基于蛋白質(zhì)組學(xué)探究針刺改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用機(jī)制

王 迪,楊圓圓,王 鑫,趙 健,韓增鑫,周忠光

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150060;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150010;4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

學(xué)習(xí)記憶障礙是阿爾茨海默癥和輕度認(rèn)知功能障礙的前驅(qū)表現(xiàn),早期干預(yù)糾正能夠有效地預(yù)防或減緩相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。針刺作為中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)的治療手段在改善記憶方面具有一定的臨床療效。研究顯示,長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降,同時(shí)也會(huì)引起腸道菌群的變化[1]。腸道菌群紊亂會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子與激素等物質(zhì)發(fā)生改變,從而通過(guò)微生物-腸-腦軸作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶障礙,利用非標(biāo)(Label-free)蛋白質(zhì)組定量技術(shù)篩選差異蛋白,探究針刺改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用靶點(diǎn)及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取30只SPF級(jí)SD大鼠,月齡為10周齡,性別為雄性,體質(zhì)量為(290.83±10.21)g,大鼠由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶障礙模型制備。飼養(yǎng)條件為自然光照,溫度為(25±2)℃,濕度為(55±5)%,大鼠可自由進(jìn)食水。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》執(zhí)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

1.2.1 試劑 戊二醛固定液(2.5%)(北京雷根生物技術(shù)有限公司);蛋白酶抑制劑Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ與Ⅳ(Merck Millipore);胰蛋白酶(Promega);磷酸化酶抑制劑(Millipore);碘乙酰胺(Sigma-Aldrich);甲酸(Fluka);尿素(Sigma-Aldrich);二硫蘇糖醇(Sigma-Aldrich);乙腈(ThermoFisher Scientific);三氟乙酸(Sigma-Aldrich);BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù));2-D Quant試劑盒(GE Healthcare);丙酮(杭州漢諾化工);十二烷基硫酸鈉(Amresco)。

1.2.2 器材 云龍牌針灸針(0.16mm×7mm,云龍醫(yī)療器械有限公司);Morris水迷宮(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);透射電鏡(HITACHI,日本);質(zhì)譜儀(Q-Exactive);液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(R-Exactive Plus);EASY-nLC(Thermo)。

1.3 模型制備與分組

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前利用水迷宮將先天型癡呆(逃避潛伏時(shí)長(zhǎng)均值>50 s)和游泳姿勢(shì)不良的大鼠剔除。按照隨機(jī)數(shù)字表法將剩余實(shí)驗(yàn)用SD大鼠分為3組,即空白組、模型組與針刺組。模型組和針刺組大鼠在模型制備前進(jìn)行Y迷宮測(cè)試。之后采用高脂飲食的喂養(yǎng)方式進(jìn)行模型制備,模型制備時(shí)間為8周。制備模型結(jié)束后,利用Y迷宮對(duì)模型組和針刺組的大鼠進(jìn)行篩選,制備模型成功者納入實(shí)驗(yàn)。制備模型成功標(biāo)準(zhǔn):Y迷宮15次測(cè)試中,正確次數(shù)下降1/3者視為成功。最后每組隨機(jī)選出6只SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),最終共納入18只。實(shí)驗(yàn)干預(yù)期間3組大鼠繼續(xù)維持原喂養(yǎng)方式。高脂飲食飼料配方:63.5%基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.3%膽固醇+0.2%膽鹽。

1.4 干預(yù)方法

按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用穴位名稱與定位》選取“百會(huì)”穴。使用一次性無(wú)菌針灸針(0.16 mm×7 mm)于頂骨正中向后斜刺2 mm,平補(bǔ)平瀉手法快速捻轉(zhuǎn)1 min,留針1 h,針刺1次/d。空白組和模型組僅給予常規(guī)抓取。上述干預(yù)周期為3周。

1.5 樣本采集

各組大鼠Morris水迷宮完成后進(jìn)行樣本采集,采集前禁食12 h。麻醉方式為3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉。麻醉完成后采用左心室灌注的方式對(duì)組織進(jìn)行固定,待大鼠肝臟顏色變?yōu)樯n白,于冰上取腦,剝離出大鼠大腦左側(cè)海馬組織,于海馬CA1區(qū)取大小為1 mm3的組織固定于戊二醛(溶度為2.5%)中。同時(shí)每組隨機(jī)選取3只大鼠,于直腸糞便較多處取黃豆粒大小的直腸組織,用預(yù)冷PBS緩沖液沖洗至潔凈,并于吸干水分后置于液氮中備用。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 Morris水迷宮 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮直徑為160 cm,高為45 cm。將隱藏平臺(tái)置于4個(gè)標(biāo)記象限中的1個(gè),將水溫為(24±1)℃的溫水注入池中,高于平臺(tái)2 cm。

