焦亡相關(guān)標(biāo)志物及PI3K /AKT 通路在內(nèi)異癥中的表達及相關(guān)性研究

萇雨環(huán)，呂麗麗，李 曼，王夢格，張銘娟，葉國柳

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 蚌埠 233004）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS）是一種多因素婦科疾病，其特征在于子宮腔外子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)的生長，影響近10%～15%的育齡婦女，在不孕癥患者中，發(fā)病率約為40%～50%［1］。它是一種雌激素依賴性疾病，與慢性炎癥過程、慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕密切相關(guān)，極大地降低了育齡女性的生活質(zhì)量［2］。子宮內(nèi)膜異位癥與惡性腫瘤有很多相似之處，特別是它們的侵入性以及有著觸發(fā)其他組織重塑，血管形成和神經(jīng)支配的能力［3］。炎癥是子宮內(nèi)膜異位癥的重要病理生理機制［4］，有研究報道炎癥反應(yīng)可通過促進炎性因子的釋放從而增加異位子宮內(nèi)膜細胞的黏附與增殖特性［5］。因此深入探究該疾病炎癥方面的發(fā)病機制和治療靶點具有重要的臨床意義。

細胞焦亡（Pyroptosis）是一種伴隨炎癥反應(yīng)的細胞程序性死亡［6］，是近年來炎癥研究方面的焦點。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 信號通路在細胞焦亡發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且細胞焦亡在不同的炎癥性疾病中扮演著不同的角色［7，8］?；谏鲜鲅芯勘尘?，本實驗將探討細胞焦亡相關(guān)因子GSDMD，Caspase-1，NLRP3，IL-1β，IL-18 及PI3K/AKT 信號通路在炎癥性疾病子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及其相關(guān)性，從而進一步探究子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制，并為臨床治療提供具體靶點和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

選取2022 年1 月～2023 年1 月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科行子宮內(nèi)膜異位癥卵巢囊腫剝除術(shù)患者的異位囊腫組織50 例為子宮內(nèi)膜異位癥組。另選取同期在該院行宮腔鏡手術(shù)患者的正常內(nèi)膜組織55 例作為對照組，且術(shù)中排除子宮內(nèi)膜異位癥患者。病例組年齡20～41 歲，平均年齡（37.6 ±5.7）歲，對照組年齡21～43 歲，平均年齡（38.3 ±7.8）歲。兩組研究對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）3 個月內(nèi)未給予性激素藥物治療；（2）術(shù)中取得標(biāo)本組織均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；（3）標(biāo)本的收集均經(jīng)患者及家屬同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心、肝、腎等嚴(yán)重功能障礙者及患有其他嚴(yán)重婦科疾病者；（2）患惡性腫瘤，精神疾病者；（3）患免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者。術(shù)中所取所有組織標(biāo)本均儲存于-80 ℃冰箱以備研究使用。本研究符合人體實驗倫理標(biāo)準(zhǔn)并已通過蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院機構(gòu)倫理委員會審批。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA 提取及實時定量PCR 用TRIzol（天根，中國）試劑提取卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組織及對照組正常內(nèi)膜組織的總RNA，經(jīng)無核酸酶水洗之后，用Nanodrop ND-1000 分光光度計檢測其純度和濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR 試劑盒（近岸，中國）說明書合成cDNA 模板，并進行熒光定量PCR 擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱1 min，95 ℃變性20 s 和60 ℃延伸1 min。所有樣品設(shè)置3 個副孔，使用2-△△CT法計算焦亡相 關(guān)因子，PI3K/AKT 信號通路在兩組研究對象中mRNA 表達的相對水平。焦亡相關(guān)因子及PI3K/AKT 通路的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物系列Tab 1 Primer series for qRT-PCR

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法 配制RIPA 裂解緩沖液（碧云天），將50 mg 卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫組織或正常子宮內(nèi)膜組織裝進500 μL RIPA 裂解液的勻漿管中，進行勻漿處理，4 ℃，12 000 ×g，離心20 min。將等量的變性蛋白通過SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h。隨即將PVDF 膜與一抗（多克隆抗-GSDMD；Caspase-1；NLRP3，1∶1 000 稀釋）在4 ℃冰箱中孵育過夜。用TBST 洗滌3 遍，再將膜與二抗（1∶1 000 稀釋）放至室溫2 h。再次洗滌三遍，根據(jù)BeyoECL 試劑盒（碧云天）說明書進行曝光顯影，最后結(jié)果用image J 軟件量化處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)處理，Graphpad Prism 9 軟件繪圖。用非配對t檢驗分析了細胞焦亡相關(guān)因子與PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常子宮內(nèi)膜中的表達差異，并用Pearson 檢驗方法分析兩者在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中相關(guān)性，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 焦亡相關(guān)因子及PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中mRNA 水平顯著升高

