基于Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)探究冷藏菊黃東方鲀菌群演替規(guī)律

曾 鷺，劉淑集，陳曉婷，林河通,*，劉智禹,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建水產(chǎn)研究所 國(guó)家海水魚(yú)類加工技術(shù)研發(fā)中心，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013）

菊黃東方鲀（Takifugu flavidus）屬鲀形目、鲀科、東方鲀屬。其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，同時(shí)富含多種必需氨基酸和鉀、磷、鈣等多種礦物質(zhì)[1-2]。菊黃東方鲀養(yǎng)殖區(qū)域主要分布在福建、山東、江蘇、廣東等沿海地區(qū)，且養(yǎng)殖的菊黃東方鲀需在經(jīng)備案的加工廠處理后，以鮮品（0～4 ℃冷藏）或凍品（-18 ℃貯藏）的形式進(jìn)入市場(chǎng)流通[3]。然而，由于菊黃東方鲀體內(nèi)蛋白質(zhì)和水分含量較高，容易受到外源微生物的侵染，少部分微生物在魚(yú)體內(nèi)不斷繁殖，迅速生長(zhǎng)成為魚(yú)體的特定腐敗菌[4-5]，這些腐敗菌往往具有很強(qiáng)的致腐性[6]，會(huì)導(dǎo)致魚(yú)肉組織結(jié)構(gòu)分解，氧化酸敗的速度加快，進(jìn)而產(chǎn)生硫化物、醛、胺、有機(jī)酸等有害物質(zhì)，嚴(yán)重影響魚(yú)肉的品質(zhì)和貯藏期[7-8]。鑒定并抑制引起菊黃東方鲀冷藏期間腐敗變質(zhì)的微生物菌群，是保持魚(yú)肉品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期的關(guān)鍵。

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)鑒定菌種，需要多次純化培養(yǎng)，分離得到單菌株后，再由進(jìn)一步的生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定得出結(jié)果。但是在培養(yǎng)過(guò)程中，只采用一種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，不能或很難同時(shí)培養(yǎng)出所有的微生物，有些微生物需要在選擇性培養(yǎng)基才能培養(yǎng)，所以如果想要較準(zhǔn)確地培育出大部分微生物，需要采用多種不同的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，增加了許多工作量。高通量測(cè)序技術(shù)作為一種免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)提取樣品中微生物的DNA或RNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而得到具體的群落多樣性信息[9-10]。它具有數(shù)據(jù)產(chǎn)出快速、通量高且分析全面等特點(diǎn)，能詳細(xì)反映樣本中微生物的菌落情況[11]。其中16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序是指通過(guò)對(duì)V4區(qū)或V3～V4區(qū)序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增再測(cè)序的方法，常被應(yīng)用于研究樣品中微生物群落組成結(jié)構(gòu)，目前已被廣泛應(yīng)用于土壤、根際、環(huán)境、動(dòng)物腸道以及食品等領(lǐng)域的研究中[12-15]，極大改變了人們對(duì)微生物生態(tài)學(xué)的認(rèn)識(shí)。高通量測(cè)序技術(shù)在河鲀中的應(yīng)用主要在于探究河鲀腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)分布[16-19]，而針對(duì)冷藏過(guò)程中河鲀微生物菌群組成和特定腐敗菌的研究，僅李萌等[20]研究表明了導(dǎo)致冷藏紅鰭東方鲀腐敗變質(zhì)的關(guān)鍵菌主要是熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescent）、莓實(shí)假單胞菌（P.fragi）、熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）和鄉(xiāng)間布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）。然而，不同品種、不同貯藏環(huán)境都會(huì)使腐敗菌的種類發(fā)生改變[21-24]，有關(guān)菊黃東方鲀?cè)诶洳貤l件下表面微生物變化的研究還鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究以菊黃東方鲀冷藏過(guò)程的菌落總數(shù)（total viable count，TVC）和揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值測(cè)定結(jié)果為依據(jù)，確定貯藏終點(diǎn)，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析養(yǎng)殖菊花東方鲀魚(yú)肉在冷藏前期（0～3 d）、中期（3～6 d）、后期（6～15 d）的菌相演替變化規(guī)律，最終確定菊黃東方鲀冷藏期間的優(yōu)勢(shì)腐敗菌及其致腐能力，以期為后期靶向抑制及品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養(yǎng)殖菊黃東方鲀購(gòu)于福建省漳州市漳浦縣，養(yǎng)殖周期為2 a，體質(zhì)量約（309.41±72.72）g，體長(zhǎng)約（22.52±1.14）cm。參照DB/T 2042—2021《養(yǎng)殖菊黃東方鲀加工技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行宰殺，去內(nèi)臟、魚(yú)皮、魚(yú)頭和魚(yú)鰭，隨后用冰水沖洗直至無(wú)污物無(wú)血水，瀝干，于（0±2）℃冰箱保藏。

