(diào)了好氧反硝化的可能性。

在過(guò)去幾十年中，研究人員已從廢水〔7〕、活性污泥〔8〕、生物反應(yīng)器〔9〕、垃圾填埋處理系統(tǒng)〔10〕、淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)〔11〕、人工濕地〔12〕、城市景觀湖泊沉積物〔13〕、河流〔14〕和海洋沉積物〔15〕中分離出好氧反硝化細(xì)菌。許多具有好氧反硝化能力的菌株已被鑒定和研究，包括Paracoccussp. YF1〔16〕、Pseudomonas mendocinaTJPU04〔17〕、Pseudomonassp. DM02〔11〕、Pseudomonas mendocinaS16、Enterobacter cloacaeDS’5〔18〕、Pseudomonas bauzanensisDN13-1〔19〕、Acinetobactersp. JR1〔20〕和Klebsiellasp. TN-10〔7〕等。好氧反硝化菌對(duì)氧氣的耐受性比自養(yǎng)細(xì)菌更高，生長(zhǎng)速度更快，可利用有機(jī)底物作為碳源（電子供體）和能源，將硝酸鹽（電子受體）轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w進(jìn)行反硝化〔21〕，同時(shí)去除碳和氮。由于好氧反硝化菌在實(shí)際廢水脫氮領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，迫切需要對(duì)其進(jìn)行高效菌株的篩選和脫氮機(jī)理的詳細(xì)研究。

本研究以從山西太原鋼鐵有限公司蒸氨廢水中篩選獲得的1 株高效好氧反硝化菌假單胞菌（Pseudomonassp. LV2）（簡(jiǎn)稱LV2）為研究對(duì)象，對(duì)該菌株的脫氮性能及代謝機(jī)制進(jìn)行了研究。具體目標(biāo)：1）考察菌株的好氧反硝化性能；2）采用單因素設(shè)計(jì)法優(yōu)化菌株好氧反硝化參數(shù)；3）根據(jù)好氧反硝化關(guān)鍵酶表達(dá)情況及元素守恒理論明確菌株的脫氮路徑。研究結(jié)果可為深入了解好氧反硝化細(xì)菌的脫氮特性和代謝機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源與培養(yǎng)基

本研究所用菌株為1 株具有高效好氧反硝化功能的假單胞菌Pseudomonassp. LV2，篩選自太原鋼鐵有限公司蒸氨廢水。

反硝化培養(yǎng)基（DM 培養(yǎng)基）組成：0.722 g/L KNO3、4.19 g/L 丙酮酸鈉、0.75 g/L K2HPO4·12H2O、0.25 g/L NaH2PO4、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.05 g/L MgSO4·7H2O、0.1 g/L NaCl，pH=7.0。

1.2 菌株的好氧反硝化性能評(píng)價(jià)

采用DM 培養(yǎng)基考察初始NO3--N 質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)LV2 菌株的好氧反硝化性能。實(shí)驗(yàn)在裝有100 mL 無(wú)菌培養(yǎng)基的250 mL 錐形燒瓶中以1%（V/V）的接種量一式三份進(jìn)行，并將非接種樣品作為對(duì)照組。將錐形燒瓶在30 ℃下以120 r/min 的搖床速度培養(yǎng)，定期從瓶中取樣測(cè)定OD600，然后以10 000 r/min 離心10 min 獲得上清液，測(cè)定NO2--N、NO3--N、TN 和COD。

