食品中致病菌的常規(guī)和新興檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

陳俊，劉家麒

1.上海市食品研究所有限公司（上海 200235）；2.上海微譜檢測(cè)認(rèn)證有限公司（上海 200441）

近年來，新型細(xì)菌檢測(cè)工具的變革和發(fā)展不斷進(jìn)行，把繁重復(fù)雜的科學(xué)工作逐漸由智能儀器替代完成。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是常用的檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)方法之一。PCR對(duì)于儀器技術(shù)的發(fā)展也有幫助，因?yàn)槠鋵?duì)各種微生物的檢測(cè)具有敏感性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，分子生物學(xué)、免疫學(xué)技術(shù)等各種新技術(shù)，這些細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)在靈敏度和準(zhǔn)確性方面也都得到很大的提升。本文主要論述在食品技術(shù)、食品檢測(cè)和微生物學(xué)等領(lǐng)域中出現(xiàn)新趨勢(shì)及其實(shí)際應(yīng)用，同時(shí)介紹傳統(tǒng)的和現(xiàn)代的細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)。相比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，現(xiàn)代化新型檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、高效、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。

1 傳統(tǒng)生物檢測(cè)技術(shù)

1.1 依賴培養(yǎng)的微生物學(xué)方法

生物培養(yǎng)依賴的方法往往耗時(shí)長，器械要求高，需要艱苦的勞動(dòng)。通常需要一個(gè)漫長的過程，需要進(jìn)行樣本采集、選擇合適的媒體和等待適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間，檢測(cè)潛伏期細(xì)菌病原體需要18～24 h。在測(cè)定細(xì)菌的生長速率和殺滅速率時(shí)，測(cè)定樣品中活菌的數(shù)量是很重要的指標(biāo)。單個(gè)菌落由從一個(gè)細(xì)胞或一組細(xì)胞開始的細(xì)菌細(xì)胞繁殖組成，每個(gè)樣本中細(xì)菌的這種定量常稱為菌落形成單位總數(shù)（CFU）。只有在控制條件下即培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、選擇培養(yǎng)基和氧利用度下可培養(yǎng)的細(xì)胞才能被計(jì)數(shù)。鑒定復(fù)雜樣品中的細(xì)菌和病毒在疾病診斷、產(chǎn)品安全和研究中是非常重要的。基于序列的檢測(cè)方法已被證明是有用的，并且可以在一次分析中以合理的成本，檢測(cè)已測(cè)序的數(shù)千種微生物中的任何一種。

1.2 非培養(yǎng)生化檢測(cè)技術(shù)

在檢測(cè)技術(shù)中，檢測(cè)設(shè)備和檢測(cè)方法一開始從傳統(tǒng)基于培養(yǎng)的鑒定方法發(fā)展到現(xiàn)在代基于抗原和蛋白質(zhì)檢測(cè)的系統(tǒng)，進(jìn)一步擴(kuò)展到快速進(jìn)行分子檢測(cè)鑒定。準(zhǔn)確快速地鑒定微生物制劑是臨床診斷和食品微生物學(xué)的主要目標(biāo)。傳統(tǒng)上，從水、廢水和其他環(huán)境樣品中檢測(cè)病原體的能力，受到從復(fù)雜的環(huán)境樣品中培養(yǎng)生物體的能力的限制。