甘油、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、無(wú)水碳酸鉀、硼酸、水溶性膠、0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、甲基紅、溴甲酚綠 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、0.85%無(wú)菌生理鹽水管 青島海博生物技術(shù)有限公司；生理鹽水 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；TVC測(cè)試片 廣東達(dá)元綠洲食品安全科技股份有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Hieff?Robust PCR Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads 上海Yeasen公司；pMD18-T Vector連接試劑盒 日本TaKaRa公司；Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Life公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 美國(guó)Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Thermo Fisher公司；GL-88B旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；Q32866Qubit?3.0熒光計(jì) 美國(guó)Invitrogen公司；ETC 811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；3730XL測(cè)序儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市科教器材廠；TH2-C恒溫?fù)u床 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HC-2518R冷凍高速離心機(jī)英國(guó)BBI公司。

1.3 方法

1.3.1 TVC測(cè)定

參考GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。取1、3、5、7、9、11 d的魚(yú)肉樣品25 g，絞碎后加入225 g生理鹽水，振蕩混勻，靜置3 min，取上清液，并進(jìn)行梯度稀釋，制成不同濃度的菌懸液。分別吸取1 mL菌懸液于TVC測(cè)試片中，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.2 TVB-N值的測(cè)定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中第三法微量擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定。取1、3、5、7、9、11 d的魚(yú)肉樣品20 g，浸泡0.5 h后，取上清液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 16S rDNA高通量測(cè)序

1.3.3.1 實(shí)驗(yàn)材料及預(yù)處理

取冷藏解凍后菊黃東方鲀的背部肌肉分別于0、3、6、9、12、15 d進(jìn)行采樣，并依次編號(hào)為R0、R3、R6、R9、R12、R15，后測(cè)序。

1.3.3.2 細(xì)菌總DNA的提取

參考李凱凱等[25]的方法，將絞碎后的樣品加入適量鋼珠和裂解液，放入2 mL離心管中，使用破碎儀破碎后用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒進(jìn)行提取。

1.3.3.3 PCR擴(kuò)增

引物序列：341F-CCTACGGGNGGCWGCAG；805R-GACTACHVGGGTATCTAATCC。第1輪擴(kuò)增：反應(yīng)體系（30 μL）為2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL、Bar-PCR Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、PCR products 10～20 ng、H2O 9～12 μL；第2輪擴(kuò)增：反應(yīng)體系（30 μL）：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL、Primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、PCR products 20～30 ng、H2O 9～12 μL。

1.3.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定

參考孟凌云等[26]的方法并稍作修改，將冷藏后期的樣品攪碎，加入無(wú)菌水稀釋到一定梯度，隨后用接種環(huán)劃線到固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)36 h，挑取不同形態(tài)的單菌落（共10 株）于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，劃線純化3 次后，菌液中加入20%的甘油進(jìn)行保種，置于-20 ℃中保藏。菌種進(jìn)行測(cè)序、鑒定。

1.3.5 優(yōu)勢(shì)腐敗菌致腐能力的比較

參考趙宏強(qiáng)等[27]的方法對(duì)不同腐敗菌致腐能力進(jìn)行分析，并根據(jù)1.3.1、1.3.2節(jié)方法分別檢測(cè)冷藏初期與末期時(shí)單位數(shù)量腐敗菌產(chǎn)生的TVC和TVB-N值，以腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子作為評(píng)估腐敗能力的指標(biāo)，按下式計(jì)算：