采用RT-qPCR 方法比較焦亡因子GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 及信號通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜中的表達。結(jié)果顯示，焦亡相關(guān)因子與信號通路PI3K/AKT 的表達在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中顯著升高（P＜0.05）。見圖1、2。

圖1 焦亡相關(guān)因子在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜中的mRNA 表達Fig 1 mRNA expression of pyroptosis-related factors in ectopic cysts of ovarian endometriosis versus normal endometrium

圖2 信號通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中與正常內(nèi)膜中的mRNA 表達Fig 2 mRNA expression of the signaling pathway PI3K/AKT in ovarian endometriosis versus normal endometrium

2.2 焦亡相關(guān)因子及PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中蛋白水平明顯升高

同時提取卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜的蛋白，在Western Blot 實驗中驗證焦亡相關(guān)因子與PI3K/AKT 信號通路在兩組中的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，焦亡相關(guān)因子及信號通路的蛋白表達水平在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中明顯升高（P＜0.05）。見圖3、4。

圖3 焦亡相關(guān)因子在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜中蛋白水平的表達Fig 3 Expression of pyroptosis-related factors at the protein level in ovarian endometriosis ectopic cysts versus normal endometrium

圖4 信號通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位囊腫與正常內(nèi)膜中蛋白水平的表達Fig 4 Expression of the signaling pathway PI3K/AKT at the protein level in ectopic cysts of ovarian endometriosis compared with normal endometrium

2.3 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中焦亡相關(guān)因子與PI3K/AKT 的表達呈正相關(guān)

采用Pearson 相關(guān)性檢驗分析卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中焦亡相關(guān)因子和PI3K/AKT 信號通路mRNA 表達量的相關(guān)性。結(jié)果顯示焦亡相關(guān)因子與PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中的表達水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 卵巢子宮內(nèi)膜異位癥細胞焦亡相關(guān)因子與信號通路PI3K/AKT 表達水平的相關(guān)性Tab 2 Correlation between pyroptosis-related factors and expression levels of signaling pathway PI3K/AKT in ovarian endometriosis cells

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）是一種常見的慢性炎癥性疾病，又被稱為“不死癌癥”。其復(fù)雜的癥狀給育齡女性的生理及心理均帶來了極大的痛苦。然而到目前為止，還沒有一種較完美的方法可以治療EMS?，F(xiàn)已推出的治療方法包括：（1）藥物療法；（2）保留子宮和卵巢的保守手術(shù)干預(yù)或切除子宮和卵巢的根治性手術(shù)干預(yù)；（3）期待療法［9］。但有研究表明無論方法如何，均有約50%的患者在5 年反復(fù)出現(xiàn)癥狀［1］。藥物只能用于治療已經(jīng)有癥狀的患者，而手術(shù)不僅會影響卵巢卵泡的儲備功能，且復(fù)發(fā)率也高達50%［10］。目前對該疾病形成的因素，最合理的解釋是月經(jīng)逆行假說，指含有可存活的細胞的子宮內(nèi)膜異位癥碎片經(jīng)輸卵管回流至骨盆，植入腹膜和腹部器官，并產(chǎn)生持續(xù)的炎癥與粘連。雖然此理論是被接受的，但無法解釋為什么90%的女性會出現(xiàn)月經(jīng)逆行，但只有10% 的女性會發(fā)展為EMS［11］。因此解決子宮內(nèi)膜異位癥這一難題，需以生理病理為基礎(chǔ)，充分了解子宮內(nèi)膜異位癥的潛在分子發(fā)病機制，尋找新的治療靶點。