1.3 基于核酸序列的免疫檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)和核酸序列檢測(cè)技術(shù)被認(rèn)為是微生物學(xué)中最強(qiáng)大的技術(shù)。其中，變性梯度凝膠電泳是一種利用化學(xué)梯度使樣品（核酸）在丙烯酰胺凝膠上移動(dòng)的電泳技術(shù)。該技術(shù)通常被用于分離聚合酶鏈反應(yīng)并從中獲得大小相同但具有不同的變性能力的基因，腸道沙門菌和鼠傷寒沙門菌是全世界范圍內(nèi)最廣泛的沙門菌疾病和胃腸道疾病的病原體。對(duì)它們進(jìn)行簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)對(duì)生物安全及現(xiàn)場(chǎng)診斷具有重要意義[2]。基于核酸的檢測(cè)方法主要是圍繞所有沙門菌的腸道成員16S rRNA基因，這是一種簡(jiǎn)單、靈敏、快速的檢測(cè)方法[3]。然而，由于16S rRNA序列同源性高，因此特異性區(qū)域少，對(duì)此研究人員開發(fā)一種新的核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)（NASBA）方法，稱為單特異性引物NASBA，其中的特異性反義引物足以進(jìn)行特定的NASBA反應(yīng)。設(shè)計(jì)針對(duì)16S rRNA可變區(qū)段的高特異性反義引物和簡(jiǎn)并引物，用設(shè)計(jì)的引物在單一反應(yīng)環(huán)境中同時(shí)特異性檢測(cè)兩種病原體，并且檢測(cè)限小于10 CFU/mL。開發(fā)的NASBA分析方法應(yīng)該有助于整個(gè)檢測(cè)過程，并且用于在各種情況下（如疾病暴發(fā)）的病原體檢測(cè)。微生物檢測(cè)陣列（MDA），已被用于檢測(cè)所有已知的病毒（包括噬菌體）、細(xì)菌和質(zhì)粒，并開發(fā)一種用于從雜交該陣列的復(fù)雜樣本中識(shí)別微生物混合物新的統(tǒng)計(jì)方法。應(yīng)用家系特異性探針可以對(duì)所有已定序的病毒和細(xì)菌全基因組、片段和質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)計(jì)的探針能夠允許一些序列發(fā)生變異，從而能夠檢測(cè)出與被測(cè)序生物體具有同源性的不同物種，并且與人類基因組序列沒有顯著的匹配。在用單個(gè)或多個(gè)病毒刺激的樣本進(jìn)行盲法檢測(cè)時(shí)，MDA能夠正確識(shí)別物種或菌株。在臨床糞便、血清和呼吸樣本中，丙二醛檢測(cè)方法是常用的能夠檢測(cè)和鑒定樣本中具有多種病毒、噬菌體和細(xì)菌的技術(shù)，并通過PCR得到證實(shí)。結(jié)論證明丙二醛可用于鑒別復(fù)雜樣品中是否存在的病毒和細(xì)菌。

2 現(xiàn)代生化檢測(cè)技術(shù)

2.1 生化特性

各種常規(guī)的觀察和生化方法被用于檢測(cè)細(xì)菌，微生物學(xué)家可通過瓊脂板上的菌落對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)菌因其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成的不同可分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。其他化學(xué)特性也對(duì)細(xì)菌鑒定起著重要作用，如糖發(fā)酵、酶的產(chǎn)生和耐藥等，這些都可以很容易地檢測(cè)出來。有幾種生化測(cè)試可以對(duì)任何細(xì)菌完成鑒定，如淀粉水解、明膠水解、酪蛋白水解、過氧化氫酶活性、脫氮試驗(yàn)、硫化氫的生產(chǎn)、細(xì)菌樣品的碳源利用譜等。基于核酸序列的檢測(cè)技術(shù)比上述生化方法更容易、更可靠，已成為標(biāo)準(zhǔn)和直接的方法。

