燕麥PRR基因家族鑒定與表達(dá)分析

南金生,王躍飛,安江紅,3,劉 娜,溫欣燕,王夢旭,王媛媛,強 澤,韓 冰

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類種質(zhì)創(chuàng)新利用自治區(qū)高等學(xué)校重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)中心,內(nèi)蒙古呼和浩特 010010;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010031)

燕麥?zhǔn)呛瘫究蒲帑湆?AvenasativaL.)一年生草本植物,是一種世界性的糧飼兼用作物[1]。光是植物的重要環(huán)境因子,參與多個生理過程,包括光形態(tài)建成、避蔭反應(yīng)、種子萌發(fā)、開花和衰老[2-3]。植物通過自身的光響應(yīng)系統(tǒng),能夠準(zhǔn)確及時地響應(yīng)外界光信號的變化[4-5]。晝夜長短影響植物開花的效應(yīng)叫做光周期現(xiàn)象,Garner和Allar在1920年研究發(fā)現(xiàn)日照長度是調(diào)控?zé)煵莩苫ǖ闹匾蛩?由此提出光周期現(xiàn)象[6]。根據(jù)開花結(jié)實對晝夜長短的不同響應(yīng),將植物劃分為長日照、短日照和日中性植物等類型。

植物開花是一個受外部環(huán)境和內(nèi)部基因調(diào)節(jié)的復(fù)雜生物學(xué)過程。在擬南芥中,CONSTANS/CONSTANSLIKE/TOC1基因家族成員參與光周期開花調(diào)控、光信號途徑和生物鐘調(diào)控等過程[7-8]。CCT家族包括CMF(CCT MOTIF FAMILY)亞家族、COL(CONSTANS-like)亞家族和PRR亞家族[9]。氨基端的PRR/RLD(receiver like domain)結(jié)構(gòu)域和羧基端的CCT結(jié)構(gòu)域是偽應(yīng)答蛋白調(diào)節(jié)(pseudo-response regulators,PRRs)基因家族結(jié)構(gòu)的顯著特征[10-12]。N端響應(yīng)調(diào)節(jié)接收結(jié)構(gòu)域和參與ASP磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的接收域極度相似,C端CCT結(jié)構(gòu)域與酵母血紅素激活蛋白(HAP2)的NF-YA2DNA結(jié)合區(qū)相似,CO(CONSTANS)的CCT結(jié)構(gòu)域能夠與其他HAP蛋白結(jié)合[13-14]。擬南芥中鑒定出了PRR1(TOC1)、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9基因[15-17],水稻中有5個直系同源PRR基因,分別為OsPRR1/OsTOC1、OsPRR37、OsPRR59、OsPRR73和OsPRR95[18]。

傳統(tǒng)的燕麥?zhǔn)情L日照作物,當(dāng)日照時長低于14 h時,傳統(tǒng)的春夏播燕麥材料(下文統(tǒng)稱普通燕麥材料)不能抽穗開花[19]。為了提高燕麥產(chǎn)能,擴大適種范圍,創(chuàng)制光周期不敏感材料成為育種工作亟待解決的問題。前期通過野生燕麥與栽培燕麥品種的雜交創(chuàng)制出一批對光周期不敏感的種質(zhì)資源,在海南自然短日照條件下可以正常生長發(fā)育。前期通過轉(zhuǎn)錄組測序挖掘出了與光周期不敏感相關(guān)的差異表達(dá)基因,并預(yù)測了燕麥光周期不敏感模型[20];一個晝夜光周期的表達(dá)量分析表明,PRR家族成員在普通燕麥材料和光周期不敏感材料中表達(dá)量變化趨勢、表達(dá)峰值出現(xiàn)時間和表達(dá)量均存在差異,這些基因可能通過響應(yīng)晝夜節(jié)律變化進(jìn)而影響燕麥光周期敏感性[21]。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出31個與燕麥光周期不敏感相關(guān)PRR家族基因的轉(zhuǎn)錄本,進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測、進(jìn)化分析及光周期的表達(dá)分析;進(jìn)一步在全基因組水平挖掘到2個AsPRR基因家族成員,利用生物信息學(xué)方法全面分析其染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、啟動子區(qū)域的順式作用元件及其表達(dá)模式,為揭示光周期不同敏感性燕麥材料在響應(yīng)短日照脅迫下的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