1.3 影響菌株反硝化性能的單因素實(shí)驗(yàn)研究

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究LV2 菌株在不同培養(yǎng)條件（碳源、培養(yǎng)溫度、C/N、轉(zhuǎn)速）下的好氧反硝化特性，進(jìn)而對(duì)其好氧反硝化參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。碳源實(shí)驗(yàn)分別以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、反丁烯二酸和葡萄糖作為DM 培養(yǎng)基的唯一碳源。C/N 實(shí)驗(yàn)分別將初始C/N 調(diào)整為4、8、12、16 和20，NO3--N 質(zhì)量濃度固定為100 mg/L。為確定培養(yǎng)溫度和DO 對(duì)NO3--N去除的影響，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為15、20、30、40 ℃，搖床速度分別調(diào)整為0（DO≈2.30 mg/L）、40（DO≈2.93 mg/L）、80（DO≈3.25 mg/L）、120（DO≈4.72 mg/L）、160（DO≈5.64 mg/L）、200（DO≈6.24 mg/L） r/min。所有單因素實(shí)驗(yàn)均在含有100 mL 無(wú)菌培養(yǎng)基的250 mL錐形燒瓶中以1%（V/V）的接種量一式三份進(jìn)行，并將未接種的樣品作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。定期取瓶中樣品測(cè)定OD600，然后以10 000 r/min 離心10 min 后取上清液測(cè)定NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN 和COD。

1.4 酶活性測(cè)定

LV2 菌株在30 ℃的DM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h 后，將菌液置于4 ℃、10 000 r/min 離心機(jī)中離心20 min獲取沉淀物，然后將沉淀物重新懸浮于20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）中，之后利用超聲處理使細(xì)胞裂解，在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心20 min 后獲得游離提取物。硝酸鹽還原酶（NR）和亞硝酸鹽還原酶（NIR）為微生物好氧反硝化過(guò)程中的兩種關(guān)鍵酶〔22-23〕，其活性根據(jù)以往研究方法〔24〕測(cè)定。

1.5 氣體檢測(cè)與氮平衡實(shí)驗(yàn)

將1 mL LV2 菌株懸液孵育到含有100 mL DM培養(yǎng)基的250 mL 玻璃血清瓶中，將瓶子用高純O2充分充氣后在30 ℃、120 r/min 條件下密閉培養(yǎng)24 h，并以未接種系統(tǒng)作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。使用氣密注射器在0 h 和24 h 檢測(cè)來(lái)自瓶頂?shù)臍怏w樣品（400 μL），通過(guò)配備熱導(dǎo)檢測(cè)器的氣相色譜（GC）檢測(cè)N2和O2，用煙氣分析儀檢測(cè)NO 與NO2。分別在0 h 和24 h 從瓶中取樣進(jìn)行氮平衡實(shí)驗(yàn)，以10 000 r/min 離心10 min 后得到上清液，用于測(cè)定樣品中NH4+-N、NH2OH-N、NO2--N、NO3--N、TN、COD 和細(xì)胞內(nèi)氮的含量。

1.6 分析與計(jì)算方法

使用分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)600 nm 處菌株的生長(zhǎng)（OD600）。NH4+-N、NO2--N、NO3--N 和TN 根據(jù)國(guó)標(biāo)法檢測(cè)，NH4+-N 采用納氏試劑分光光度法在420 nm 處測(cè)定，NO2--N 采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法在540 nm 處測(cè)定，NO3--N 采用酚二磺酸分光光度法在410 nm 處測(cè)定，用紫外分光光度法通過(guò)堿性過(guò)硫酸鹽氧化檢測(cè)TN 和細(xì)胞內(nèi)氮。通過(guò)間接分光光度法分析羥胺濃度。利用溶解氧儀檢測(cè)DO。COD 采用重鉻酸鉀法用COD 分析儀測(cè)定。

氮和COD 的降解率和去除速率分別用式（1）和式（2）計(jì)算。

式中：E——降解率，%；

R——去除速率，mg/（L·h）；

C0——COD 或氮的初始質(zhì)量濃度，mg/L；

Ct——COD 或氮在t時(shí)刻的質(zhì)量濃度，mg/L；

t——菌株孵育時(shí)間，h。

通過(guò)接種后非離心培養(yǎng)基的TN 減去培養(yǎng)基離心（8 000 r/min，10 min）后的TN，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)氮含量〔25〕。

2 結(jié)果與討論

2.1 LV2 菌株的好氧反硝化特性

將1 mL 活化后的LV2 菌液接種至250 mL 含100 mL 滅菌的DM 培養(yǎng)基錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速為120 r/min（DO≈4.56 mg/L）和30 ℃的搖床中培養(yǎng)48 h，檢測(cè)LV2 菌株的好氧反硝化特性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 LV2 菌株在DM 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)與脫氮特性Fig. 1 The growth trend and denitrification characteristics of strain LV2 in DM medium