2.2 免疫檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)方法是建立在抗體與抗原特異性結(jié)合基礎(chǔ)上進(jìn)行的檢測(cè)。在食品調(diào)查中廣泛使用的免疫學(xué)方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[4]。它可以檢測(cè)花生中黃曲霉毒素。另外已有研究將酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)與放射免疫測(cè)定、免疫擴(kuò)散、免疫熒光、血凝和免疫電泳進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫吸附法是目前應(yīng)用于蛇毒研究領(lǐng)域的最通用的免疫分析技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)主要包括具有相對(duì)較高的靈敏度和樣品采集的簡(jiǎn)便性。它適用于大規(guī)模流行病學(xué)研究和準(zhǔn)確地診斷蛇咬傷。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)有助于提高對(duì)血吸蟲病的流行病學(xué)知識(shí)，其使用抗體和識(shí)別顏色變化的物質(zhì)包括酶聯(lián)熒光試劑和免疫磁珠分離（IMS），可以有效檢測(cè)從各種樣本中培養(yǎng)的細(xì)胞，它可用于量化食物、血液或糞便樣本的致病菌。ELISA是食品診斷中最通用的免疫分析方法。商用ELISA試劑盒主要應(yīng)用于食源性微生物診斷。為開發(fā)更靈敏的方法，將ELISA和免疫磁珠結(jié)合起來，并用熒光團(tuán)標(biāo)記，用于細(xì)菌的視覺檢測(cè)。免疫層析法（如側(cè)流式免疫分析法）在目標(biāo)顆粒向固定化抗體遷移過程中表現(xiàn)出良好的視覺檢測(cè)效果。側(cè)流式免疫層分析法和磁濃度法在2 h內(nèi)可檢測(cè)出在奶樣品中添加單核增生乳桿菌濃度。ELISA是一種經(jīng)濟(jì)有效的免疫分析方法，可替代簡(jiǎn)單的顯微鏡法（廉價(jià)法）和高效液相色譜法（昂貴法）。

3 生物傳感器

3.1 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器是一種基于化學(xué)修飾石墨烯（傳感器的換能器層）和適配體（傳感層）的電位型適配傳感器。氧化石墨烯和還原氧化石墨烯是構(gòu)建兩種適配傳感器的基礎(chǔ)，用于檢測(cè)具有挑戰(zhàn)性的生物，如金黃色葡萄球菌[5]。在這2種適配傳感器中，DNA適配體要么共價(jià)的，要么非共價(jià)，可附著在換能器層上。在這2種情況下，都能在分析中選擇性地檢測(cè)到單個(gè)金黃色葡萄球菌，盡管用還原氧化石墨烯制造的噪音水平低于氧化石墨烯制造。但這些新的適配體具有很高的選擇性，其特點(diǎn)是技術(shù)簡(jiǎn)單和用于構(gòu)建的材料易于獲得，同時(shí)在非常短的時(shí)間內(nèi)對(duì)微生物的檢測(cè)提供極低的檢測(cè)限。

3.2 光學(xué)生物傳感器

光學(xué)生物傳感器在性能上具有很高的選擇性和敏感性，為快速檢測(cè)致病菌和各種毒素提供方便。它們具有低檢測(cè)限、高輸出篩選、實(shí)時(shí)分析等特點(diǎn)。納米生物技術(shù)已得到開發(fā)及應(yīng)用，通過整合生物傳感器周圍的各種信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的常規(guī)檢測(cè)。光學(xué)生物傳感器被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)菌中最聰明的方法，通過對(duì)納米孔陣列的堵塞作用與特定的細(xì)菌抗體結(jié)合，從而檢測(cè)單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，近年來SPR（表面等離子共振）生物傳感器與磁性分離方法相結(jié)合，使用金包裹磁性納米顆粒檢測(cè)各種病原菌。SERS（表面拉曼增強(qiáng)光譜）方法被用于多種病原體的高選擇性檢測(cè)，為開發(fā)自動(dòng)組合和微型化方法已開展大量工作，如核酸序列擴(kuò)增和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，同時(shí)設(shè)計(jì)多壁板微流控裝置，實(shí)現(xiàn)對(duì)水中病原體的多重可視化檢測(cè)。

4 細(xì)菌檢測(cè)的儀器技術(shù)

4.1 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種生物診斷工具，可以檢測(cè)和計(jì)數(shù)食品和食品加工過程中的微生物種群。FCM可以提供有關(guān)細(xì)胞生理狀態(tài)的信息，并允許在混合培養(yǎng)中計(jì)數(shù)微生物。因此，這項(xiàng)技術(shù)越來越多地被用于定量病原體和腐敗微生物檢測(cè)。FCM在葡萄酒領(lǐng)域中的應(yīng)用大幅增加，可用于確定微生物在酒精發(fā)酵和蘋果乳酸發(fā)酵過程中的數(shù)量和生理狀態(tài)?；诹魇郊?xì)胞術(shù)的應(yīng)用可用于檢測(cè)各種牛奶樣品中的革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌。該技術(shù)可為奶農(nóng)和獸醫(yī)提供關(guān)于革蘭菌類型的現(xiàn)場(chǎng)信息，同時(shí)防止乳腺炎病例中不需要的抗菌治療。流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用已被用于研究水樣的細(xì)菌學(xué)評(píng)估和檢測(cè)有害和不可培養(yǎng)的細(xì)菌[6]。

