C 型副雞禽桿菌山東株的分離及PCR 鑒定*

吳憶春，苗立中

（1.濱州職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東 濱州 256603；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum, Apg）是雞傳染性鼻炎的病原菌，可引起雞上呼吸道感染，導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率下降和育成雞死淘率增加，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。Page 采用玻片凝集法將副雞禽桿菌分為A、B、C 三種血清型[2]。Blackall 等采用血凝抑制方法（HI）把A 型和C型分為4 個亞型（A1~A4，C1~C4）[3]。該病在全世界廣泛流行。我國首例雞傳染性鼻炎報道于1987 年，分離于北京某養(yǎng)殖場，鑒定為A 型副雞禽桿菌[4]；林毅等在1995 年分離到C 型副雞禽桿菌[5]；2002 年以后陸續(xù)有分離到B 型副雞禽桿菌的報道[6-7]。

2022 年11 月份山東某蛋雞養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的蛋雞接連出現(xiàn)疑似感染傳染性鼻炎的癥狀，如顏面腫脹、鼻腔和鼻竇有漿液性分泌物等。經(jīng)問診了解，該批次蛋雞發(fā)病前1 個月剛接種雞傳染性鼻炎A 型滅活疫苗。為了查找免疫失敗原因，通過對病雞剖檢、細(xì)菌分離、PCR 鑒定、血清分型，對分離菌株進行了初步鑒定。此外，選擇了編碼免疫保護相關(guān)血凝蛋白基因的HMTp210 基因高變異Region 2 進行了測序分析，確診該蛋雞場雞群發(fā)病為C 型副雞禽桿菌感染引起。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

副雞禽桿菌培養(yǎng)基購買自北京海天生物科技有限公司，雞血清購買自天津康源生物，輔酶購買自上海源葉生物，引物合成自上海生工，副雞禽桿菌A、B、C 陽性血清和副雞禽桿菌A、B、C 標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所?；蚪M提取試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司。Genstar 2×Taq mix 購自康潤生物。

1.2 細(xì)菌分離

無菌剪開發(fā)病雞的眶下竇，用接種環(huán)蘸取眶下竇內(nèi)容物，在含有NAD 的血清瓊脂平板上劃線，于蠟燭罐中厭氧培養(yǎng)24~48 h。挑取單個可疑菌落接種到含有NAD 的血清瓊脂平板上，進行純培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3 PCR 鑒定

取純化的菌株液體培養(yǎng)物，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組，作為PCR 模板。參照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)》（NY/T538-2015 ）設(shè)計、合成引物，引物序列如下：

反應(yīng)體系：2×Taq mix 12.5 μL，A-F（10 μmol/L）1 μL，A-R（10 μmol/L）1 μL，模板1 μL，無菌去離子水10.5 μL，總體積為25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)熱5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠檢測，在凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有500 bp 大小的目的條帶出現(xiàn)。

1.4 動物回歸試驗

用60 日齡SPF 雞6 只，置于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)，其中4 只在眶下竇內(nèi)注射分離菌株液體培養(yǎng)物，0.2 mL/只，含菌量為1.5×105CFU/0.2 mL，剪翅作為標(biāo)記；其余2 只雞在眶下竇注射液體培養(yǎng)基作空白對照，置另一隔離器飼養(yǎng)。觀察14 日，記錄發(fā)病情況，并再次取鼻竇分泌物進行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.5 血清型鑒定

具體方法參照NY/T538-2015 的血凝抑制試驗（鑒定副雞禽桿菌血清型）部分。如被檢抗原與某型陽性血清的HI 效價最高，則判定該抗原為該血清型。

1.6 HMTp210 基因Region 2 序列測序

采用Ryuichi 等[8]設(shè)計的一對擴增HMTp210基因高變異2 區(qū)的引物，引物序列如下：

反應(yīng)體系：2× ExTaq mix 25 μL, H-F（10 μmol/L）1 μL，H-R（10 μmol/L）1 μL，模板1 μL，無菌去離子水22 μL，總體積為50 μL。反應(yīng)程序為：98 ℃ 預(yù)熱1 min，98 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，回收產(chǎn)物送上海生工測序。Blast 搜索GenBank 中的同源序列，采用分析軟件MegAlign中的Clustal W 方法進行序列比較分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

在含有NAD 的血清瓊脂平板上，生長出無色細(xì)小菌落，菌落濕潤、光滑、邊緣整齊。革蘭氏染色觀察呈陰性小桿菌，細(xì)菌均勻分散排列；分離菌株命名為SD-2022。

2.2 PCR 結(jié)果

PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，分離的菌株與陽性對照均在500 bp 左右有特異性目的條帶（圖1），與預(yù)期大小一致，推測分離到的菌株為副雞禽桿菌。

