基于SSR標(biāo)記的黑龍江省茖蔥天然種群遺傳多樣性分析

臧丹丹,姜思佳,周玉遷* , 趙恒田,王寧

(1.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 哈爾濱 150081;2.黑龍江省森林植物園,哈爾濱 150040)

茖蔥(AlliumvictorialisL.)是一種多年生草本植物,廣泛分布于北半球。在中國,茖蔥主要分布在東北、內(nèi)蒙古、河北等北方地區(qū)。茖蔥作為一種藥食兼用植物,具有良好的發(fā)展前景。近年來,隨著茖蔥的營養(yǎng)價值和有效成分研究的深入,茖蔥的經(jīng)濟價值持續(xù)得到關(guān)注[1-3]。此外,茖蔥在黑龍江省分布較廣,但隨著人類活動和自然環(huán)境的破壞等情況的發(fā)生,茖蔥的野生種群數(shù)量逐漸減少,對茖蔥種質(zhì)資源的保護和利用也變得越來越重要。遺傳多樣性是生物種群適應(yīng)環(huán)境變化和進化的基礎(chǔ),也是種質(zhì)資源保護和利用的重要基礎(chǔ)。因此,對茖蔥遺傳多樣性的研究具有重要的理論和實踐意義[4]。

茖蔥含有許多活性成分,包括揮發(fā)油類物質(zhì)、黃酮類化合物、糖類物質(zhì)、豐富的維生素、可溶性蛋白、纖維素、微量元素等,在保護心血管系統(tǒng)、消炎、保護肝臟、抵御肥胖方面功效顯著。茖蔥作為一種重要的藥食兼用植物,被廣泛應(yīng)用于中藥制劑和保健品中。因此,茖蔥的種質(zhì)資源保護和利用具有很高的經(jīng)濟和社會價值。對于茖蔥研究目前主要停留在活性成分開發(fā)、提取工藝優(yōu)化、外部形態(tài)、核型分析等方面,在分子生物學(xué)和遺傳多樣性評價方面研究較少,且有關(guān)茖蔥育種研究相對滯后,嚴(yán)重制約了茖蔥產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

分子DNA標(biāo)記是種質(zhì)資源遺傳多樣性分析最有用工具之一。分子標(biāo)記技術(shù)主要用于遺傳多樣性研究、分子輔助選擇(MAS)、親子關(guān)系分析、數(shù)量性狀基因(QTL)定位、品種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳圖譜等。各種分子標(biāo)記均可用于開發(fā)茖蔥遺傳研究,包括簡單序列重復(fù)(SSRs)、簡單序列間重復(fù)(ISSRs)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)[5]、多態(tài)性DNA的隨機擴增(RAPD)[6]、擴增片段長度多態(tài)(AFLP)[7]和單核苷酸多態(tài)性(SNPs)[8]。其中,SSR非常有利于茖蔥遺傳學(xué)研究和育種中的各種應(yīng)用,因為它們是多等位基因、共顯性、信息量高、相對豐度高、基因組覆蓋率高,并且實驗可重復(fù)[8-10]。SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和應(yīng)用領(lǐng)域,包括個體、群體、品種和物種水平的遺傳分析[9]。近年來,SSR分子標(biāo)記技術(shù)已全面應(yīng)用于相同植物不同種質(zhì)間的遺傳多樣性研究中,如番石榴、印度蓖麻、杏仁、板栗[11-12]等。而SSR分子標(biāo)記技術(shù)在茖蔥種源遺傳多樣性分析方面研究尚屬首次。通過對茖蔥種群的遺傳多樣性水平、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化進行分析,我們可以深入了解茖蔥的遺傳背景、遺傳多樣性水平以及茖蔥種群的空間分布特征,為茖蔥資源的保護和利用提供科學(xué)依據(jù)。

從54對SSR引物中,篩選出多態(tài)性優(yōu)良的引物33對,對24個黑龍江省主要野生茖蔥種源群進行了遺傳多樣性分析,并通過聚類分析將其歸類,以揭示不同種源地茖蔥群體間的親緣距離遠近,為下一步的茖蔥野生資源多樣性保護、優(yōu)良茖蔥品種培育奠定理論基礎(chǔ),對野生茖蔥資源的保護及茖蔥產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從黑龍江省采集不同茖蔥種源地的24份茖蔥,如表1所示。

