防治雞大腸桿菌病復(fù)方中藥口服液的篩選*

劉月月，林樹乾，王林，張?zhí)焐?，殷斌，楊世發(fā)，黃中利**

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟南 250100；2.動物保健品山東省工程研究中心，山東 濟南 250100；3. 濟南億民動物藥業(yè)有限公司，山東 濟南 250105；4. 濟南新舊動能轉(zhuǎn)換起步區(qū)大橋街道辦事處，山東 濟南 250021）

雞大腸桿菌病是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一，主要表現(xiàn)為精神萎靡、發(fā)熱、飲水增加、腹瀉、死亡等癥狀，剖檢可見肝周炎、心包炎、氣囊炎、胃腸炎等[1-2]。按中獸醫(yī)理論進行辨證，雞大腸桿菌可辨為濕熱蘊結(jié)（胃、腸、肺、肝）引起的濕熱證，治療原則宜側(cè)重于清氣血分熱、利（燥）濕止痢、涼血止血為主[3-4]。目前，關(guān)于中藥在治療大腸桿菌病的生產(chǎn)中有諸多報道，其中研究證實味甘或酸或苦、性寒或平、歸胃經(jīng)或心經(jīng)或肝經(jīng)、涼血止血或清熱解毒類中藥可降低該病的發(fā)病率和死亡率，如以白頭翁、黃連、黃柏和秦皮四味藥組成的白頭翁湯在治療仔豬黃白痢、禽大腸桿菌性腹瀉、兔大腸桿菌病等腹瀉性疾病均具有良好的療效[5-7]；而味辛、性溫或熱、歸脾經(jīng)、祛風(fēng)類中藥效果并不明顯。為研制新型抗菌中藥制劑，我們以中獸醫(yī)學(xué)理、法、方、藥為依據(jù)，針對雞大腸桿菌臨床證候和病理變化特征，以清熱燥濕止痢、清熱瀉火健脾止痢、清熱燥濕涼血止痢和清熱瀉火涼血止痢的四個自擬組方（同時設(shè)清熱瀉火、涼血止痢的白頭翁口服液做對照），進行復(fù)方中藥體內(nèi)外抗雞大腸桿菌效果的研究，旨在為大腸桿菌病的防治提供新的藥材及思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組方及原則 陽性藥物組（白頭翁口服液）：白頭翁、黃連、黃柏等成分，由山東昊泰藥業(yè)科技有限公司生產(chǎn)；清熱燥濕止痢（組方1）：郁金、大黃、梔子等成分，由本實驗室煎制；清熱瀉火健脾止?。ńM方2）：生石膏、白頭翁、兒茶等成分，由本實驗室煎制；清熱燥濕涼血止痢（組方3）：白頭翁、黃柏、茵陳等成分，由本實驗室煎制；清熱瀉火涼血止?。ńM方4）：生石膏、千里光、墨旱蓮等成分，由本實驗室煎制；藥材均購于濟南市建聯(lián)中藥有限公司，經(jīng)鑒別符合2020 版《中華人民共和國獸藥藥典》（二部）要求，加水煎煮兩遍，濃縮至1 g/mL生藥的口服液。

1.1.2 菌種來源 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所分離的大腸桿菌地方株SD 09-29，血清型為O24。

1.1.3 試驗動物 19 日齡SPF 公雞，由山東昊泰繁育公司提供。

1.1.4 試劑 牛肉浸膏、蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 SPF 雞飼養(yǎng)隔離器，蘇州馮氏實驗動物設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，濟南杰康凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；ZD-85A 數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司產(chǎn)品；電子體溫計，丹麥KRUUSE 電子體溫計；雙碟、陶瓦蓋、牛津杯等。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液處理 中藥口服液6 000 r/min 離心3 min，取上清液121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 菌液制備 取0.1 mL SD 09-29 菌液接種5 mL普通LB 培養(yǎng)基，至恒溫氣浴振蕩器中，150 r/min，37 ℃培養(yǎng)過夜，細菌含量為30.0×1010CFU/mL，LD50為4.125×107CFU/mL。

1.2.3 體外抑菌效果的研究 采用牛津杯法。制備含0.5%比例菌液的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，待平板凝固后用鑷子將牛津杯擺放于凝固好的培養(yǎng)基上，每個牛津杯內(nèi)加入300 μL 的中藥。每種藥做3 個重復(fù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.4 對雞人工感染大腸桿菌效果的研究 ①分組：選取19 日齡SPF 公雞，隨機分為中藥預(yù)防組、中藥治療組、攻菌對照組和空白對照組，每組30只雞，飼養(yǎng)于不同的隔離器內(nèi)；②攻菌與用藥：用藥組、攻菌對照組雞腹腔接種1 000 LD50菌液，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。各預(yù)防組攻菌前3 d，按2 mL/kg 體重，上、下午兩次灌服；治療組攻菌后，按2 mL/kg 體重，上、下午兩次灌服，連用5 d；攻菌對照組與空白對照組灌服等量生理鹽水。

1.2.5 最優(yōu)組方對人工感染大腸桿菌雞體溫的研究 ①藥物選?。哼x取攻菌保護試驗效果最好的中藥作為試驗藥；②分組：選取19 日齡SPF 公雞隨機分為藥物預(yù)防組、藥物治療組、藥物預(yù)防+治療組、攻菌對照組和空白對照組，每組5 只雞。③攻菌與用藥：用藥組、攻菌對照組雞腹腔接種1 000 LD50菌液，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。預(yù)防組攻菌前3 d，按2 mL/kg 體重，上、下午兩次灌服；治療組攻菌后，按2 mL/kg 體重，上、下午兩次灌服；攻菌對照組與空白對照組，灌服等量生理鹽水。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 10.0 對各組雞最早死亡時間、24 h和96 h死亡率、肝病變率、心包炎率進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中藥體外抑菌效果的研究