細胞焦亡是一種伴有炎癥因子產(chǎn)生和釋放的不同于細胞凋亡的一種特殊程序化細胞死亡，是近年來研究熱點。細胞焦亡信號通路包含依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cystein-containing aspartat-specific protease-1，Caspase-1）的經(jīng)典途徑和依賴Caspase-4/5/11 的非經(jīng)典途徑［12］。在經(jīng)典途徑中NOD 樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）與接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和效應(yīng)蛋白Caspase-1（pro-Caspase-1）相互作用產(chǎn)生NLRP3 炎癥小體，在此過程中前體Caspase-1 被激活，活化的Caspase-1 不僅促進白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 前體成熟激發(fā)炎癥反應(yīng)，還切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）使其暴露具有打孔活性的N 端結(jié)構(gòu)（GSDMD-N），GSDMD-N 在細胞膜上形成孔道，并釋放大量的IL-1β，IL-18 等炎癥物質(zhì)引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)［13］。有研究報道，細胞焦亡的發(fā)生與經(jīng)典PI3K/AKT 信號通路有關(guān)，且在不同的疾病中細胞焦亡與PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮的作用不同［14，15］。最新一項研究表明，麥芽酚通過抑制PI3K/AKT 信號通路來阻斷NLRP3 炎癥小體形成，最終導(dǎo)致IL-1β，IL-18 等炎性因子減少從而達到抑制細胞焦亡來減輕椎間盤內(nèi)炎癥的作用［14］。而另一項研究指出在BV2 小膠質(zhì)細胞中紫杉葉素可以上調(diào)PI3K/AKT 信號通路來抑制細胞焦亡從而減輕脊髓損傷后的神經(jīng)炎癥［8］。因此驗證以炎癥性疾病為特征的子宮內(nèi)膜異位癥中細胞焦亡與PI3K/AKT 信號通路的作用。

近期研究顯示E3 泛素連接酶TRIM24 可負調(diào)控NLRP3/Caspase-1/IL-1β 介導(dǎo)的異位人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞焦亡和遷移［16］。同時，Xu 等［17］的研究表明在原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中，沉默長非編碼轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（lnc-MALAT1）可改善NLRP3介導(dǎo)的焦亡和IL-1β 釋放，從而緩解TGF-β1 介導(dǎo)的纖維化。一致地，本研究檢測到焦亡相關(guān)因子GSDMD、Caspase-1、NLRP3、炎性因子IL-1β、IL-18 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥囊腫組織中的表達均高于在正常子宮內(nèi)膜中的表達，因此可以證實細胞焦亡這一炎癥反應(yīng)參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展。在檢測焦亡相關(guān)因子的同時還檢測信號通路PI3K/AKT 的表達，實驗結(jié)果顯示PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥囊腫組織中同樣較正常內(nèi)膜組織高表達。PI3K/AKT 信號通路參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展早在之前的研究中被證實［18，19］。Takeuchi 等［20］近年來發(fā)現(xiàn)原始卵泡的過度激活會引起子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的卵巢儲備減少，并且這種激活是由PI3K-PTEN-AKT-Foxo3 途徑介導(dǎo)的。但至今還沒有研究關(guān)注細胞焦亡與PI3K/AKT 信號通路在子宮內(nèi)膜異位癥中的關(guān)系。本研究采用Pearson 檢驗分析，得出結(jié)論卵巢子宮內(nèi)膜異位癥囊腫組織中的焦亡相關(guān)因子mRNA 的表達水平分別與信號通路PI3K、AKT mRNA 表達水平呈正相關(guān)。在前人研究基礎(chǔ)上，結(jié)合本次研究推測細胞焦亡調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥是通過激活PI3K/AKT 信號通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究首次在子宮內(nèi)膜異位癥中將細胞焦亡與PI3K/AKT 信號通路聯(lián)系起來，有望進一步揭示子宮內(nèi)膜異位癥的分子機制并為其提供新的治療靶點。本研究主要局限于組織學(xué)層面，因此驗證還不夠充分，后續(xù)還將從動物，細胞實驗多維度探索細胞焦亡經(jīng)典/非經(jīng)典途徑與PI3K/AKT信號通路在子宮內(nèi)膜異位癥中的具體調(diào)控機制。

作者貢獻度說明：

萇雨環(huán)：課題的構(gòu)思與實驗，撰寫文章；呂麗麗、李曼、王夢格、張銘娟：實驗數(shù)據(jù)整理，分析；葉國柳：論文指導(dǎo)與修改，經(jīng)費支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。