4.2 氣相色譜和質(zhì)譜分析

分析揮發(fā)性化合物是分析化學(xué)中的一種常見做法，通常用于分析混合物中化合物純度的測(cè)試和鑒定。此外，它可用于制備色譜，并從各種化合物的混合物中制備純物質(zhì)。氣相色譜和質(zhì)譜等儀器技術(shù)已被用于分析細(xì)菌化合物的微生物鑒定系統(tǒng)。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）是一種有效的細(xì)菌及其化合物的鑒定和檢測(cè)手段。新的微型化技術(shù)，如GC-DMS（氣相色譜微分移動(dòng)光譜法）被用于檢測(cè)大腸桿菌等大腸菌群，這2種技術(shù)GC-MS和GC-DMS可以檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞釋放的各種化合物（如鄰硝基酚和吲哚）。

5 光譜技術(shù)

5.1 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

FTIR是一種基于紅外光譜的技術(shù)，適用于MIR。利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)新鮮肉糜中的生化變化進(jìn)行測(cè)定，可以達(dá)到快速監(jiān)測(cè)牛肉腐敗的目的[7]。把絞碎的牛肉從新鮮到腐敗的紅外光譜進(jìn)行測(cè)量收集，并進(jìn)行可行的計(jì)數(shù)，主成分分析可以闡明波數(shù)可能與腐敗過程有關(guān)。研究結(jié)果表明，F(xiàn)TIR不受儲(chǔ)存條件（如包裝和溫度）的限制，F(xiàn)TIR光譜可以通過制作代謝指紋圖譜完成檢測(cè)，該方法與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，是一種強(qiáng)大、快速、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)的監(jiān)測(cè)肉糜新鮮度的方法。FTIR光譜被認(rèn)為是一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)肉制品中食源性致病菌的生化指紋技術(shù)。通過紅外光束與被激發(fā)分子的振動(dòng)相聯(lián)系的，由此產(chǎn)生的吸收光譜代表一個(gè)特定的指紋，這是任何生化或化學(xué)物質(zhì)的特征。這項(xiàng)技術(shù)可以用來測(cè)量食物內(nèi)部發(fā)生的生化變化，提供有關(guān)的信息，了解食物中的微生物代謝物的腐爛和形成。

5.2 拉曼光譜技術(shù)

拉曼光譜是一種光譜技術(shù)，在給定的系統(tǒng)中使用振動(dòng)、旋轉(zhuǎn)和其他低頻模式進(jìn)行檢測(cè)。它利用了激光在一定范圍內(nèi)彈性散射的效應(yīng)與樣本分子之間的相互作用。利用拉曼光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)冷凍豬肉的脂質(zhì)氧化程度進(jìn)行快速檢測(cè)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷凍豬肉過氧化值與貯藏時(shí)間具有顯著相關(guān)性，采用拉曼光譜技術(shù)可以快速測(cè)定冷凍豬肉的酸價(jià)和過氧化值[8]。用測(cè)試樣本挑戰(zhàn)這個(gè)數(shù)據(jù)庫。在食品和醫(yī)學(xué)中，拉曼光譜可作為檢測(cè)完整的細(xì)菌細(xì)胞的有效工具，同時(shí)可以在幾秒鐘內(nèi)記錄光譜，利用各種統(tǒng)計(jì)工具在幾分鐘內(nèi)生成結(jié)果。科學(xué)家正試圖通過將光譜技術(shù)與納米陣列相結(jié)合，尋找檢測(cè)食品中食源性致病菌的創(chuàng)新方法，以獲得更好的結(jié)果。

5.3 太赫茲輻射技術(shù)