式中：TN1、TN0分別為末期和初期TVB-N值/（mg/100 g）；TC1、TC0分別為末期和初期TVC/（CFU/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用mothur進(jìn)行rarefaction分析，應(yīng)用R軟件制作曲線圖。采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理，SPSS Statistics 21進(jìn)行顯著性分析，Origin 8.5繪制曲線。采用MEGA 11.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊黃東方鲀冷藏期間TVC和TVB-N值變化情況

TVC和TVB-N與水產(chǎn)品鮮度密切相關(guān)，常用來(lái)反映水產(chǎn)品的腐敗情況。有研究表明，可食用生魚(yú)肉的TVC上限值為5.00（lg（CFU/g））[28]，Zhou Ran等[29]在4 ℃冷藏條件下測(cè)得貯藏4 d的暗紋東方鲀TVC為5.07（lg（CFU/g）），而經(jīng)過(guò)保鮮處理的河鲀魚(yú)肉則是到6 d TVC才超過(guò)5.00（lg（CFU/g）），河鲀的貨架期延長(zhǎng)了2 d。如圖1所示，在貯藏過(guò)程中冷藏菊黃東方鲀的TVC逐漸增加，5 d達(dá)到了4.93（lg（CFU/g）），接近生魚(yú)肉可食用上限值，而在11 d TVC升至7.32（lg（CFU/g）），超過(guò)食品中微生物的最高限值7.00（lg（CFU/g））[30]，因此可以說(shuō)明菊黃東方鲀?cè)诶洳厍闆r下能貯藏5 d，冷藏到11 d已經(jīng)腐敗。

圖1 菊黃東方鲀冷藏過(guò)程中TVC的變化Fig.1 Changes in total viable count of T. flavidus during cold storage

根據(jù)GB/T 18108—2019《鮮海水魚(yú)通則》規(guī)定，海水魚(yú)TVB-N值一級(jí)鮮度界限值＜15.00 mg/100 g[31]，但是對(duì)于不同品種的魚(yú)，其TVB-N值的可接受上限值不同，如鱈魚(yú)魚(yú)肉中TVB-N值的可接受上限為60 mg/100 g，銀鯉和黑鱸則分別為35.00 mg/100 g和10.00 mg/100 g[32-34]，而根據(jù)馬妍等[35]的研究結(jié)果，河鲀TVB-N值的上限為12～13 mg/100 g。如圖2所示，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物數(shù)量不斷增加，促進(jìn)了蛋白質(zhì)降解，使得菊黃東方鲀的TVB-N值從7 d以后迅速增加，到9 d TVB-N值增加到12.16 mg/100 g，達(dá)到上限值；到11 d TVB-N值已超過(guò)可接受上限值。

圖2 菊黃東方鲀冷藏過(guò)程中TVB-N值的變化Fig.2 Changes in total volatile basic nitrogen content of T. flavidus during cold storage

TVC、TVB-N值、感官評(píng)價(jià)常作為預(yù)測(cè)貨架期的指標(biāo)，但是感官評(píng)價(jià)過(guò)于主觀，而TVB-N值的變化是由于微生物的繁殖，一般常用TVC預(yù)測(cè)貨架期。如周慧等[36]測(cè)定虹鱒魚(yú)在0 ℃貯藏條件下，6 d TVC為5.59（lg（CFU/g）），超過(guò)生魚(yú)肉可食用上限值，而15 d的TVB-N值為18.34 mg/100 g，未達(dá)到腐敗標(biāo)準(zhǔn)（20.00 mg/100 g），所以采用TVC確定虹鱒魚(yú)0 ℃貯藏條件下的貨架期終點(diǎn)為5 d。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，菊黃東方鲀5 d的TVC接近可食用上限，TVB-N值符合一級(jí)鮮度界標(biāo)準(zhǔn)，因此確定菊黃東方鲀?cè)? ℃冷藏條件下的貨架期終點(diǎn)為5 d。