圖1 副雞嗜血桿菌PCR鑒定結(jié)果（詳見附錄彩圖）

2.3 動物回歸試驗結(jié)果

經(jīng)眶下竇注射分離菌株SD-2022 菌液的4 只SPF 雞在24~72 h 內(nèi)均出現(xiàn)眶下竇及面部水腫、食欲減退、呼吸困難等典型的雞傳染性鼻炎臨床癥狀；對照組未有明顯的臨床癥狀。取發(fā)病雞鼻竇分泌物進行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)形態(tài)觀察、革蘭氏染色鏡檢結(jié)果、PCR 檢測結(jié)果綜合判斷該分離菌為副雞禽桿菌。

2.4 血清型鑒定結(jié)果

血清型鑒定結(jié)果如表1 所示。根據(jù)血凝抑制試驗，分離株SD-2022 抗原與C 型陽性血清具有最高的血凝抑制效價，可判定分離株的血清型為C 型。值得注意的是，分離菌株SD-2022 的抗原與A 型血清也具有血凝效價，說明分離菌株SD-2022 抗原與A 型菌株血清具有交叉反應(yīng)。

表1 分離株SD-2022 的抗原鑒定結(jié)果

2.5 HMTp210 基因Region 2 測序結(jié)果分析

副雞禽桿菌HMTp210 基因Region 2 測序結(jié)果顯示，擴增SD-2022 菌株的HMTp210 基因Region 2 序列長為1 689 bp。所得序列在GenBank中BLAST CBI 數(shù)據(jù)庫與已發(fā)表的副雞禽桿菌HMTp210 基因2 區(qū)序列進行同源性比較，在所得的83 個檢索結(jié)果中，選取已知血清型的副雞禽桿菌菌株，從GenBank 上下載其HMTp210 基因2區(qū)序列，用MegAlign軟件中的Clustal W方法分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）和同源率圖譜（圖3）。結(jié)果可知，分離菌株SD-2022 與CP113955.1-CChina C 型副雞禽桿菌HMTp210 基因Region 2 序列同源性最高，為99.8%；與TW07、TW94C 型分離株H18 株同源性較低，為87%左右。分離菌株SD-2022 與國內(nèi)A 型和B 型副雞禽桿菌分離株HMTp210 基因Region 2 序列同源率為90.4%。

圖3 SD-2022菌株與Genbank中其他27種副雞禽桿菌的同源率圖譜

3 討論

近幾年來，隨著國家對飼料禁抗、蛋雞產(chǎn)蛋期禁抗政策實施以來，雞傳染性鼻炎的發(fā)生和流行呈上升趨勢，養(yǎng)殖場雖然加強了雞傳染性鼻炎疫苗的免疫預(yù)防，但國內(nèi)很多蛋雞場仍發(fā)生雞傳染性鼻炎免疫失敗的事件，給養(yǎng)殖戶造成了較大的經(jīng)濟損失[9]。

HMTp210 基因是編碼副雞禽桿菌外膜蛋白的一段基因序列，被認(rèn)為是A 型和C 型Apg 主要的保護性抗原基因和致病性基因[10]。其中Region 1和Region3 基因序列在Apg 血清A 型和C 型之間高度保守，高變區(qū)Region 2 的基因序列在Apg 血清A 型和C 型之間差異較大，具有一定的血清型特異性[11]。為了分析該蛋雞養(yǎng)殖場致病菌株與常見流行株保護性抗原差異，本文對HMTp210 基因Region 2 序列進行了擴增測序、Blast 比對。結(jié)果分析顯示，分離株SD-2022 與CP113955.1-C-China C 型流行株主要保護性抗原同源率高達(dá)99.8%，與TW07、TW94 等C 型流行株同源性為87%左右，與國內(nèi)A 型、B 型流行株的同源率也較低。有文獻報道，副雞禽桿菌4 種A 型血清型（A1~A4）之間具有很好的交叉免疫保護，但4種C 型血清亞型（C1~C4）之間免疫交叉保護效果有限，同時A 型、B 型和C 型不同血清型之間交叉免疫保護效果不盡人意[12]。限于條件限制，本次試驗未能對SD-2022 分離株進一步進行C 型（C1-C4）亞型分型。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該蛋雞場只免疫了雞傳染性鼻炎A 型滅活疫苗，不能對C 型副雞禽桿菌產(chǎn)生很好保護，這可能是該蛋雞場免疫失敗的主要原因。

雞傳染性鼻炎發(fā)生的原因是雞群未免疫或疫苗所含菌株與流行菌株血清型不對型造成的。因此，加強流行病學(xué)調(diào)查，篩選免疫原性好的疫苗菌株，研制含A 型、B 型、C 型的多價滅活疫苗或基因工程疫苗[13-14]是減少雞傳染性鼻炎發(fā)病的有效方法。下一步，將對SD-2022 菌株的毒力和免疫保護性試驗開展工作。