表1 黑龍江省茖蔥采集位置

1.2 實驗方法

1.2.1 不同種源地茖蔥基因組DNA獲取。采集幼嫩、無病蟲害的不同種源地的茖蔥葉片放于液氮中保存利用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒對上述保存在液氮中的茖蔥葉片提取DNA,分析上述提取DNA的濃度和純度,將沒有降解的DNA保存于-20 ℃冰箱以備后續(xù)使用。

1.2.2 SSR引物合成。用于試驗的引物均由上海生工有限公司合成(如表2所示)。

表2 引物序列信息

1.2.3 PCR擴增與電泳檢測。茖蔥PCR擴增總體系為20 μL:新鮮茖蔥DNA 2 μL, 2×Taq PCR MasterMix 10 μL;正向引物F(10μM) 1 μL;反向引物R(10 μM)1 μL;ddH2O 6 μL。

PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min,

94 ℃變性30 s;

53～65 ℃退火 30 s;30個循環(huán)

72 ℃延伸1 min;

72 ℃延伸7 min, 置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測:擴增產(chǎn)物及DNA Maker點樣于8%的聚丙烯酰氨凝膠上,連接電源進行電泳檢測。電泳結(jié)束后用硝酸銀對上述凝膠染色,染色成功后即可得到結(jié)果,照相保存凝膠電泳圖片。DNA maker購自Takara有限公司。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。觀察擴增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上的電泳遷移情況,分別以“1”和“0”表示同一區(qū)域條帶的有無,建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計的原始數(shù)據(jù)庫。用NTSYS-pc V2.1軟件計算不同茖蔥種源間的遺傳距離,用SAHN和UPGMA方法對24種不同茖蔥種源進行聚類分析,并通過Tree plot模塊建立聚類圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增情況

33對引物在24份茖蔥種質(zhì)中均能獲得清晰條帶。圖1為引物44的擴增情況圖片。

注:泳道1～24編號見表1;M為Marker

圖2 黑龍江茖蔥遺傳多樣性分析

2.2 遺傳多樣性分析

通過不同種質(zhì)間兩兩個體之間的親緣關(guān)系遠近可以判定群體之間遺傳多樣性豐富情況。研究所涉及的24份不同種源茖蔥品種間遺傳距離在0.0000～0.6667之間。其中寶清林業(yè)局茖蔥與其他品種的遺傳距離在0.1806～0.5694,表明寶清林業(yè)局茖蔥與其他品種茖蔥親緣關(guān)系較遠。使用UPGMA法對不同種源的24種茖蔥進行聚類分析,得到一個可以判定茖蔥親緣距離遠近的樹狀圖(圖1),從圖中可知茖蔥主要分為兩大類群。第Ι類群包括16份種質(zhì),分別來源于鶴北金礦林場、同江前進農(nóng)場、伊春紅星林業(yè)局湯北林場、撫遠大峰場林場、虎林七虎林場、饒河大頂子山、伊春-友好林業(yè)局三合林場、湯旺河日新、沾河-沾中林場、密山856農(nóng)場、伊春-五營翠北林場、伊春-新春林業(yè)局北溝林場、沾河-幸福林場、依蘭林業(yè)局煙囪山林場、鶴崗?fù)沧訙狭謭?、寶清林業(yè)局東方紅林場。第Ι類群又分為兩個亞類,亞類Ι包括:鶴北金礦林場、同江前進農(nóng)場、伊春紅星林業(yè)局湯北林場、撫遠大峰場林場、虎林七虎林場、饒河大頂子山、伊春-友好林業(yè)局三合林場、湯旺河日新、沾河-沾中林場、密山856農(nóng)場、伊春-五營翠北林場、伊春-新春林業(yè)局北溝林場、沾河-幸福林場、依蘭林業(yè)局煙囪山林場,說明以上14份茖蔥親緣關(guān)系相近。亞類Ⅱ包括:鶴崗?fù)沧訙狭謭觥毲辶謽I(yè)局東方紅林場,說明上述兩份茖蔥親緣關(guān)系最近。第Ⅱ類群包括6份種質(zhì),分別來源于八面通林業(yè)局純盛經(jīng)營所、寶清林業(yè)局、老黑山、吉林敦化、雞西柞木林場、穆棱林業(yè)局蓮河林場、綏陽雙芽子林場、綏陽暖泉河林場。第Ⅱ類群同樣包括兩個亞類,亞類Ι包括:八面通林業(yè)局純盛經(jīng)營所、寶清林業(yè)局兩份茖蔥種質(zhì),說明這兩份茖蔥親緣關(guān)系近于其他種質(zhì);亞類Ⅱ包括老黑山、吉林敦化、雞西柞木林場、穆棱林業(yè)局蓮河林場、綏陽雙芽子林場、綏陽暖泉河林場等6份種質(zhì)。