供試材料包括普通燕麥紅旗2號(本實驗室保存)和之前創(chuàng)制的光周期不敏感材料gp012。對供試材料進(jìn)行短日照處理,控制日照時長為12 h,播種和遮光方法參考楊曉虹等[22]的研究。

1.2 燕麥PRR基因家族成員的鑒定

轉(zhuǎn)錄組水平:根據(jù)COG_class_annotation、GO_annotation、KEGG_annotation、KOG_class_annotation、Pfam_annotation、Swissprot_annotation、eggNOG_class_annotation和nr_annotation的分類和注釋結(jié)果篩選出與植物開花調(diào)控、晝夜節(jié)律相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。

基因組水平:根據(jù)GrainGenes網(wǎng)站(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/graingenes_ downloads/oat-ot3098-pepsico)公布的燕麥基因組數(shù)據(jù)庫,利用已經(jīng)鑒定的9條擬南芥(Arabidopsisthaliana)PRR家族蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)建隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Models,HMM),以此模型搜尋Avenasativa的所有編碼蛋白序列,使用blastp(ncbi-blast-2.10.1+)進(jìn)行比對,找出Avenasativa蛋白序列中的所有潛在的PRR家族序列。對獲得的候選序列利用軟件pfamscan(v1.6)和Pfam A(v33.1)數(shù)據(jù)庫對目標(biāo)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域注釋,確定同時含有PF06203、PF00072結(jié)構(gòu)域的序列作為最終的PRR序列。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用BLAST在線分析基因同源性;利用DNAMAN同源序列比對;利用ProtParam工具預(yù)測蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì);利用NPS@server在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。使用在線分析軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)預(yù)測基因結(jié)構(gòu);用MEME軟件(V5.0.5,http://meme.nbcr.net/meme)分析保守motif。用鑒定出來的AsPRR蛋白與擬南芥、小麥、大麥、玉米、高粱和黑麥草等的PRR蛋白家族序列構(gòu)建NJ樹。用mafft(V7.427)進(jìn)行多序列比對,然后用MEGA(MEGA7.0)軟件進(jìn)行NJ樹的構(gòu)建,Bootstrap設(shè)為1 000。截取基因結(jié)構(gòu)上游2 kb區(qū)域作為啟動子調(diào)節(jié)序列,利用(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測啟動子上面的TF結(jié)合位點。在基因啟動子物理圖譜中標(biāo)記和顯示結(jié)合位點的位置。利用在線軟件(http://www.softberry.com/berry.phtml? topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)對AsPRR家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。根據(jù)AsPRR基因在染色體上的位置,利用網(wǎng)站http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/繪制染色體物理位置圖。利用SignalP-4.1工具進(jìn)行共線性分析。

1.4 RNA的提取與cDNA合成

使用Transzol Up Plus試劑盒提取試驗材料葉片的總RNA,以超微量紫外分光光度計對RNA進(jìn)行濃度定量測定,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性和濃度,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5 引物設(shè)計

利用Primer5.0軟件,設(shè)計qRT-PCR所需引物,試驗所用引物由北京六合華大有限公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primer of the qRT-PCR analysis

1.6 qRT-PCR

以cDNA作為模板,以燕麥Actin為內(nèi)參基因,進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系20 μL: cDNA 1 μL,正反向引物各0.5 μL(10 μmol·L-1),2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL, ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性1 min;按照下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴增反應(yīng):95 ℃ 15 s,退火溫度15 s,72 ℃ 10 s, 40個循環(huán);60 ℃ 30 s,20 ℃ 10 s。每個待測基因均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)及3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥PRR家族成員理化特征分析

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中功能注釋為PRR基因的轉(zhuǎn)錄本共31個,包含6個PRR基因,分別是PRR1(7個)、PRR3(3個)、PRR6(1個)、PRR37(6個)、PRR73(12個)和PRR95(2個)。篩選獲得上述6個注釋為PRR基因的最長轉(zhuǎn)錄本,其中PRR1-7編碼513個氨基酸,PRR3-2編碼703個氨基酸,PRR3-2編碼253個氨基酸,PRR37-2編碼434個氨基酸,PRR73-2和PRR73-6均編碼767個氨基酸,PRR95-1編碼594個氨基酸(表2)。