①定位航行實(shí)驗(yàn):隨機(jī)選擇入水點(diǎn),讓大鼠背側(cè)入水,記錄逃避潛伏期(自入水到游上隱藏平臺(tái)所歷時(shí)長(zhǎng))。大鼠尋找并到達(dá)平臺(tái)后需停留10 s,若有中途入水者需將其置于平臺(tái)重新計(jì)時(shí)。超過(guò)60 s未到達(dá)平臺(tái)者,需對(duì)其引導(dǎo),逃避潛伏時(shí)長(zhǎng)按60 s記錄,該實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)6 d。②空間探索實(shí)驗(yàn):空間探索實(shí)驗(yàn)于定位航行實(shí)驗(yàn)完成24 h后進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前撤除平臺(tái),隨機(jī)選擇相同位置將大鼠置于水中,記錄大鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù),該實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)1 d。

1.6.2 透射電鏡 各組大鼠海馬組織按下列步驟進(jìn)行操作。主要操作流程:鋨酸(濃度為1%)固定,乙醇-丙醇梯度脫水,純丙酮+包埋液包埋,固化,切片,3%醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色,透射電鏡觀察各組大鼠海馬組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6.3 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè) 各組大鼠腸組織蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)由景杰生物科技股份有限公司完成。主要操作流程:提取樣本蛋白,胰酶酶解,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析,數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,數(shù)據(jù)質(zhì)控,樣品重復(fù)性校驗(yàn)。篩選出組間差異蛋白,并從Gene Ontology分析、KEGG富集分析對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)比較

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間較空白組明顯延長(zhǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);針刺組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間較模型組明顯縮短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)較空白組明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);針刺組大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)較模型組明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果

2.2 透射電鏡結(jié)果

電鏡觀察各組大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu):空白組大鼠神經(jīng)元排列緊密且結(jié)構(gòu)完整,神經(jīng)細(xì)胞核、膜清晰可見(jiàn),線粒體散在分布,無(wú)腫脹、空泡,突觸輪廓完整。與空白組相比較,模型組神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性被破壞,核膜邊界不清,可見(jiàn)細(xì)胞核固縮,線粒體大小不一,可見(jiàn)腫脹、空泡,突觸數(shù)量明顯減少,界限不清。與模型組相比較,針刺組大鼠神經(jīng)元排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,偶見(jiàn)線粒體腫脹,突觸數(shù)量增多,界限清晰,輪廓完整。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)(1 500×)

2.3 各組大鼠腸組織差異蛋白表達(dá)及生物信息分析

利用非標(biāo)(Label-free)蛋白質(zhì)組定量技術(shù),按照Pvalue<0.05時(shí),差異表達(dá)量變化超過(guò)1.5作為顯著上調(diào)變化閾值,<1/1.5作為顯著下調(diào)變化閾值的標(biāo)準(zhǔn)篩選。結(jié)果表明,與空白組比較,模型組大鼠腸組織差異蛋白上調(diào)85個(gè),下調(diào)119個(gè);與模型組比較,針刺組大鼠腸組織差異蛋白上調(diào)123個(gè),下調(diào)172個(gè)。見(jiàn)圖2。

注:橙色為模型組顯著上調(diào)蛋白,綠色為模型組顯著下調(diào)蛋白,灰色為非顯著差異蛋白。圖2 各組大鼠腸道組織差異蛋白火山圖

2.3.1 各組大鼠腸組織差異蛋白GO注釋及富集分析 與空白組相比,在生物過(guò)程中(Biological process,BP),模型組大鼠腸組織的差異蛋白顯著富集于體液免疫調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)成熟調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)調(diào)控、線粒體基因表達(dá)、酰胺生物合成和核糖體產(chǎn)生等;在細(xì)胞組分(Cellular component,CC)上,顯著富集于線粒體大核糖體亞單位、細(xì)胞器大核糖體亞單位、自噬體、MHC蛋白復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)組成和線粒體核糖體等;在分子功能(Molecular function,MF)上,顯著富集于肽抗原結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、蛋白質(zhì)組氨酸磷酸酶活性、內(nèi)肽酶抑制劑活性、肽酶抑制劑活性和偽尿苷合酶活性等。見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠腸組織差異蛋白GO分析(模型組與空白組比較)