2.2 16S rDNA高通量測(cè)序結(jié)果

2.2.1 有效序列長(zhǎng)度

通過(guò)細(xì)菌V3～V4區(qū)的測(cè)序，對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)。從河鲀魚(yú)肉共檢出70.80多萬(wàn)條有效序列，平均長(zhǎng)度在380～398 堿基對(duì)，在相似度97%的水平上進(jìn)行歸類操作，發(fā)現(xiàn)樣品在種屬水平上分類，共聚成2 026 個(gè)可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。

稀釋曲線常被用來(lái)評(píng)估樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理，以從樣本中隨機(jī)抽取的序列數(shù)為橫坐標(biāo)，與之對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)為縱坐標(biāo)，并繪制曲線，曲線的變化趨勢(shì)可以間接反映物種豐度。Shannon曲線反映了樣品中微生物的多樣性，橫坐標(biāo)為測(cè)序過(guò)程讀取的樣本數(shù)，隨著樣本數(shù)的增加，曲線的趨勢(shì)逐漸平坦時(shí)，說(shuō)明此時(shí)的測(cè)序數(shù)據(jù)量可以充分反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息[37]。如圖3、4所示，當(dāng)測(cè)序量低于10 000時(shí)，稀釋曲線呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，當(dāng)測(cè)序數(shù)量逐漸增加達(dá)到40 000時(shí)，曲線已趨于平緩，且Shannon曲線已經(jīng)完全達(dá)到飽和狀態(tài)，說(shuō)明細(xì)菌多樣性已經(jīng)得到充分展示，不會(huì)再發(fā)生變化，本研究測(cè)序量滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析要求。

圖3 不同冷藏時(shí)間菊黃東方鲀樣品稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves of bacterial community in refrigerated T. flavidus at different storage times

圖4 不同冷藏時(shí)間菊黃東方鲀樣品Shannon曲線Fig.4 Shannon curves of bacterial community in refrigerated T. flavidus at different storage times

2.2.2 多樣性分析

α多樣性指數(shù)主要包括Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)，前一個(gè)指數(shù)可以反映微生物群落分布的相對(duì)豐度，后兩者則反映了群落分布的多樣性。覆蓋率用來(lái)檢驗(yàn)本次測(cè)序結(jié)果能否代表樣本的真實(shí)情況[38]。經(jīng)檢測(cè)，樣品覆蓋率都達(dá)到了99%以上，表示大部分序列都已被檢出，說(shuō)明本研究能夠用于樣品微生物多樣性分析。

如表1所示，河鲀魚(yú)肉的Chao1指數(shù)在第3天達(dá)到最大值，隨后逐漸減小，說(shuō)明河鲀冷藏3 d細(xì)菌群落的OTU數(shù)目最多，菌群豐度最大；Simpson指數(shù)越小，菌群多樣性越高，魚(yú)肉在第3天的Simpson指數(shù)為0.20，此時(shí)菌群多樣性最高，隨后降低，這與和Huang Wenbo等[39]研究結(jié)果相似，說(shuō)明隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)境中氧含量逐漸降低，蛋白質(zhì)等大分子被分解，為優(yōu)勢(shì)物種的快速生長(zhǎng)提供條件，同時(shí)抑制了部分微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致后期多樣性和豐富度下降。

表1 樣本α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of α diversity indexes of samples

2.2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

菌群變化柱狀圖可以直觀展示樣本隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物物種組成及比例的變化情況。通過(guò)對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類，并分別在門、綱、目、科、屬水平作優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度柱狀圖（豐度占比小于1%的物種歸類為others）。