2.2 燕麥PRR蛋白家族成員結(jié)構(gòu)域及建模

利用在線預(yù)測工具分析31個PRR基因編碼蛋白序列二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,無規(guī)則卷曲所占比例最大,其次是α螺旋,延伸鏈與β-轉(zhuǎn)角所占比例較小(圖1)。

PRR1-5、PRR1-7、PRR3-2、PRR3-3、PRR73-2、PRR73-6、PRR95-1等7個基因編碼產(chǎn)物含有REC結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域,PRR1-2、PRR73-1編碼產(chǎn)物不包含保守結(jié)構(gòu)域。同時含有REC和CCT結(jié)構(gòu)域的序列中,REC結(jié)構(gòu)域的氨基酸數(shù)目有79和104兩類,CCT結(jié)構(gòu)域的氨基酸數(shù)目也有43和44兩類,PRR1-2和PRR73-1編碼蛋白均不含有REC和CCT結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖2 燕麥 PRR 家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3 燕麥與其他物種PRR蛋白的進(jìn)化分析

為了研究燕麥PRR家族成員的進(jìn)化關(guān)系,使用MEGA7.0對燕麥PRR家族成員與其他物種的PRR蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明,PRR1與大麥(Hordeumvulgare)TOC1、小麥(Triticumaestivum)TOC-A1/TOC-B1/TOC-D1、山羊草(Aegilopstauschii)PRR1親緣關(guān)系較近;PRR3與山羊草、大麥的PRR3親緣關(guān)系較近;PRR37與山羊草親緣關(guān)系最近;PRR73與山羊草、大麥的PRR73親緣關(guān)系較近;PRR95與黑麥草(Loliumrigidum)的親緣關(guān)系最近。

圖3 燕麥與其他物種的PRR蛋白的進(jìn)化分析

2.4 燕麥AsPRR基因家族成員的全基因組鑒定

根據(jù)擬南芥PRR蛋白構(gòu)建隱馬可夫模型對燕麥蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,同時具有PF06203和PF00072結(jié)構(gòu)域的才認(rèn)定為AsPRR蛋白。結(jié)果得到2個AsPRR家族成員,分別定位在4A和5C染色體上,其中AsPRR1位于4A染色體的中部,AsPRR2位于5C染色體的末端(表3)。共線性分析結(jié)果表明二者之間不存在共線性。AsPRR1和AsPRR2基因分別編碼703和621個氨基酸,其編碼蛋白分子量分別為76.5和68.6 kDa,等電點分別為8.65和6.52,蛋白不穩(wěn)定指數(shù)分別為47.23和54.07,GRAVY值分別為-0.657和-0.756,結(jié)果表明AsPRR1和AsPRR2為不穩(wěn)定的疏水蛋白。經(jīng)亞細(xì)胞定位預(yù)測分析,AsPRR1定位在細(xì)胞外,而AsPRR2定位在細(xì)胞核中。

表3 燕麥AsPRR基因家族成員信息Table 3 Information of AsPRR gene family members in oat

2.5 燕麥AsPRR家族的基因結(jié)構(gòu)和蛋白的motif結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)過基因結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)AsPRR1和AsPRR2均包含9個外顯子和8個內(nèi)含子(圖4)。為了研究燕麥AsPRR序列的保守性,利用MEME軟件進(jìn)行蛋白序列分析,預(yù)測到15個保守motif(圖5)。motif1、motif2和motif3最為保守,而motif6、motif8、motif10和motif13等基序在兩個基因中的位置不同。

圖4 燕麥AsPRR基因結(jié)構(gòu)分析

圖5 燕麥AsPRR家族蛋白的motif分析

2.6 燕麥AsPRR蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化

為了明確燕麥AsPRR基因家族與擬南芥、水稻、小麥、大麥、黑麥草與山羊草PRR家族間的進(jìn)化關(guān)系,利用PRR蛋白與燕麥AsPRR蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6),結(jié)果發(fā)現(xiàn)AsPRR1與黑麥草的APRR3關(guān)系最近,AsPRR2與黑麥草PRR95關(guān)系最近。