太赫茲（THz）輻射也被稱為太赫茲波和太赫茲光，THz輻射主要用作成像工具，研究半導(dǎo)體等離子體天線表面細(xì)菌層間之間的相互作用，THz等離子體天線提高生物材料薄膜的靈敏度極限，使細(xì)菌的檢測(cè)降低到單層厚度[9]。此外，還可在5種不同的細(xì)菌中選擇性地鑒定革蘭菌類型。這種選擇性可以從對(duì)雙層細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)和對(duì)單層細(xì)菌的多重測(cè)量分析中看出。革蘭體之間信號(hào)差異的來源很可能是來源于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異或菌體內(nèi)物質(zhì)的不同含量?？墒褂媒y(tǒng)計(jì)方法（如化學(xué)計(jì)量學(xué)或分類算法）確定未知樣本的菌種類型，THz作為一種無標(biāo)簽、低成本、快速的探測(cè)和接收技術(shù)，也可用于快速檢測(cè)抗生素療效等方面。科學(xué)家設(shè)計(jì)各種可攜帶、無標(biāo)簽和靈敏的技術(shù)，可用于現(xiàn)場(chǎng)微生物調(diào)查，THz輻射就是其中之一。盡管THz光譜技術(shù)被認(rèn)為是一種很有前途的檢測(cè)技術(shù)，但它仍然面臨一些局限性。局限性與太赫茲波長和細(xì)菌細(xì)胞大小不匹配有關(guān)?？赏ㄟ^使用THz超材料和增加細(xì)菌與太赫茲輻射相互作用來克服這一問題，從而提高THZ輻射的靈敏度，使之與細(xì)菌細(xì)胞更加兼容。此外，THz技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)和其他統(tǒng)計(jì)工具相結(jié)合，可以提供更多的自動(dòng)化和無偏結(jié)果。利用高質(zhì)量的THz系統(tǒng)、高效的超材料及其他有效的統(tǒng)計(jì)工具，可提供更具潛力的細(xì)菌檢測(cè)應(yīng)用平臺(tái)[10]。

6 結(jié)語

微生物通常存在于食物、水、土壤、空氣中，甚至存在于動(dòng)物和人體中，并不是所有微生物都是致病菌。有研究提出一種新穎的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法，這種方法不依賴于培養(yǎng)，簡(jiǎn)單而且經(jīng)濟(jì)：將實(shí)時(shí)酶?jìng)鞲衅骱兔疙憫?yīng)納米等離子體生物傳感器系統(tǒng)，應(yīng)用于細(xì)菌的特異性和選擇性檢測(cè)。傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)主要用于檢測(cè)水、食品等樣品中的細(xì)菌和微生物，而這些技術(shù)限制來自復(fù)雜環(huán)境樣品中不可培養(yǎng)的微生物信息。通常，新的診斷方法結(jié)合各種儀器，具有高度的先進(jìn)性。大多數(shù)技術(shù)是基于免疫學(xué)檢測(cè)和電子傳感器進(jìn)行檢測(cè)。傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)雖然足夠靈敏、準(zhǔn)確，但往往速度慢、耗時(shí)長。在過去的幾十年里，人們做了大量的工作來改進(jìn)和發(fā)展先進(jìn)的探測(cè)技術(shù)。傳統(tǒng)和常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)雖然相當(dāng)準(zhǔn)確和可靠，但無法檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞的生存狀態(tài)。一些現(xiàn)代儀器提供關(guān)于快速檢測(cè)計(jì)數(shù)的細(xì)菌細(xì)胞生理狀態(tài)的詳細(xì)圖像。分子動(dòng)力學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和許多其他檢測(cè)方法克服相關(guān)局限性，為這些新興的檢測(cè)技術(shù)提供跨學(xué)科和前沿的科學(xué)支持，促進(jìn)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。本文介紹了傳統(tǒng)和現(xiàn)代的細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)，也可以看出現(xiàn)代新型檢測(cè)技術(shù)具有快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，如果以后的研究中能夠?qū)z測(cè)成本進(jìn)行優(yōu)化控制，那么更好、更快捷的新型技術(shù)一定能取代傳統(tǒng)方法，并得到廣泛運(yùn)用。