如圖1 所示，LV2 菌株在孵育6 h 后直接進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，OD600由6 h 時(shí)的0.169 增至24 h 時(shí)的1.09，表明LV2 菌株生長(zhǎng)良好。初始質(zhì)量濃度為99.4 mg/L 的NO3--N 在培育24 h 后迅速下降至8.73 mg/L，且在6～12 h 時(shí)NO3--N 的去除速率最大，達(dá)到7.75 mg（/L·h），24 h 后NO3--N 質(zhì)量濃度基本保持不變。TN 和COD 的去除曲線與NO3--N 非常相似，NO3--N、TN 和COD 的最大去除率分別為98.5%、97.9%和93.5%，表明該工藝同時(shí)脫除了氮和有機(jī)碳，但培養(yǎng)24 h 后TN 略有增加，這可能是由于有機(jī)物不足導(dǎo)致死菌細(xì)胞釋放少量氮。LV2 菌株的生長(zhǎng)與其脫氮能力密切相關(guān)。在整個(gè)NO3--N 去除過(guò)程中未檢測(cè)到NO2--N 的積累，這一結(jié)果與惡臭假單胞菌DS2 去除NO3--N 結(jié)果一致〔26〕，但與以海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉（SA-CMC）為載體固定反硝化菌的結(jié)果不同，后者在NO3--N 去除過(guò)程中檢測(cè)到了NO2--N 積累〔27〕。以上結(jié)果表明LV2 菌株具有良好的好氧反硝化能力，具備在好氧條件下脫氮的潛質(zhì)。

2.2 LV2 菌株的好氧反硝化性能優(yōu)化

2.2.1 碳源影響

碳源是異養(yǎng)菌的能量和電子來(lái)源，是影響細(xì)菌好氧反硝化能力和細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素。在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min、C/N=16 的條件下研究了不同碳源對(duì)LV2 菌株脫氮性能的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2表明，NO3--N 去除率在被測(cè)碳源間存在顯著差異。丙酮酸鈉是最適合LV2 菌株好氧反硝化的碳源，24 h 內(nèi)NO3--N 去除率為94.1%，同時(shí)OD600達(dá)到最大值1.12，這可能是因?yàn)楸徕c參與了三羧酸循環(huán)，而三羧酸循環(huán)是微生物氧化的重要途徑。當(dāng)以丁二酸鈉、檸檬酸鈉和乙酸鈉為唯一碳源時(shí)，LV2 菌株也表現(xiàn)出高效的好氧反硝化能力，24 h 內(nèi)NO3--N 去除率分別達(dá)到91.5%、89.4%和82.4%。在測(cè)試的6 種碳源中，在以反丁烯二酸為唯一碳源時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量最小，反硝化性能最差；該結(jié)果與菌株Acinetobactersp. JR1 不同〔20〕，在以反丁烯二酸為唯一碳源時(shí)，菌株JR1 在培養(yǎng)24 h 后對(duì)TN 的去除率最高，反丁烯二酸是菌株JR1 的最佳碳源；這可能與菌株JR1 在酸性條件下具有優(yōu)異的脫氮性能有關(guān)。對(duì)于LV2 菌株，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇丙酮酸鈉作為最佳外加碳源。

2.2.2 溫度影響

在DM 培養(yǎng)基中以丙酮酸鈉為碳源，在C/N=16、轉(zhuǎn)速120 r/min 條件下，不同溫度（15～40 ℃）對(duì)LV2菌株生長(zhǎng)及NO3--N 去除特性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 48 h 內(nèi)不同溫度對(duì)LV2 菌株反硝化性能的影響Fig. 3 Effect of different temperature on the denitrification performance of strain LV2 within 48 h