2.7 燕麥AsPRR基因順式作用元件分析

截取基因結(jié)構(gòu)上游2 000 bp區(qū)域作為啟動子調(diào)節(jié)序列,分析順式作用元件的分布。圖7展示了排在前15的元件,不同元件用不同顏色表示,其中包括轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)作用元件TATA-box和CAAT、生長發(fā)育作用元件O2-site、激素響應(yīng)元件ABRE以及光響應(yīng)元件G-box等,而MYC元件可能參與調(diào)控花發(fā)育、花器官的形態(tài)發(fā)生和開花時間。

圖7 AsPRR基因啟動子區(qū)域的順式作用元件分布

2.8 燕麥AsPRR基因表達(dá)分析

短日照條件下,AsPRR基因在gp012和紅旗2號的幼穗和葉片中不同時期的表達(dá)模式不同。紅旗2號幼穗發(fā)育滯留在枝梗分化期,AsPRR1和AsPRR2在穗(圖8a和圖8b)和葉(圖8c和圖8d)的表達(dá)量均呈現(xiàn)升高趨勢;gp012可以完成整個穗分化過程,AsPRR1和AsPRR2在穗和葉的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(圖8a-d)。AsPRR1和AsPRR2在gp012的初生期幼穗中表達(dá)量與紅旗2號差異不顯著,在葉片中的表達(dá)量差異極顯著;AsPRR1和AsPRR2在gp012的伸長期幼穗中表達(dá)量與紅旗2號差異極顯著,葉片中AsPRR1的表達(dá)量在兩種材料的伸長期差異不顯著,而AsPRR2的表達(dá)量差異極顯著。隨著生長發(fā)育至枝梗分化期,AsPRR1和AsPRR2在gp012穗中的表達(dá)量顯著降低,葉片中AsPRR1和AsPRR2的表達(dá)量于伸長期就已經(jīng)開始出現(xiàn)顯著降低。AsPRR2基因在gp012的不同組織、不同時期中的表達(dá)量均高于AsPRR1(圖8f和圖8h),AsPRR2基因在紅旗2號穗中的表達(dá)量高于AsPRR1(圖8e),AsPRR1和AsPRR2在紅旗2號葉中的表達(dá)量隨著發(fā)育階段的不同而不同(圖8g)。以上結(jié)果表明,AsPRR1和AsPRR2基因參與燕麥光周期途徑,并發(fā)揮調(diào)控作用。

a是AsPRR1基因于穗部的表達(dá)量;b是AsPRR2基因于穗部的表達(dá)量;c是AsPRR1基因于葉片的表達(dá)量;d是AsPRR2基因葉片的表達(dá)量;e是基因于紅旗2號穗部的表達(dá)量;f是基因于gp012穗部的表達(dá)量;g是基因于紅旗2號葉片的表達(dá)量;h是基因于gp012葉片的表達(dá)量;A～G分別為初生期、伸長期、枝梗分化期、小穗分化期、小花分化期、雌蕊分化期和四分體期;*和**分別表示0.05和0.01水平顯著性

3 討論

3.1 多物種PRR家族基因研究及其保守結(jié)構(gòu)域

偽應(yīng)答蛋白調(diào)節(jié)家族(pseudo-response regulators,PRRs)是生物鐘核心振蕩器成員,它在維持生物鐘穩(wěn)定的調(diào)控、開花時間的調(diào)控、光合作用和氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮著非常重要的作用[23]。目前在擬南芥與水稻中PRR家族基因?qū)庵芷陂_花途徑的調(diào)控機制研究成果較多,在大麥、小麥、高粱和大豆等也發(fā)現(xiàn)了PRR家族基因。PRR家族基因還可通過調(diào)控ABA等方式影響植物抗逆性[14],對植物生物量的積累有重要影響。目前,燕麥PRR基因家族的研究較少,其調(diào)控機制尚未明確,有待進(jìn)一步研究。

REC結(jié)構(gòu)域中的磷酸激酶磷酸化位點能識別來自雙組分信號轉(zhuǎn)到系統(tǒng)的信號,在生物應(yīng)答調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[15],CCT結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的互作,能夠響應(yīng)環(huán)境的節(jié)律變化。擬南芥、大麥、小麥、水稻、高粱等植物中發(fā)現(xiàn)的PRR基因也是同時含有REC與CCT結(jié)構(gòu)域,有關(guān)保守結(jié)構(gòu)域之間具體的互作關(guān)系尚未明確。