與模型組相比,在生物過(guò)程中(Biological process,BP),針刺組差異蛋白顯著富集于核糖體產(chǎn)生、含嘌呤化合物生物合成、核酸磷酸二酯鍵水解、糖代謝、膜蛋白水解、過(guò)氧化氫代謝、磷酸醛醇代謝與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等;在細(xì)胞組分(Cellular component,CC)上,顯著富集于DNA聚合酶復(fù)合物、前剪接體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)組成等;在分子功能(Molecular function,MF)上,顯著富集于金屬肽酶活性、DNA-定向DNA聚合酶活性、3′-5′-外脫氧核糖核酸酶活性、裂合酶活性、分子內(nèi)氧化還原酶活性與肽酶活性。見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠腸組織差異蛋白GO分析(針刺組與模型組比較)

2.3.2 各組大鼠腸組織差異蛋白KEGG注釋及富集分析 與空白組比較,模型組大鼠腸組織的差異蛋白涉及的信號(hào)通路主要為補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、Ⅰ型糖尿病、煙酸鹽、煙酰胺代謝、皮質(zhì)醇的合成和分泌等。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠腸組織差異蛋白KEGG分析(模型組與空白組比較)

與模型組相比較,針刺組差異蛋白涉及的信號(hào)通路主要為百日咳、果糖和甘露糖代謝、抗葉酸抗性和toll樣受體信號(hào)通路。見(jiàn)圖6。

圖6 各組大鼠腸組織差異蛋白KEGG分析(針刺組與模型組比較)

2.3.3 各組大鼠腸組織顯著差異蛋白篩選 3組大鼠腸組織共同表達(dá)的顯著性差異蛋白數(shù)量為41個(gè),其中模型組較空白組顯著性上調(diào),而針刺干預(yù)治療后顯著下調(diào)的差異蛋白數(shù)量為22個(gè);模型組較空白組顯著性下調(diào),而針刺干預(yù)治療后顯著上調(diào)的差異蛋白數(shù)量為19個(gè)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腸組織表達(dá)差異倍數(shù)較大的蛋白

3 討論

學(xué)習(xí)記憶障礙可歸屬于中醫(yī)“癡呆”范疇。《醫(yī)林改錯(cuò)》腦髓說(shuō)中曾云:“靈機(jī)記性不在心在腦……”,李時(shí)珍曰:“腦為元神之府?！苯鹫Ｔ?“人之記性皆在腦中”[2],因此改善學(xué)習(xí)記憶能力需治腦?！鞍贂?huì)”穴善治腦府疾病,古人云灸百會(huì)可強(qiáng)記性。本研究Morris水迷宮結(jié)果也顯示,經(jīng)過(guò)3周針刺“百會(huì)”穴干預(yù)后,與模型組相比較,針刺組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高。從電鏡結(jié)果觀察也發(fā)現(xiàn),針刺能夠明顯改善學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠海馬組織內(nèi)環(huán)境,維護(hù)海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性,減輕線粒體腫脹,促使突觸數(shù)量增多。

微生物-腸-腦軸是腦和腸道之間的通訊系統(tǒng),通過(guò)神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路、免疫應(yīng)答和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸等途徑發(fā)揮作用。腸道菌群異常會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子與激素等物質(zhì)發(fā)生改變,從而通過(guò)微生物-腸-腦軸作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展。研究顯示[3],存在學(xué)習(xí)記憶障礙的大鼠,其腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,而針刺能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),促進(jìn)產(chǎn)生短鏈脂肪酸及抑制炎癥的菌群生長(zhǎng)。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)方法,觀察學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠腸道菌群紊亂后腸道組織相關(guān)蛋白的改變,并觀察針刺干預(yù)對(duì)其產(chǎn)生的影響,從而探究針刺“百會(huì)”穴增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制。GO分析和KEGG分析結(jié)果顯示,高脂飲食誘導(dǎo)、針刺刺激可通過(guò)多個(gè)信號(hào)途徑影響學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠的病理和生理過(guò)程,如體液免疫調(diào)節(jié)、糖代謝、過(guò)氧化氫代謝、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、煙酸鹽和煙酰胺代謝、皮質(zhì)醇的合成和分泌和toll樣受體信號(hào)通路等。