圖3（a）顯示LV2 菌株能夠在15～40 ℃生長(zhǎng)。OD600和NO3--N 質(zhì)量濃度在40 ℃時(shí)變化很小〔圖3（a）和圖3（b）〕，在15～30 ℃內(nèi)48 h 時(shí)NO3--N 的去除率均在85.0%以上〔圖3（d）〕，且在30 ℃時(shí)達(dá)到了97.2%的最佳去除率。NO3--N 和COD 去除率變化趨勢(shì)與細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，隨溫度升高，NO3--N 和COD 的去除速率先加快后減緩〔圖3（b）和圖3（c）〕，較低溫度下細(xì)菌生長(zhǎng)需要更長(zhǎng)的滯后期，溫度升高至30°C時(shí)OD600最大，達(dá)到1.11（24 h），因此LV2 菌株的最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。這可能是由于20～33 ℃條件下好氧反硝化的酶活性增加〔28〕，這與之前的報(bào)道稱適宜好氧反硝化細(xì)菌生存的溫度為中溫條件（30～37 ℃）結(jié)果一致〔25，29〕。然而，在30 ℃下24 h 后觀察到NO3--N 去除率增加的同時(shí)伴隨OD600從1.11 降至0.93，這可能是由衰變階段的細(xì)胞裂解引起的。

2.2.3 C/N 影響

為確定不同C/N 對(duì)LV2 菌株在DM 培養(yǎng)基中去除NO3--N 效果的影響，在以丙酮酸鈉為單一碳源、培育溫度為30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為24 h、轉(zhuǎn)速為120 r/min 的條件下設(shè)計(jì)了一組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

如圖4 所示，當(dāng)C/N 從4 增加到12 時(shí)，24 h 內(nèi)OD600、NO3--N 和TN 的去除率分別從0.323、37.3%和36.4%增加到0.788、82.5%和74.3%；當(dāng)C/N 為4～12時(shí)，LV2 菌株對(duì)COD 的去除率均達(dá)到97.0%以上。低C/N 下NO3--N 和TN 的殘留主要是由碳源供應(yīng)不足造成的，這將損害微生物的生長(zhǎng)和反硝化所需的電子供體〔30-31〕。當(dāng)C/N 增加到16 和20 時(shí)，LV2 菌株對(duì)NO3--N 和TN 的去除率沒(méi)有太大差別，分別達(dá)到98%和92%左右，且在C/N=16 時(shí)OD600達(dá)到最大值1.11。然而，OD600和COD 去除率在C/N=20 時(shí)都有所下降，這一結(jié)果表明氮源的耗盡可能導(dǎo)致COD 的低降解，因?yàn)樘荚吹墓?yīng)高于其需求?？紤]到NO3--N、TN 和COD 的去除效果以及菌株生長(zhǎng)密度，C/N=16更有利于實(shí)現(xiàn)成本效益高的好氧反硝化作用。

2.2.4 轉(zhuǎn)速影響

DO 是脫氮過(guò)程中的主要控制參數(shù)〔32-33〕。在以丙酮酸鈉為碳源、溫度為30 ℃、C/N=16 的條件下，通過(guò)調(diào)節(jié)振蕩轉(zhuǎn)速來(lái)控制培養(yǎng)基中的DO，研究了DO對(duì)NO3--N 去除效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 24 h 內(nèi)不同轉(zhuǎn)速對(duì)LV2 菌株反硝化性能的影響Fig. 5 Effect of different rotational speed on the denitrificationperformance of strain LV2 within 24 h

如圖5 所示，NO3--N 去除率從0 r/min 時(shí)的50.5% 顯著增加到120 r/min 時(shí)的98.4%，對(duì)應(yīng)的OD600由0.46 上升為1.11；當(dāng)振蕩轉(zhuǎn)速超過(guò)120 r/min時(shí)，NO3--N 去除率無(wú)明顯差異，OD600下降。不同轉(zhuǎn)速下TN 去除率趨勢(shì)與NO3--N 一致。適當(dāng)增加振蕩轉(zhuǎn)速可顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和NO3--N 的去除，這可能是由氧傳質(zhì)系數(shù)隨轉(zhuǎn)速增加而增大導(dǎo)致。此外，適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速可以提高細(xì)菌與NO3--N 的接觸強(qiáng)度和混合程度，從而促進(jìn)LV2 菌株的生長(zhǎng)，提高對(duì)NO3--N 的降解效率。此外，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)振蕩轉(zhuǎn)速超過(guò)120 r/min時(shí)，OD600逐漸降低，這可能是由于劇烈振蕩對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響。因此，振蕩轉(zhuǎn)速固定在120 r/min。