3.2 PRR基因在多個物種中參與生理調(diào)控

在擬南芥中,PRR基因是生物鐘的核心組分,參與生物鐘循環(huán),調(diào)控下游基因表達(dá)[25]。野生和栽培大豆雜交產(chǎn)生的重組近交種群中表征了兩個生長期數(shù)量性狀基因座Gp11和Gp12,攜帶它倆的品系往往具有更短的生長期和更高的GmFT2a和GmFT5a表達(dá)[25]。PRR5、PRR7和PRR9均可以通過CONSTANS依賴性途徑控制開花時間[26],PRR7是通過抑制其他蛋白的表達(dá)來調(diào)控光周期開花的關(guān)鍵基因[27]。水稻中的PRR37在其開花過程中充當(dāng)中央阻遏物。大麥的Ppd-H1(HvPRR37)[28]在長日照下能調(diào)控HvCO-like基因的表達(dá),而短日照無明顯影響[29]。高粱中SbPRR37在長日照條件下會出現(xiàn)早上和晚上的表達(dá)峰并通過直接抑制SbEhd1的轉(zhuǎn)錄來抑制成花素FT(FLOWERING LOCUS T)的表達(dá),另一方面能夠激活CO的表達(dá)來間接抑制FT的表達(dá),從而抑制高粱開花;在短日照條件下,SbPRR37在晚上的表達(dá)峰消失,對高粱開花基因的抑制減弱。大豆中GmPRR37基因在短日照條件下對開花時間沒有明顯的影響,而在長日照條件下,GmPRR37下調(diào)促進(jìn)開花FT同系物GmFT2a和GmFT5a的表達(dá),上調(diào)抑制開花的FT同系物GmFT1a的表達(dá)[30]。除影響開花外,PRR基因還有其他功能。例如,OsPRR73通過降低表達(dá)來響應(yīng)水稻干旱脅迫[31]。冷脅迫會刺激水稻OsPRR1的響應(yīng),促進(jìn)OsPRR37、OsPRR73、OsPRR59和OsPRR95基因的表達(dá)[23]。PRR5基因表達(dá)受ABA抑制,但prr5突變體的種子發(fā)芽率顯著高于野生型,且主根長于野生型[33]。小麥TaPRR37與小麥抽穗期和株高顯著關(guān)聯(lián),OsPRR37也可以參與控制水稻抽穗期、穗粒數(shù)和株高等性狀[34]。

燕麥PRR基因家族參與光周期途徑,gp012在短日照條件下可以完成全生育期的發(fā)育過程,AsPRR1和AsPRR2基因在短日照條件下表達(dá)量下調(diào),解除了對開花調(diào)控基因FT的抑制,促使gp012能夠正常進(jìn)入小穗分化期發(fā)育階段。

3.3 PRR的短串聯(lián)重復(fù)序列

AsPRR基因在編碼區(qū)域存在多處短串聯(lián)重復(fù)序列。編碼區(qū)域的大多數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列變異可能會引起錯義突變、同義突變甚至移碼突變,產(chǎn)生新型的蛋白質(zhì),從而引起基因功能的增加或者丟失。外顯子區(qū)域的微衛(wèi)星序列變異使外顯子區(qū)域序列的多樣化,可能會影響基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。植物中的串聯(lián)重復(fù)序列在外顯子區(qū)域密度較低,但它們的消失可能引起剪輯改變、外顯子改組和點突變,從而改變基因表達(dá)進(jìn)而極可能導(dǎo)致表型的改變[35]?；蜷g隔區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)序列變異通常不會直接影響基因表達(dá),但可通過影響染色質(zhì)組織結(jié)構(gòu)來調(diào)控基因表達(dá)從而間接影響基因的功能[36],如在著絲粒區(qū)域產(chǎn)生折疊而形成特殊的二級結(jié)構(gòu)或者更高的結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

燕麥光周期敏感性與穗發(fā)育從枝梗分化期向小穗分化期的轉(zhuǎn)化有關(guān),短日照條件下,AsPRR基因在小穗分化期的下調(diào)表達(dá)促進(jìn)了gp012在開花;普通燕麥材料與光周期不敏感性材料的PRR基因在UTR、外顯子和內(nèi)含子區(qū)域均存在差異。