2.2.3.1 菌群門、綱水平分布

養(yǎng)殖菊黃東方鲀?cè)? ℃冷藏過(guò)程中魚(yú)肉的菌群變化豐富，在門水平上檢測(cè)到占比較大的菌門，分別有變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria_Chloroplast）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）等，在綱水平上檢測(cè)到了變形菌綱（Gammaproteobacteria）、葉 綠 體 綱（ C h l o r o p l a s t ） 、α- 變 形 桿 菌 綱（Alphaproteobacteria）和梭菌綱（Clostridia）等。從圖5a可以看出，在冷藏前期，藍(lán)細(xì)菌門在魚(yú)肉微生物菌群中的占比最大，達(dá)到56.60%，其次為未分類的細(xì)菌，所占比例為9.31%。隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)細(xì)菌門比例顯著降低，由46.51%減少至1.22%，而變形菌門的比例則顯著增長(zhǎng)，從15.90%增長(zhǎng)至96.50%（15 d），冷藏期間最高占比為99.28%，成為菊黃東方鲀冷藏期間的優(yōu)勢(shì)菌門。

圖5 樣本微生物在門水平（a）和綱水平（b）上相對(duì)豐度分布Fig.5 Relative abundance of bacteria in samples at the phylum (a) and class level (b)

整個(gè)貯藏過(guò)程綱水平的相對(duì)豐度分布情況與門水平相似，但是在綱水平中出現(xiàn)了更多的細(xì)分，變形菌門主要分為α-變形菌綱、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），厚壁菌門主要細(xì)分為梭菌綱和芽孢桿菌綱（Bacilli），擬桿菌門包括黃桿菌綱（Flavobacteriia）和鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）（圖5b）。

2.2.3.2 菌群屬水平分布

菊黃東方鲀冷藏過(guò)程中，在屬水平上的微生物菌群變化共有10 個(gè)主要的菌屬，分別為假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈霉菌屬（Streptophyta）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、苯基桿菌屬（P h e n y l o b a c t e r i u m）、鞘氨醇菌屬（Chitinophaga）、食酸菌屬（Acidovorax）（圖6）。

圖6 樣本微生物在屬水平上相對(duì)豐度分布Fig.6 Relative abundance of bacteria in samples at the genus level

隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)肉中主要菌屬由9 種增加至12 種，隨后逐漸遞減為假單胞菌屬、希瓦氏菌屬，作為水產(chǎn)品中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，經(jīng)常在腐敗過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[40]。在0 d，優(yōu)勢(shì)腐敗菌屬（相對(duì)豐度＞1%）有假單胞菌屬、鏈霉菌屬、希瓦氏菌屬、梭菌屬、鞘氨醇單胞菌和黃桿菌屬等，3 d增加了不動(dòng)桿菌屬、苯基桿鞘氨醇菌屬和食酸菌屬；6 d僅存在假單胞菌屬、鏈霉菌屬、希瓦氏菌屬和梭菌屬；9～15 d假單胞菌屬和希瓦氏菌屬占比分別超過(guò)86.40%和12.24%，成為最優(yōu)菌屬。

假單胞菌屬和希瓦氏菌屬都屬于革蘭氏陰性菌，具有很強(qiáng)的蛋白分解能力且能生存在低溫環(huán)境下，經(jīng)常在有氧冷藏的水產(chǎn)品貯藏末期中被檢出[41-42]。假單胞菌屬的腐敗機(jī)制主要是使水產(chǎn)品產(chǎn)生小分子醛酮及產(chǎn)生異味的揮發(fā)性代謝物。希瓦氏菌屬則是可以產(chǎn)生大量硫化物，并且黏附在水產(chǎn)品表面形成生物被膜，分解蛋白，進(jìn)一步引起腐敗變質(zhì)[43-47]。目前，已經(jīng)檢測(cè)到石斑魚(yú)、大黃魚(yú)、三文魚(yú)等在冷藏過(guò)程中產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)腐敗菌多為假單胞菌屬或希瓦氏菌屬[48-50]。

總體而言，在冷藏期間變化較大的菌屬主要有假單胞菌屬、鏈霉菌屬、希瓦氏菌屬，其中鏈霉菌屬僅在前6 d占比較大，而9 d后比例迅速下降直至消失；希瓦氏菌屬在6 d開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，在第9天達(dá)到最大比例，隨后逐漸減少；假單胞菌屬冷藏初期的比例較低，在后期占據(jù)比例超過(guò)86.40%，成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。綜上表明，菊黃東方鲀?cè)? ℃冷藏過(guò)程中存在著復(fù)雜的菌群變化，且隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，腐敗微生物種類更趨于集中單一化，在冷藏末期分離純化得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌屬和希瓦氏菌屬。