從表2中可以看出,熱休克蛋白90伴侶蛋白Cdc37(Hsp90 chaperone protein kinase-targeting su-bunit,Cdc37)、RT1-A2(RT1 class I,A2)、纖維調(diào)節(jié)蛋白(Fibromodulin,Fmod)和己糖激酶2(Hexokinase-2,HK2)蛋白的表達(dá)水平,不僅在空白組與模型組之間呈現(xiàn)出顯著差異,同時(shí)在針刺組與模型組之間也具有顯著差異,并且針刺組與空白組的表達(dá)趨勢(shì)一致。上述結(jié)果表明這類蛋白表達(dá)水平的改變可能在針刺改善學(xué)習(xí)記憶能力中發(fā)揮作用。

Cdc37是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,是熱休克蛋白90的伴侶蛋白。許多受Cdc37調(diào)節(jié)的激酶與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病相關(guān)。有研究報(bào)道,Cdc37可以調(diào)節(jié)阿爾茲海默癥(AD)發(fā)病機(jī)制的幾種途徑,包括β-淀粉樣蛋白(Aβ)和微管相關(guān)蛋白(Tau)。研究報(bào)道指出,激酶與Aβ的產(chǎn)生或穩(wěn)定性相關(guān),而這些激酶很多已經(jīng)被證實(shí)受Cdc37的調(diào)控。另外,Cdc37與熱休克蛋白90協(xié)同作用對(duì)穩(wěn)定Tau蛋白發(fā)生了重要作用,降低Cdc37的表達(dá)水平能夠有效地清除Tau蛋白[4]。本研究結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠Cdc37的表達(dá)水平相對(duì)于空白組上調(diào),而針刺干預(yù)治療后表達(dá)下調(diào),說(shuō)明針刺能夠通過(guò)調(diào)節(jié)與AD發(fā)病機(jī)制相關(guān)的蛋白從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。RT1-A2是主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)類中的相關(guān)分子,與機(jī)體免疫應(yīng)答相關(guān)。基于神經(jīng)免疫信號(hào)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),年齡增加引起的海馬體衰老會(huì)導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力下降,而突觸體中MHCⅠ的相關(guān)蛋白,如RT1-A2的表達(dá)水平升高[5]。本研究結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠RT1-A2的表達(dá)水平相對(duì)于空白組上調(diào),而針刺干預(yù)治療后表達(dá)下調(diào),說(shuō)明針刺能夠通過(guò)抑制RT1-A2蛋白的上調(diào)從而延緩海馬體衰老,改善由海馬功能障礙導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降。Fmod作為多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的配體,具有促血管生成、抗炎和抗纖維化特性[6]。研究表明,Fmod能夠通過(guò)抑制NF-kB的活性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,而Fmod被抑制會(huì)促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加[7]。研究者利用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠,發(fā)現(xiàn)其學(xué)習(xí)、記憶能力明顯減退,該研究認(rèn)為大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙是由于NF-κB信號(hào)通路被激活從而導(dǎo)致海馬細(xì)胞凋亡引起的[8]。本研究結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠Fmod的表達(dá)水平相對(duì)于空白組下調(diào),而針刺干預(yù)治療后表達(dá)上調(diào),說(shuō)明針刺能夠通過(guò)增加Fmod的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡,從而改善學(xué)習(xí)記憶能力,而實(shí)現(xiàn)該作用的信號(hào)途徑可能是NF-κB信號(hào)通路,但此推論有待下一步的探究。HK2是一種與糖酵解相關(guān)的限速酶,在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解及線粒體功能方面發(fā)揮著重要作用。研究顯示[9],HK2敲除會(huì)導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生大量的活性氧,導(dǎo)致線粒體功能障礙,促使炎性反應(yīng)發(fā)生。糖代謝異常與AD發(fā)病相關(guān)[10-12],而氧化應(yīng)激亦是被廣泛認(rèn)可的AD發(fā)病和進(jìn)展的重要因素之一,二者均能引起線粒體功能障礙,由此可推斷HK2可能參與了AD的形成。本研究結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠HK2的表達(dá)水平相對(duì)于空白組下調(diào),而針刺干預(yù)治療后表達(dá)上調(diào),說(shuō)明針刺能夠通過(guò)增加HK2的表達(dá)調(diào)節(jié)糖代謝,維持線粒體功能的穩(wěn)定,從而改善認(rèn)知功能。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)到的部分差異蛋白并沒(méi)有檢索到與學(xué)習(xí)記憶或認(rèn)知能力相關(guān)的研究文獻(xiàn),值得后續(xù)進(jìn)一步探究。綜上,學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生涉及多個(gè)生物過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后可使大部分差異表達(dá)蛋白的表達(dá)量趨于空白組,說(shuō)明針刺能夠通過(guò)調(diào)控與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的蛋白改善學(xué)習(xí)記憶能力。