3 討論

研究利用33對SSR引物對24份不同茖蔥種質(zhì)的親緣距離遠近進行分析,結(jié)果表明,黑龍江省不同茖蔥種源間遺傳距離較遠,具有豐富的遺傳多樣性。對24份不同茖蔥種源分析可以看出其主要分為兩大類群Ⅰ和Ⅱ,第Ⅰ類群和第Ⅱ類群又各分為2個亞類群,聚類結(jié)果表明不同茖蔥種源間親緣距離遠近與其種植位置有一定關(guān)聯(lián),但并非完全相同。

茖蔥主要分布于北半球(歐亞大陸、美洲)等地[13]。茖蔥最原始種為二倍體,現(xiàn)存二倍體、三倍體、四倍體三種類型種群[4]。在我國茖蔥主要分布于東北三省、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、湖北、河南等地,其生長地點與海拔高度和緯度有很大關(guān)系,海拔高度隨緯度增加而降低[15-16]。目前有關(guān)鑒定茖蔥品種親緣關(guān)系遠近的報道,主要通過以下幾種方法:(1)從形態(tài)學(xué)上通過解剖不同品種茖蔥種群,對茖蔥的不同組織器官(鱗莖、葉片、花、種子等)等仔細(xì)觀察和測量,區(qū)分不同種質(zhì)。(2)初步判定茖蔥染色體為8 n,核型為2A型,通過染色體形態(tài)和核型分析,辨別不同種質(zhì)之間關(guān)系[17]。

不同種質(zhì)資源間生理形態(tài)會有一定區(qū)別,但也可能區(qū)別不是很明顯,導(dǎo)致在進行生理生態(tài)表型或者指標(biāo)的測定時無法直接檢測出,此時從核酸角度進行分析,即利用SSR等分子標(biāo)記方法進行種質(zhì)資源多樣性研究,是彌補農(nóng)藝性狀差別不大的最佳方法。SSR標(biāo)記是鑒于DNA的特異性標(biāo)記方法,其引物具有可重復(fù)強、多態(tài)性好、穩(wěn)定性佳等特點。

研究中的24份種質(zhì)資源被分為2大類,通過聚類結(jié)果可知,茖蔥種質(zhì)資源親緣關(guān)系受地理資源影響不大,可能與茖蔥葉型、結(jié)實早晚、抽薹高度等相關(guān)農(nóng)藝性狀有一定相關(guān)性,所以在后續(xù)研究中應(yīng)該關(guān)注茖蔥的農(nóng)藝性狀,可將農(nóng)藝性狀與SSR等分子標(biāo)記方法相結(jié)合,進一步闡明茖蔥的農(nóng)藝性狀是否與茖蔥親緣關(guān)系的遠近有關(guān)聯(lián)性。

綜上所述,SSR標(biāo)記技術(shù)可從分子角度闡明黑龍江省不同種源地野生茖蔥群體間豐富的遺傳多樣性和親緣距離遠近,茖蔥種質(zhì)間親緣關(guān)系與地理來源關(guān)系不大,可能與茖蔥農(nóng)藝性狀有一定相關(guān)性。種質(zhì)聚類結(jié)果可為了解黑龍江省不同種源地茖蔥品種親緣關(guān)系遠近提供了技術(shù)支持,也為進一步研究和利用這些茖蔥種質(zhì)資源奠定良好的理論基礎(chǔ)。

通過對茖蔥遺傳多樣性的深入研究,可以更好地了解茖蔥的遺傳背景,為茖蔥資源的保護和利用提供科學(xué)依據(jù)。此外,對茖蔥種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化進行研究,可以為茖蔥的遺傳改良和育種提供重要參考。茖蔥的遺傳多樣性研究是當(dāng)前生態(tài)保護和生物多樣性研究領(lǐng)域的熱點問題,也具有重要的理論和實踐意義。通過研究,更好地了解黑龍江省內(nèi)茖蔥天然種群的遺傳多樣性,為促進茖蔥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和茖蔥資源的保護提供科學(xué)依據(jù)。