2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離、鑒定

從冷藏菊黃東方鲀末期共篩選出10 株菌，分別命名為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9、J10，其菌落形態(tài)大多表現(xiàn)為光滑、邊緣整齊、隆起、易挑起，但是菌落大小不一，顏色有白色和淡黃色的區(qū)別。以1.70%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落純度，如圖7所示，各菌株均出現(xiàn)了單一條帶，顯示PCR擴(kuò)增較成功，可以用于后期測(cè)序。

圖7 高通量測(cè)序法下V3～V4可變區(qū)DNA電泳圖Fig.7 Electropherogram of PCR-amplified V3–V4 variable region

所得序列進(jìn)行BLAST分析，選取同源性超過(guò)99%的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。圖8所示即為最高相似度菌種名稱及其登錄號(hào)，10 株菌株分別是波羅的海希瓦氏菌（S.baltica）、哈夫尼希瓦氏菌（S.hafniensis）、希瓦氏菌屬（S h e w a n e l l as p.）、液化沙雷氏菌（S.liquefaciens）、維氏氣單胞菌（A.veronii）、P.extremorientalis、產(chǎn)氮假單胞菌（P.azotoformans）、熒光假單胞菌（P.f l u o re s c e n s）、杰氏假單胞菌（P.jessenii）、隆德假單胞菌（P.lundensis）。其中希瓦氏菌和假單胞菌的比例比較高，符合菌相變化規(guī)律。

圖8 基于16S rDNA序列的同源性菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA sequences

2.4 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐能力

不同腐敗菌的致腐能力不同，通過(guò)產(chǎn)量因子可以定量表示各種腐敗菌的致腐能力大小，產(chǎn)量因子數(shù)值越大，則腐敗能力越強(qiáng)。如表2所示，熒光假單胞菌和產(chǎn)氮假單胞菌的產(chǎn)量因子分別為1.05×10-9、3.05×10-10mg/CFU，明顯高于希瓦氏菌屬，致腐能力更強(qiáng)。菊黃東方鲀冷藏期間產(chǎn)生的腐敗菌的致腐能力由高到低依次為熒光假單胞菌、產(chǎn)氮假單胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、波羅的海希瓦氏菌。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與倪榮[51]和于淑池[52]等的研究結(jié)果相似。

表2 不同腐敗菌腐敗能力的分析Table 2 Spoilage capacity of different spoilage bacteria isolated from T. flavidus

3 結(jié) 論

根據(jù)0 ℃冷藏過(guò)程中菊黃東方鲀魚(yú)肉的TVC和TVB-N值測(cè)定結(jié)果，得出其冷藏終點(diǎn)為5 d。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)菊黃東方鲀冷藏期間魚(yú)肉的菌相變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)魚(yú)肉在冷藏初期菌群多樣性指數(shù)高，而冷藏末期菌屬較為單一，假單胞菌屬和希瓦氏菌屬占比較大，故將其判定為菊黃東方鲀冷藏期間的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，其中假單胞菌屬比例遠(yuǎn)高于希瓦氏菌屬，是導(dǎo)致魚(yú)體腐敗的主要腐敗菌。

通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)基法對(duì)菊黃東方鲀冷藏末期的腐敗菌進(jìn)行分離純化，共篩選出10 株菌株，經(jīng)16S rDNA測(cè)序技術(shù)鑒定為假單胞菌屬和希瓦氏菌屬，符合菌相變化規(guī)律，進(jìn)而驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，并對(duì)常見(jiàn)幾種菌進(jìn)行致腐能力分析，發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌的致腐能力最強(qiáng)，產(chǎn)氮假單胞菌次之，最弱的哈夫尼希瓦氏菌和波羅的海希瓦氏菌，二者致腐能力相當(dāng)。本研究旨在為靶向抑菌、延長(zhǎng)菊黃東方鲀的貨架期提供理論依據(jù)。