表1 為復(fù)方中藥體外抑菌效果。從表1 可以看出，以上4 個組方對大腸桿菌體外均有不同程度的抑菌作用，其中組方2、組方3 和組方4 抑菌圈較大，邊界清晰，效果明顯優(yōu)于陽性藥物組。

表1 復(fù)方中藥體外抑菌效果 單位：mm

2.2 復(fù)方中藥體內(nèi)抑菌效果的研究

2.2.1 復(fù)方中藥對預(yù)防大腸桿菌感染效果的研究表2 為復(fù)方中藥對預(yù)防大腸桿菌感染效果的影響結(jié)果。從表2 可見，提前給藥3 d 后進行大腸桿菌攻毒，組方2 和組方4 在攻菌24 、96 h 的死亡率極顯著低于攻菌對照組（P<0.01），且優(yōu)于陽性藥物組；肝病變率中，發(fā)現(xiàn)4 種方劑均有一定程度的抑菌效果，其中組方2 和組方4 顯著低于攻菌對照組（P<0.01）；心包炎率結(jié)果可見，組方1、組方4 顯著低于攻菌對照組（P<0.05）。綜合以上結(jié)果，由生石膏、千里光等為主要成分的清熱瀉火涼血止痢方劑具有較好地預(yù)防大腸桿菌病的效果。

表2 復(fù)方中藥對預(yù)防大腸桿菌感染效果的影響（n=30） 單位：%

2.2.2 復(fù)方中藥對治療大腸桿菌感染效果的研究表3 為復(fù)方中藥對治療大腸桿菌感染效果的影響結(jié)果。從表3 可見：感染大腸桿菌后給予上述方劑，在24 h 死亡率和96 h 死亡率方面，組方1、組方4 顯著低于攻菌對照組（P<0.01），且優(yōu)于陽性藥物組；肝病變率方面，組方3、組方4 顯著低于攻菌對照組（P<0.05）；心包炎率方面，組方3和組方4 的效果也顯著優(yōu)于攻菌對照組（P<0.05）。綜上，組方3 和組方4 在大腸桿菌病的治療上具有很好的療效。

表3 復(fù)方中藥對治療大腸桿菌感染效果的影響（n=30） 單位：%

2.2.3 最優(yōu)組方對感染大腸桿菌雞體溫的影響表4 為組方4 對感染大腸桿菌雞體溫的影響。從表4 可見，用藥后各組體溫均顯著高于空白對照組，且低于攻菌對照組（P<0.05）。說明組方4在雞大腸桿菌病的預(yù)防和治療方面均有非常好的效果。

表4 復(fù)方中藥對治療大腸桿菌感染效果的影響（n=30） 單位：%

3 討論

本研究根據(jù)組方原則，自擬4 個組方對雞大腸桿菌病進行了防治效果觀察，并以白頭翁口服液作為陽性對照，分別通過體外抑菌效果、死亡時間、肝病變率和心包炎率等指標(biāo)來評價中藥組方的療效。在體外抑菌試驗中，4 個復(fù)方中藥組方對分離的大腸桿菌均具有不同程度的抑制作用[8]。

為了進一步驗證其臨床效果，我們采用SPF雞，對實驗室分離到的大腸桿菌臨床毒株，進行4 個組方的預(yù)防和治療效果檢測。綜合臨床結(jié)果分析，中藥預(yù)防雞大腸桿菌效果以清熱瀉火涼血止痢為主的組方4 效果最好，其次為清熱瀉火、健脾止痢為原則的組方2，這兩個組方均與黨參、黃芪能提高機體的非特異性免疫力有關(guān)[9-10]；同時方中的生石膏具有清熱瀉火，除煩止渴功效[11]。研究證實石膏、知母、黃柏等可使動物腦內(nèi)多巴胺β-羥化酶活性降低，抑制去甲腎上腺素合成[12]，能迅速降低大腸桿菌感染引起的體溫升高，故預(yù)防效果較好。同時組方2 中配伍的墨旱蓮、側(cè)柏葉、地錦草涼血止血功力更強[13-15]，能有效抑制大腸桿菌感染后血管通透性增強引發(fā)的滲出和出血，故肝臟病變率、心包炎率、氣囊炎率各組最低，雖然陽性藥物白頭翁口服液中也含有補中益氣的黃芪、養(yǎng)陰潤燥的黃精、補肝腎的牛膝和固精斂汗的五味子，但清熱瀉火之藥味不足，故而效果不佳。

在大腸桿菌病的治療試驗中，除了組方4，我們還發(fā)現(xiàn)清熱燥濕涼血止痢的組方3 也有很好的治療效果，這與組方中白頭翁能夠清熱解毒，涼血止痢，茵陳清肝經(jīng)濕熱，及大腸桿菌主要侵害肝臟相對應(yīng)[16]；白及收斂止血，與大腸桿菌引起的出血、滲出等病理變化相對應(yīng)[17]，故而肝病變率、心包炎率最低；蒼術(shù)和茯苓燥濕、利水健脾[18-19]，與大腸桿菌引起的腸道滲出增加、排稀便相對應(yīng)，故治療人工感染雞大腸桿菌的效果較好。

4 結(jié)論

綜上所述，以生石膏、千里光等為主要成分的清熱瀉火涼血止痢方劑具有較好地降低雞體溫和防治雞大腸桿菌病的效果，可在臨床生產(chǎn)中使用。