2.3 LV2 菌株的好氧反硝化去除路徑

為研究LV2 菌株參與脫氮過(guò)程的好氧反硝化途徑，在好氧條件下評(píng)估了兩種關(guān)鍵酶NR 和NIR 的活性。24 h 內(nèi)LV2 菌株反硝化過(guò)程中NR 和NIR 活性及N2產(chǎn)生情況見(jiàn)圖6。

圖6 24 h 內(nèi)LV2 菌株反硝化過(guò)程中NR 和NIR 活性（a）及N2產(chǎn)生情況（b）Fig. 6 NR and NIR activities（a） and N2 production（b） during the denitrification process of strain LV2 within 24 h

圖6（a）表明，在無(wú)細(xì)胞游離提取物中檢測(cè)到了NR 和NIR 這兩種酶，酶活性分別為0.057 μmol/min和0.052 μmol/min。NR 和NIR 是反硝化過(guò)程的關(guān)鍵酶，分別負(fù)責(zé)硝酸鹽向亞硝酸鹽和亞硝酸鹽向氮?dú)獾暮醚蹀D(zhuǎn)化，NR 和NIR 的存在進(jìn)一步證明了LV2 菌株的好氧反硝化能力。

為進(jìn)一步證實(shí)LV2 菌株的脫氮機(jī)理，在好氧反硝化過(guò)程中進(jìn)行了氣體檢測(cè)。通過(guò)氣相色譜對(duì)充滿O2且以NO3--N 為唯一氮源的密閉系統(tǒng)中的氣體進(jìn)行了定性分析，結(jié)果見(jiàn)圖6（b）。實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到了N2，且用煙氣分析儀對(duì)收集的氣體進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NO 和NO2氣體。N2的產(chǎn)生進(jìn)一步證實(shí)了LV2 菌株在好氧條件下發(fā)生了異化脫氮。

對(duì)密閉系統(tǒng)內(nèi)水樣進(jìn)行氮平衡分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 LV2 菌株反硝化過(guò)程的氮平衡Table 1 Nitrogen balance in denitrification process of strain LV2

對(duì)起始點(diǎn)0 h和培育24 h水樣的分析（表1）表明，NO3--N 濃度顯著降低，去除率達(dá)到98.6%，NO2--N、NH4+-N 和NH2OH 積累很少，通過(guò)同化作用生成的細(xì)胞內(nèi)氮和通過(guò)反硝化作用生成的氣態(tài)產(chǎn)物N2分別占初始NO3--N 的69.7%和23.4%。損失的5.12%的氮源可能是由采用不同分析方法產(chǎn)生的測(cè)量誤差造成的。結(jié)果表明，LV2 菌株主要通過(guò)兩種不同的代謝途徑去除NO3--N，一種是NO3--N 通過(guò)同化作用被用于細(xì)胞合成，另一種是通過(guò)好氧反硝化作用轉(zhuǎn)化為N2。

3 結(jié)論

1）假單胞菌Pseudomonassp. LV2 能以NO3--N為唯一氮源進(jìn)行好氧反硝化，且表現(xiàn)出高效的好氧反硝化效率。

2）單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LV2 菌株在以丙酮酸鈉為外加碳源，孵育溫度為30 ℃，C/N 為16 以及轉(zhuǎn)速為120 r/min 的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出高的好氧反硝化能力，NO3--N 去除率在24 h 可達(dá)到98%以上。

3）酶活性測(cè)定、氣體檢測(cè)及氮平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LV2 菌株可以直接同化NO3--N 進(jìn)行細(xì)胞合成，并通過(guò)好氧反硝化作用將NO3--N 轉(zhuǎn)化為N2。